ونحن ممتنون لورا بامبتون، أليكس ديفيدسون، ريتشارد بارتون، Arita أتشاريا للحصول على المساعدة أثناء إعداد هذه المخطوطة. ماريانا Wolfner لمناقشة تفعيل البيض. مات ايلاندز لدعم التصوير. ونان هو جين تاو عن الدعم العام في المختبر. وأيد هذا العمل من قبل جامعة كامبريدج، للرماية لTTW [منحة رقم 097814].

ملاحظة: القيام بجميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. 1. الاستعداد للتشريح ملاحظة: الخطوات المذكورة هنا هي وفقا للE. Gavis، جامعة برينستون وويل آخرون. آل 18. نفذ الخطوات التالية قبل يومين من التصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ قنينة الطيران التي تحتوي على ما يقرب من 10 مل من المواد الغذائية الصلبة وإضافة كمية صغيرة من الخميرة المجففة إلى زاوية واحدة، وأقل من 1 غرام كافية. ملاحظة: للحصول على معلومات حول قارورة ذبابة أو الطعام انظر &quot;الصيانة ذبابة الفاكهة&quot; 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-3 قطرات من الماء لترطيب الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين قارورة جانبا في زاوية 45 درجة والسماح 3-5 دقيقة لخميرة لتناول الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الخميرة يمتص الماء، حدد زجاجة من الذباب معربا عن UASt- MYR GCaMP5 20 يقودها حوض-VP16GAL4 (المشار إليها باسم GCaMP5) التي ظهرت في الآونة الأخيرة (أ myristoyوقد تم اختيار النموذج ذا الصلة من GCaMP5 لتوفير إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء من خلال الربط في GECI إلى الغشاء في البيضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذباب في زجاجة مع غاز ثاني أكسيد الكربون 2. تأكد للحفاظ على زجاجة المقلوب حتى لا تفقد الذباب في الغذاء الرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلميح الذباب تخدير على وسادة CO 2 ونوع 10-15 إناث و 5 ذكور باستخدام الفرشاة تحت المجهر تشريح. ملاحظة: من هو المعيار ليشمل الذكور إلى الإناث توفير صحية للتشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما القارورة من الخطوة 1.3 جاهزة، إضافة الذباب المحدد إلى القارورة. احرص على إبقاء الأفقي قارورة حتى تصبح الذباب النشطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع القارورة عند 25 درجة مئوية لمدة حوالي 36 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة الذباب المتبقية من لوحة CO 2 إلى زجاجة أو تجاهل. </li></ol> 2. تشريح ذبابة الفاكهة المبايض ملاحظة: الخطوات المذكورة هنا هي وفقا للويل وآخرون. الله. <sتصل&gt; 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 36 ساعة، تخدير الذباب من القنينة yeasted مع CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تخدير الذباب داخل القارورة نصيحة لهم على لوحة CO 2 يمكن فرزها مع فرشاة الطلاء تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الإناث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل اثنين من المبيضين من الإناث. لبروتوكول مفصلة الكامل نرى ويل آخرون. آل 18. باختصار: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون المؤكسج (سلسلة 95) على رقم 1.5، 22 × 40 مم ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الأنثى مع ملقط في الجزء الأمامي من البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الأنثى تحت المجهر تشريح، استخدم مجموعة ثانية من ملقط لإزالة بلطف الخلفي من الإناث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمحو النسيج الخلفي من ملقط الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضغط على تجويف البطن مع ملقط الثانية من الجزء الأمامي إلى الخلفي من البطن. يجب المبايض مبهمة اثنين التمسك ملقط عند الخروج من الاناثجنيه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمس المبيضين في الزيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي نوع من الأنسجة من ملقط من قبل محو ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه الخطوات (2.4.1 - 2.4.7) للحصول على ثلاثة coverslips، كل المبايض تحتوي على من ذبابة واحدة. </li></ol></li></ol> 3. عزل الأفراد الناضجة البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح القياسية مع التكبير المقرر أن 4X، على ساترة الأولى من الخطوة 2.4، فصل اثنين من المبيضين عن طريق تمزيق قناة البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض زوج من ملقط مغلقة في وسط المبيض واحد، مع الحرص على عدم ثقب أي غرف البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج التحقيق تشريح القياسية في وسط المبيض بجانب ملقط مغلقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب بلطف التحقيق تشريح عن طريق المبيض نحو القطب الخلفي، حيث توجد البيض نضجا (المرحلة 14 غرف البيض). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،4 2-5 مرات اعتمادا على حجم المبيض وعدد من البيض. ملاحظة: إضافة CO 2 </فرعية&gt; عادة ما يسبب ترسب بويضة واحدة والتي سوف تظهر أكبر مع الزوائد ظهري أثار من البيض أودعت مسبقا. يجب التخلص من هذه البويضة للتصوير لأنه قد تم تفعيلها داخل الأنثى. ملاحظة: من المحتمل أن تفصل بسهولة من النسيج الضام المبيض البيض الناضجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يكن هناك البيض نضجا مرئية خارج المبيض، ومواصلة بلطف إغاظة مع لجنة التحقيق تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة البيض نضجا واضحة على ساترة خارج المبيض، والمناورة 3-5 في خط في وسط ساترة. ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، قم بتشغيل التحقيق بلطف على طول الجانب من البيض. ملاحظة: تجنب سحب على الزوائد الظهرية وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف البيض. ملاحظة: اعتمادا على التصوير في المستقبل انشاء، محاذاة البيض حوالي 200 ميكرون وبصرف النظر عمودي على ساترة لمنطقة التصوير القصوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الانحياز، وإزالة ما تبقى من أنسجة المبيض عن طريق سحبه بعيدا عن البيض الانحياز استخدام وorceps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزيت الزائد بواسطة اللمس مع زاوية مسح لفحص طبي. يجب الحرص على عدم لمس البيض ناضجة مع الطبية مسح البيض الناضجة التي يتم الاتصال بها سوف تضيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم التقاطع على ساترة مع علامة لتبسيط تحديد العينة تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين ساترة في مكان آمن وترك الدوائر البيض مستعدة على ساترة للراحة لمدة 5-10 دقائق. وهذا يسمح للبيضة ليستقر في مجال النفط. عينات يمكن استخدام ما يصل إلى 1 ساعة بعد تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،11 لبقية لل coverslips مع المبايض عليها. </li></ol> 4. إعداد للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب عازلة تفعيل استعداد 15 إلى درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: عازلة التنشيط هو العازلة منخفض التوتر: 3.3 ملي ناه 2 ص 4، 16.6 ملي KH 2 PO 4، 10 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي بوكل، 5٪ البولي ايثيلين جلايكول 8000، 2 مم CaCl 2، جلبت لدرجة الحموضة 6.4 مع 1: 5 نسبة هيدروكسيد الصوديوم: KOH.لمزيد من المعلومات راجع Mahowald، 1983 15. أجزاء مأخوذة من العازلة التنشيط يمكن تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة أشهر، وعند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية نقل coverslips مستعدة العازلة التنشيط والماصات الزجاجية إلى مرفق التصوير. ملاحظة: A-حقل واسع، متحد، القرص الغزل أو ضوء المجهر ورقة يمكن استخدامها. نحن نوصي باستخدام مجهر مقلوب. وقد تم الحصول على نتائجنا تمثيلية باستخدام مجهر متحد البؤر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي اختيار هدف مناسب لتصوير البويضة الناضجة بأكمله (هنا: 20X 0.7 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب أول ساترة المعدة إلى المرحلة المجهر. الحرص على عدم كسر لل coverslips على المسرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوعيا تحديد مجال الرؤية مع غرفة بيضة ناضجة من أجل التنشيط. لا صورة ثقب غرف البيض أو تلك مع blebbing في الغشاء. ملاحظة: للحصول على خطوات 4،6-4،7، وأوامر البرنامج تختلف تبعا المجهر والشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الفقرة التصويرمتر عن الإثارة القياسية GFP (488 نانومتر) والانبعاثات (500-580 نانومتر). كذلك وضعت وجهة نظر مشرق الميدان من أجل رؤية وتوجيه البويضة الناضجة والنفط النازحين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار أقل Z-الطائرة حيث البيض نضجا واضحة ووضع كامل Z-كومة الواجب اتخاذها لمدة 40 ميكرون في ما يقرب من 2 ميكرون لكل خطوة. تعيين المعلمات حتى لا يكون هناك أي تأخير بين اكتساب Z-المكدس. تعيين سلسلة من الوقت لالتقاط ما يقرب من 30 دقيقة. </li></ol> تفعيل 5. التصوير فيفو السابقين البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التقاط الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 1-2 كامل Z-المداخن التي سيتم اكتسابها. وهذا يدل على البويضة الناضجة قبل التنشيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب ما يقرب من 300 ميكرولتر من العازلة التنشيط إلى ماصة الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المواقع غيض من ماصة زجاجية تحتوي عازلة تفعيل بزاوية 45 درجة فوق ساترة، تتحرك ببطء ماصة في مسار الشعاع حتى يتم مباشرة فوق البويضة الناضجة التي يجري تصويرها. ماصة الزجاج ينبغييكون 1-2 سم فوق الزيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-2 قطرات من العازلة التنشيط في أقل من 5 ثوان من ماصة الزجاج. وهذا ينبغي أن تحل محل النفط. تجنب إضافة عازلة تفعيل الزائد أو لمس البيض مع ماصة الزجاج لأنها يمكن أن تسبب تشريد البويضة الناضجة. والحرص على عدم لمس ساترة مع ماصة وهذا يمكن أن يؤدي إلى تغيير في الطائرة أو فقاعات الهواء التنسيق لتشكيل في مجال النفط الغمر بين الهدف وساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين مضيفا عازلة تفعيل خلال الحصول على الصور، والتحقق من قناة مشرق الميدان للتأكد من أن النفط قد نزحوا من المنطقة العازلة التنشيط. ملاحظة: سوف تظهر هذه الجملة لأول مرة كما ظل بسبب ماصة كسر مسار الشعاع ولكن سوف يؤدي أيضا إلى ظهور قطرات النفط الصغيرة. يمكن أن تبقى بعض قطرات النفط المرتبطة البويضة الناضجة التي سوف تؤثر على النتائج التجريبية وجودة الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يتم النازحين النفط من إضافة الأولية من تكرار عازلة تفعيل الخطوات 5،4-50.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد النازحين النفط بنجاح، والسماح للسلاسل الزمنية لتشغيل حتى الانتهاء. ملاحظة: نظرا لتورم من البويضات في التنشيط، وبعض الدوائر البيض تتحرك بشكل كبير من المستوى البؤري أو مجال الرؤية على إضافة عازلة التنشيط. في هذا الوضع، والتوقف عن اقتناء وتركيب ساترة المقبلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال تسلسل الحصول على الصور، وحفظ البيانات. </li></ol> 6. بعد اكتساب معالجة الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مجموعة البيانات باستخدام فيجي (http://fiji.sc/Downloads#Fiji)، أو ما يعادلها برامج معالجة الصور، وحدد الملفات ذات الصلة لتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبناء الإسقاط من البيانات التي حصل عليها تحديد: صورة&gt; الأكوام&gt; Z المشروع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد بداية Z-شريحة ووقف Z-شريحة، وعادة الفرع بأكمله. اختر نوع الإسقاط، عادة لمجموعة &#39;كثافة ماكس &quot;. خانة علامة &#39;كل الأطر الزمنية &quot;لتطبيق الإعدادات المحددة إلى سلسلة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذاوقد تم تصوير أكثر من قناة واحدة الفلورسنت، استخدم أداة القنوات لتمكين التنقل بين الألوان، وجعل المركبة، أو جعل الرمادي صورة. صورة مختارة&gt; الألوان&gt; القنوات الأداة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضبط سطوع الصورة وعلى النقيض اختر صورة&gt; ضبط&gt; السطوع / التباين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصدير صورة واحدة، نقل المنزلق الزمني لإطار ذات الصلة، وحدد ملف&gt; حفظ باسم&gt; الحياة السياسية في فرنسا، أو أي شكل المفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار موقع وعنوان الملف الذي تم تصديره، ثم حفظ. سوف نلاحظ معدل الإطار من برامج التصوير تكون هناك حاجة لإعطاء الطابع الزمني على الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير سلسلة زمنية كفيلم حدد: ملف&gt; حفظ باسم&gt; AVI، ثم حدد معدل الإطار (~ 7 إطارات في الثانية الواحدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار موقع وعنوان الملف الذي تم تصديره، ثم حفظ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحفظ الملف المعدل في شكل فيجي، حدد ملف&gt; حفظ. </li></ol>

<ol>
	<li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals.">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+from+egg+to+embryo:+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation.">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li><li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka,+Oryzias+latipes.">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li><li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes.">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li><li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2.">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li><li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy.">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> New Techniques in Systems Neuroscience. , (2015).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate.">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li><li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila.">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li><li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs.">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li><li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes.">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner.">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Biology+1:+yeast,+Drosophila+and+C.+elegans.+Drosophila+Maintenance.">Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility.">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li><li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo.">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li><li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans.">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li><li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs.">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).</li><li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation.">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

أي تغيير في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ تركيز على البيض (البويضة) تفعيل عنصرا المحافظ في جميع الكائنات درس 1،2. هذا الحدث يبدأ مجموعة واسعة من العمليات معتمد على الكالسيوم 2+، بما في ذلك استئناف دورة الخلية وترجمة من mRNAs المخزنة. وكان نتيجة لهذا الشرط ل Ca 2+، تصور التغييرات عابرة في الخلايا تركيزات الكالسيوم 2+ من الفائدة الرئيسية. تاريخيا، تم اختيار الكائنات نموذج للدراسات على تفعيل البيض على أساس حجم ومدى توافر بيضها. وقد تم استخدام نهج التصور المختلفة لمتابعة وقياس التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التركيزات في هذه الأنظمة، بما في ذلك: aequorin photoprotein في الأسماك الميداكا 3؛ كاليفورنيا الأصباغ الفلورية الحساسة 2+ مثل FURA-2 في قنفذ البحر والهامستر 4،5. والكالسيوم الأخضر-1-ديكستران في القيطم 6. حولت توليد وتحسين مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) القدرة على تصور كا 2+ ديناميكية في الجسم الحي 7. يتم التعبير عن هذه التركيبات الوراثية في أنسجة معينة وتحد من الحاجة إلى الاستعدادات الأنسجة الغازية 8. GCaMPs هي بروتين فلوري (GFP) فئة المستندة الخضراء GECIs التي كانت فعالة جدا بسبب بهم عالية الكالسيوم 2+ تقارب، نسبة الإشارة إلى الضوضاء والقدرة على تخصيص 9-11. في وجود الكالسيوم 2+، مجمع GCaMP يخضع لسلسلة من التغييرات متعلق بتكوين، بدءا من الربط من الكالسيوم 2+ لكالمودولين، أن النتائج في زيادة كثافة الفلورسنت من عنصر GFP 9. وقد استخدمت GCaMPs نطاق واسع في الأبحاث على الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة لرؤية التغييرات في الكالسيوم داخل الخلايا 12. في تطبيق والأخيرةعلى التكنولوجيا GCaMP لتصور كا 2+ في البيض ذبابة الفاكهة الناضجة قد كشفت عن وجود واحدة عابرة الكالسيوم 2+ موجة في تنشيط البويضة 13،14. يمكن تصور موجة الكالسيوم 2+ في تضخم منخفض خلال الإباضة في الجسم الحي 13 أو في أعلى التكبير باستخدام المجراة سابقا تفعيل الفحص 13،14. في مقايسة خارج الجسم، يتم عزل البويضات الناضجة من المبيض الفردية وتفعيلها باستخدام محلول منخفض التوتر، ويشار إلى عازلة التنشيط، وهو ما ثبت لتلخيص أحداث في الجسم الحي تفعيل 15-17. هذا الاختبار خارج الحي تمكن من السهل عالية الدقة تصور كا 2+ موجة تحت ظروف تجريبية مختلفة بما في ذلك تعطيل الدوائية، التلاعب المادية والمسوخ الوراثية. توضح هذه المقالة إعداد البيض ذبابة الفاكهة الناضجة لالسابقين تنشيط الجسم الحي والعشرينالبريد المجهري لاحقة تستخدم لتصور موجة الكالسيوم 2+ باستخدام GCaMP. هذا النهج يمكن استخدامها لاختبار بدء والسيطرة على موجة الكالسيوم 2+ وتحقيق النتائج النهائية.

<table><tbody><tr><td>Dry active yeast</td><td>Fleischman&amp;rsquo;s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Mircotec Fibre optic</td><td>MF0-90</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Medical wipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marker pen</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; pad</td><td>&amp;nbsp;Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil, series 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Distributor in Europe:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Fisherbrand,</td><td>FB50251</td><td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&amp;nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

هنا لقد أثبتنا كيفية تحضير البيض ذبابة الفاكهة الناضجة لتفعيل خارج الحي. البيض تعبر عن GECI تمكين التصوير من الكالسيوم 2+ ديناميكية في تنشيط البويضة وبداية التطور الجنيني (الشكل 1). وتجدر الإشارة إلى أن الاعتماد على GCaMP المستخدمة، وتحديدا وجود مجموعة myristoyl، قد يكون لها نتائج اختلافات نوعية طفيفة 13 14. لقد أثبتنا أيضا دور للالأكتين وظيفية خلال تفعيل البيض من خلال إضافة المانع من بلمرة الأكتين، مثبط حركة الخلايا D، إلى المخزن المؤقت تفعيل (الشكل 2) 14. وحفظها ومتطلبات الهيكل الخلوي في تنشيط البويضة. في C. ايليجانس بعد الإخصاب، وإعادة تنظيم مكونات هيكل الخلية لإعداد الجنين خلية واحدة لدوري الدرجة الاولى غير متناظرة 21،22. في قنفذ البحر وانقطاع cytoskeleوقد تبين التل إعادة تنظيم التالية تفعيل تؤثر على دورة الخلية عن طريق منع مقلص تشكيل حلقة 23. يبقى دور الأكتين في التوسط موجة الكالسيوم 2+ وظيفة المصب لها في تفعيل البيض في ذبابة الفاكهة إلى أن توضح تماما. في ذبابة الفاكهة، وشارك في تصور كا 2+ موجة والأكتين الهيكل الخلوي يمكن تحقيقه باستخدام هذا خارج الحي تفعيل الفحص. سلسلة زمنية من قنوات متعددة يمكن الحصول عليها وديناميات الكالسيوم داخل الخلايا 2+ يمكن أن تتطابق مع التغييرات في المؤسسة الأكتين في البويضة (الشكل 3). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> الشكل 1: واحدة الكالسيوم 2+ موجة في سلسلة ذبابة الفاكهة البيض وقت التنشيط من خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 بعد لddition العازلة تفعيل (ه). ارتفاع الكالسيوم حشوية 2+ ينشأ في القطب الخلفي (B) ويكاثر (BF) مع سرعة متوسط ​​ما يقرب من 1.5 ميكرون / ثانية. وعادة ما لوحظ بدء موجة بعد 3 دقائق من إضافة العازلة التنشيط. بعد التنشيط، ومستويات الكالسيوم داخل الخلايا من البويضة الناضجة ترجع إلى ما قبل تفعيل مستويات (G، H). رؤية فيلم التكميلي 1 (مجموع الوقت 33 دقيقة). الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> الشكل 2: إضافة مثبط حركة الخلايا D لتنشيط العازلة يشوش كاليفورنيا2+ انتشار الموجات. السلاسل الزمنية من خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 التالية إضافة عازلة تفعيل تحتوي على 10 ميكروغرام / مل مثبط حركة الخلايا D التركيز النهائي (ه). في حين يتم بدء 2+ موجة الكالسيوم في القطب الخلفي (A)، وخطر ذلك ولا تصل الأمامي من البيضة (F) (السهام البيضاء للدلالة على جبهة الموجة). أبعد وقد لوحظت تغييرات الكالسيوم 2+ أكثر من 30 دقيقة). رؤية فيلم التكميلي 2 (مجموع الوقت 30 دقيقة). الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> الشكل (3): شارك في التصور أكتين والكالسيوم 2+ في Eتفعيل زز في سلسلة ذبابة الفاكهة. وقت خارج الحي تنضج ذبابة الفاكهة البيض معربا عن UASt- myrGCaMP5 (سماوي) وUASp -F-Tractin.tdTomato (أرجواني) بعد إضافة عازلة تفعيل (ه). و2+ موجة الكالسيوم يبادر من القطب الخلفي وتسترد كما في الشكل 1. يبدو أكتين أن تغيير مع مرور الوقت، السهام البيضاء (A مباراة H). ومن المقرر أن تنقل العينة أثناء التقاط الصور لعدم وجود الكالسيوم 2+ الكشف عن إشارة في وسط البويضة الناضجة. الحانات النطاق = 50 ميكرون. ماكس الإسقاط = 40 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

توضح هذه المقالة بروتوكول تكيف خارج الحي لتصور كا 2+ خلال تفعيل البيض في ذبابة الفاكهة.

التصوير الكالسيوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; في تنشيط البيض

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K Views.  University of Cambridge.  توضح هذه المقالة بروتوكول تكيف خارج الحي لتصور كا 2+ خلال تفعيل البيض في ذبابة الفاكهة. 

Video: Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

التصوير تستقيم من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; غرف البيض

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

التصوير الكالسيوم من الردود، رائحة أثار في ذبابة الفاكهة لوب Antennal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neuroscience

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

بروتوكول للكيمياء النسيجية المناعية وتوزيع الحمض النووي الريبي في الموقع داخل جنين ذبابة الفاكهة المبكر

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

في فيفو البصرية الكالسيوم التصوير من اللدونة متشابك الناجمة عن التعلم في دروفوميلا ميلغاستر

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

مراقبة أحداث الصرع في ذبابة الفاكهة عن طريق تصوير الكالسيوم

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

تسليط الضوء على المؤلف: نظرة ثاقبة على تقنيات ونتائج التطورات الحديثة في أبحاث الصرع 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

Source: Ravi, B. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56911">Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique for calcium imaging in individual neurons of behaving Caenorhabditis elegans using genetically encoded fluorescent reporter proteins. It outlines the steps involved in imaging worm movement and measuring reporter fluorescence ratios from neurons to correlate intracellular calcium levels with neuronal activity and behavioral changes during egg-laying.

تصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية الفردية التي تنظم سلوك وضع البيض في Caenorhabditis elegans

1. Strains, Culture Media, and Mounting of Animals

	Grow&#160;C. elegans&#160;worms at 20 &#176;C on standard 60-mm Nematode Growth Medium (NGM) agar ...

التصوير الكالسيوم في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

التصوير تستقيم من

التصوير الكالسيوم من الردود، رائحة أثار في ذبابة الفاكهة لوب Antennal

بروتوكول للكيمياء النسيجية المناعية وتوزيع الحمض النووي الريبي في الموقع داخل جنين ذبابة الفاكهة المبكر

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

في فيفو البصرية الكالسيوم التصوير من اللدونة متشابك الناجمة عن التعلم في دروفوميلا ميلغاستر

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

تصوير الكالسيوم في الخلايا العصبية الفردية التي تنظم سلوك وضع البيض في Caenorhabditis elegans