Name: imaging calcium in drosophila at egg activation
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Somos gratos a Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya para a assistência durante a preparação deste manuscrito; Mariana Wolfner para discussões sobre a ativação do ovo; Matt Wayland para suporte de imagem; e Nan Hu para apoio geral em laboratório. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Cambridge, ISSF para TTW [número de concessão 097.814].

Nota: Realizar todas as medidas à temperatura ambiente, salvo indicação contrária. 1. Preparação para Dissection Nota: Os passos descritos aqui estão de acordo com E. gavis, Universidade de Princeton &amp; Weil et. al. 18. Execute os seguintes passos dois dias antes de imagem. <ol><li> Aqui fly um frasco contendo aproximadamente 10 ml de comida sólida e adicionar uma pequena quantidade de fermento seco para um canto, inferior a 1 g é suficiente. Nota: Para obter informações sobre frascos de voar ou de alimentos ver &#39;Drosophila Manutenção&#39; 19. </li><li> Adicionar 1 - 3 gotas de água para hidratar a levedura. </li><li> Definir o frasco de lado em um ângulo de 45 ° e permitir 3-5 min para a levedura para assumir a água. </li><li> Enquanto a levedura é a absorção de água, seleccionar uma garrafa de moscas que expressam GCaMP5 MYR UASt- 20 impulsionado por banheira-VP16GAL4 (referido como GCaMP5) que surgiram recentemente (um myristoyforma lada do GCaMP5 foi escolhido para fornecer um sinal de alta-ruído através de amarrar o GECI à membrana dentro do ovo). </li><li> Anestesiar as moscas na garrafa com gás CO2. Certifique-se de manter a garrafa invertida de modo a não perder moscas na comida húmida. </li><li> Dica as moscas anestesiados em uma almofada de CO 2 e tipo 10 - 15 mulheres e 5 homens usando um pincel sob um microscópio de dissecação. Nota: É padrão para incluir machos para fornecer fêmeas saudáveis ​​para dissecção. </li><li> Quando o frasco do passo 1.3 está pronto, adicione as moscas selecionados para o frasco. Tome cuidado para manter a horizontal frasco até que as moscas se tornar ativo. </li><li> Colocar o frasco a 25 ° C durante aproximadamente 36 h. </li><li> Retornar as moscas remanescentes do CO 2 pad para a garrafa ou descarte. </li></ol> 2. Dissecting Drosophila Ovário Nota: Os passos descritos aqui estão de acordo com Weil et. ai. <s-se&gt; 18. <ol><li> Após 36 h, anestesiar as moscas do frasco yeasted com CO 2. </li><li> Uma vez que as moscas dentro do frasco são anestesiados ponta-los para a almofada de CO 2 a ser classificados com um pincel sob um microscópio de dissecação. </li><li> Selecione uma fêmea. </li><li> Isolar os dois ovários de fêmea. Para protocolo detalhado completo ver Weil et. al. 18. Em suma: <ol><li> Colocar uma pequena gota de óleo de hidrocarbonetos halogenados oxigenado (série 95) em um n ° s 1.5, 22 x 40 milímetros lamela. </li><li> Agarrar a fêmea com uma pinça na anterior do abdome. </li><li> Segurando a fêmea sob o microscópio de dissecação, use o segundo conjunto de pinças para remover suavemente a parte posterior da fêmea. </li><li> Limpe o tecido posterior do segundo fórceps. </li><li> Espremer na cavidade abdominal com a segunda pinça do anterior para o posterior do abdómen. Os dois ovários opaco deve ficar para a pinça quando fora da FEMAle. </li><li> Toque nos ovários no óleo. </li><li> Remover qualquer tecido do fórceps por limpando os fórceps. </li><li> Repita essas etapas (2.4.1 - 2.4.7) para obter três lamelas, cada um contendo os ovários de uma mosca. </li></ol></li></ol> 3. Isolando Individual óvulos maduros <ol><li> Sob um microscópio de dissecação padrão com a ampliação definido para 4X, na primeira lamela a partir do passo 2.4, separar os dois ovários, rasgando a tuba uterina. </li><li> Introduzir um par de fórceps fechadas para o centro de um único ovário, tomando cuidado para não perfurar quaisquer câmaras de ovo. </li><li> Insira uma sonda de dissecação padrão para o centro do ovário ao lado das pinças fechadas. </li><li> Suavemente arrastar a sonda de dissecação através do ovário para o pólo posterior, onde os óvulos maduros (fase 14 câmaras de ovo) estão localizados. </li><li> Repita os passos 3.1 - 3.4 2-5 vezes, dependendo do tamanho do ovário e do número de ovos. Nota: A adição de CO 2 </sub&gt; normalmente provoca a deposição de um único ovo que aparecerá maior com apêndices dorsais elevado que os ovos depositados previamente. Este ovo deve ser descartado para a imagem latente, uma vez que já foi activado dentro da fêmea. Nota: óvulos maduros são susceptíveis de separar facilmente a partir de tecido conjuntivo de ovário. </li><li> Se não houver óvulos maduros são visíveis fora do ovário, continue suavemente provocando com a sonda de dissecação. </li><li> Uma vez que os ovos maduros são visíveis na lamela fora do ovário, manobrar 3-5 numa linha no centro da lamela. Nota: Para obter os melhores resultados, a sonda de correr suavemente ao longo do lado dos ovos. Nota: Evite puxando os apêndices dorsais, pois isso pode danificar o óvulo. Nota: Dependendo do futuro imaging set-up, alinhe os ovos cerca de 200 mm além perpendicular à lamela para a área máxima de imagem. </li><li> Uma vez alinhados, remover o resto do tecido do ovário, arrastando-a para longe dos ovos alinhadas utilizando o forceps. </li><li> Retire o excesso de óleo, esfregando com o canto de limpar um médico. Tenha cuidado para não tocar os ovos maduros com o médico limpe ovos, como maduras que são contactadas serão perdidos. </li><li> Desenhar uma cruz sobre a lamela com um marcador para simplificar a colocar a amostra sob o microscópio. </li><li> Defina a lamela em um lugar seguro e deixar as câmaras de ovos preparados na lamela para descansar por 5 - 10 min. Isso permite que o ovo se estabelecer no óleo. As amostras podem ser utilizados até 1 h após a dissecação. </li><li> Repita os passos 3,1-3,11 para o resto das lamelas com ovários sobre eles. </li></ol> 4. Preparar for Imaging <ol><li> Traga tampão de activação preparado para 15 temperatura ambiente. Nota: tampão de activação é um tampão hipotónico: 3,3 mM de NaH 2 PO 4, 16,6 mM de KH 2 PO 4, 10 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 5% de polietileno glicol 8000, CaCl2 2 mM, levada a pH 6,4 com uma mistura 1: 5 proporção de NaOH: KOH.Para mais informações ver Mahowald, 1983 15. Alíquotas de tampão de activação pode ser armazenado a -20 ° C durante meses e a 4 ° C durante até 2 semanas. </li><li> transportar cuidadosamente lamelas preparados, tampão de activação e pipetas de vidro para a instalação de imagem. Nota: Uma de campo amplo, confocal, de disco rotativo ou folha microscópio de luz pode ser utilizado. Recomendamos o uso de um microscópio invertido. Os resultados representativos foram obtidos utilizando um microscópio confocal. </li><li> Um objectivo adequado para imagiologia de todo o óvulo maduro deve ser escolhida (aqui: 20X 0,7 NA). </li><li> Montar a primeira lamela preparado para o palco microscópio. Tome cuidado para não quebrar as lamelas no palco. </li><li> Qualitativamente selecionar um campo de visão com uma câmara de óvulo maduro para a ativação. Do não de imagem perfurada câmaras de ovo ou aqueles com formação de bolhas na membrana. Nota: Para obter etapas 4.6 - 4.7, comandos de software irá variar dependendo do microscópio e fabricante. </li><li> Set parágrafo imagingmetros para a excitação padrão GFP (488 nm) e emissão (500-580 nm). Também configurar uma vista de campo brilhante, a fim de visualizar e orientar o óvulo maduro e óleo de deslocados. </li><li> Seleccionar o menor plano z em que os ovos maduros são visíveis e definir um Z-pilha completa para ser levado para 40 um a cerca de 2 mM por passo. Defina os parâmetros para que haja nenhum atraso entre a aquisição Z-stack. Definir a série de tempo para capturar cerca de 30 min. </li></ol> 5. Activação de imagem Ex Vivo ovo <ol><li> Comece a captura da imagem. </li><li> Espere por 1 - 2 completos Z-stacks a serem adquiridos. Isto mostra o óvulo maduro antes da activação. </li><li> Retirar cerca de 300 ul de tampão de activação para uma pipeta de vidro. </li><li> Posicionando a ponta da pipeta de vidro contendo tampão de ativação em um ângulo de 45 ° acima da lamela, mova lentamente a pipeta no caminho do feixe até que esteja diretamente acima do óvulo maduro que está sendo trabalhada. A pipeta de vidro deveser de 1 - 2 cm acima do óleo. </li><li> Adicionar 1 - 2 gotas de tampão de activação em menos de 5 segundos a partir da pipeta de vidro. Isto deve deslocar o óleo. Evitar a adição de tampão de activação de excesso ou tocar no ovo com a pipeta de vidro, uma vez que pode causar o deslocamento do óvulo maduro. Tome cuidado para não tocar a lamela com a pipeta, pois isso pode causar uma mudança no plano ou bolhas de ar focais a se formar no óleo de imersão entre o objetivo e lamela. </li><li> Embora a adição de tampão de activação durante a aquisição de imagem, verificar o canal de campo brilhante para assegurar que o óleo tenha sido deslocado pelo tampão de activação. Nota: Isto irá aparecem pela primeira vez como uma sombra devido à pipeta quebra do caminho do feixe, mas também irá resultar no aparecimento de gotas de óleo pequenas. Algumas gotas de óleo pode permanecer associado com o óvulo maduro que irá afectar os resultados experimentais e a qualidade da imagem. </li><li> Se o óleo não é deslocada a partir da adição inicial de tampão de activação de repetir os passos 5,4-5.6. </li><li> Uma vez que o óleo é deslocado com sucesso, permitem que a série de tempo para ser executado até a conclusão. Nota: Devido ao inchaço dos oócitos em ativação, algumas câmaras de ovo irá mover drasticamente fora do plano focal ou campo de visão após a adição de tampão de activação. Nesta situação, pare a aquisição e montagem da próxima lamela. </li><li> Depois da sequência de imagem concluiu aquisição, salvar os dados. </li></ol> 6. Pós-aquisição de Processamento de Imagem <ol><li> Abra o conjunto de dados usando Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), ou software de processamento de imagem equivalente, e selecione os arquivos relevantes para a análise. </li><li> Para construir uma projeção dos dados adquiridos selecione: Imagem&gt; Pilhas&gt; Z-projeto. </li><li> Selecione um começo Z-slice e uma Z-slice parada, geralmente toda a seção. Selecione um tipo de projeção, normalmente definido como &#39;Max intensidade &quot;. Marque a caixa tick &#39;All Time Frames &quot;para aplicar as configurações selecionadas para toda a série. </li><li> E semais de um canal fluorescente foi fotografada, use a ferramenta Canais para permitir o movimento entre as cores, fazer um composto, ou fazer a escala de cinza da imagem. Selecione Imagem&gt; Colors&gt; Canais ferramenta. </li><li> Para ajustar o brilho eo contraste da imagem, selecione Image&gt; Adjust&gt; Brightness / Contrast. </li><li> Para exportar uma única imagem, mover controle deslizante escala de tempo para o quadro relevante e selecione Arquivo&gt; Salvar como&gt; JPEG ou qualquer formato preferido. </li><li> Escolha um local e título para o arquivo exportado, em seguida, salvar. Nota A taxa de quadros a partir do software de imagem será obrigado a dar uma data e hora na imagem. </li><li> Para exportar a série temporal como um filme selecione: File&gt; Save As&gt; AVI, em seguida, selecione a taxa de quadros (~ 7 quadros por segundo). </li><li> Escolha um local e título para o arquivo exportado, em seguida, salvar. </li><li> Para salvar o arquivo no formato ajustado Fiji, selecione Arquivo&gt; Salvar. </li></ol>

<ol>
	<li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals.">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitioning+from+egg+to+embryo:+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation.">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li><li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka,+Oryzias+latipes.">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li><li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes.">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li><li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2.">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li><li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy.">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li><li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+Ca2++indicators:+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology.">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, 55-67 (2007).</li><li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> New Techniques in Systems Neuroscience. , (2015).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate.">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li><li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila.">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li><li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs.">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li><li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes.">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li><li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner.">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Biology+1:+yeast,+Drosophila+and+C.+elegans.+Drosophila+Maintenance.">Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility.">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li><li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo.">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li><li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans.">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li><li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs.">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).</li><li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation.">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

Uma alteração na concentração intracelular de Ca 2+ em ovo (oócitos) de activação é um componente conservado de todos os organismos estudados 1,2. Este evento inicia uma vasta gama de processos dependentes de Ca 2+, incluindo retomada do ciclo celular e a tradução de mRNAs armazenados. Devido a esta exigência de Ca 2+, visualizando as alterações transitórias em concentrações intracelulares de Ca 2+ tem sido de interesse chave. Historicamente, foram seleccionados organismos modelo para estudos de activação de ovo com base no tamanho e disponibilidade dos seus ovos. Várias abordagens de visualização têm sido utilizadas para seguir e quantificar as alterações na concentração de Ca2 + intracelular em tais sistemas, incluindo: a aequorina fotoproteï¿½a em medaka peixes 3; Ca 2+ corantes fluorescentes sensíveis, tais como Fura-2 em ouriço-do-mar e hamster 4,5; e cálcio verde-1-dextrano em Xenopus 6. A geração e melhoria de indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIS) transformou a capacidade de visualizar de Ca2 + dinâmica in vivo 7. Estas construções genéticas são expressas em tecidos específicos e limitar a necessidade de preparações de tecidos invasivos 8. GCaMPs são uma proteína fluorescente (GFP) classe baseado verde da Gecis que têm sido muito eficaz devido à sua elevada afinidade de Ca2 +, razão e capacidade de sinal-ruído para ser personalizado 9-11. Na presença de Ca2 +, o complexo GCaMP sofre uma série de alterações conformacionais, que começa com a ligação de Ca 2+ para a calmodulina, que resulta em um aumento da intensidade de fluorescência da GFP componente 9. GCaMPs têm sido amplamente utilizados em pesquisas sobre neurônios Drosophila visualize as alterações de cálcio intracelular 12. Os applicati recenteson da tecnologia GCaMP para visualizar Ca 2+ em ovos de Drosophila maduros revelou uma única transiente de Ca2 + onda de activação de ovo 13,14. A onda de Ca2 + pode ser visualizada a baixa ampliação durante a ovulação in vivo 13 ou em maior ampliação usando um ensaio de activação ex vivo 13,14. No ensaio ex vivo, os oócitos maduros individuais são isolados a partir dos ovários e activado usando uma solução hipotónica, referido como tampão de activação, o que foi mostrado para recapitular eventos de activação in vivo, em 15-17. Este ensaio ex vivo permite a visualização de alta resolução fácil da onda de Ca2 +, sob diferentes condições experimentais, incluindo perturbação farmacológica, manipulações físicas e mutantes genéticos. Este artigo demonstra a preparação de ovos de Drosophila maduras para a activação ex vivo e The subsequente microscopia usado para visualizar a onda de Ca2 + utilizando GCaMP. Esta abordagem pode ser utilizada para testar a iniciação e controlo da onda de Ca2 + e a sonda resultados jusante.

<table><tbody><tr><td>Dry active yeast</td><td>Fleischman&amp;rsquo;s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Lamp</td><td>Mircotec Fibre optic</td><td>MF0-90</td><td>Various will work</td></tr><tr><td>Medical wipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marker pen</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; pad</td><td>&amp;nbsp;Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil, series 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Distributor in Europe:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Fisherbrand,</td><td>FB50251</td><td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&amp;nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Aqui demonstramos como preparar ovos de Drosophila maduros para a activação ex vivo. Ovos expressam um GECI permitir imagens de Ca 2+ dinâmica na activação de ovo e o início do desenvolvimento embrionário (Figura 1). Deve notar-se que, dependendo da GCaMP usado, especificamente a presença de um grupo miristoílo, os resultados podem ter pequenas diferenças qualitativas 13 14. Nós também têm demonstrado um papel para a actina funcional durante a activação do ovo por meio da adição de um inibidor de polimerização de actina, citocalasina D, para o tampão de activação (Figura 2) 14. Um requisito para o citoesqueleto na activação do ovo é conservada. Em C. elegans, após a fertilização, os componentes do citoesqueleto são reorganizados para preparar o embrião de uma célula para a primeira divisão assimétrica 21,22. Em ouriço do mar, a perturbação dos cytoskeleTal re-organização após activação foi mostrado para afectar o ciclo celular, prevenindo a formação do anel 23 contráctil. O papel da actina na mediação de uma onda de Ca2 + e sua função jusante para ativação ovo em Drosophila continua a ser totalmente elucidado. Em Drosophila, o co-visualização da onda do citoesqueleto de actina e de Ca2 + pode ser conseguida utilizando este ensaio de activação ex vivo. Séries temporais de vários canais podem ser adquiridas e dinâmica do Ca2 + intracelular pode ser combinado com mudanças na organização da actina no oócito (Figura 3). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Figura 1:. A Single Ca 2+ onda em série Drosophila Egg Activation Hora do ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 seguindo a umddition de tampão de activação (AH). O aumento no Ca 2+ citoplasmático origina-se no polo posterior (B) e propaga (BF) com uma velocidade média de cerca de 1,5 um / seg. Iniciação da onda é tipicamente observada dentro de 3 minutos da adição de tampão de activação. Após a activação, os níveis de cálcio intracelular do óvulo maduro retorna aos níveis (G, H) de pré-activação. Veja o filme suplementar 1 (tempo total de 33 min). Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Figura 2: A adição de citocalasina D da Activação: Tampão perturba Ca2+ Propagação de Ondas. A série da ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 após a adição de tampão de activação contendo / ml concentração final citocalasina D 10 mg (AH). Embora a onda 2+ Ca é iniciada no pólo posterior (A), que é comprometida e não atinge o anterior do ovo (F) (setas brancas indicam a frente da onda). Nenhuma outra Ca 2+ foram observadas alterações ao longo de 30 min). Veja o filme suplementar 2 (total de tempo de 30 min). Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Figura 3: Co-visualização de actina e Ca 2+ em EAtivação gg em série Drosophila. Hora do ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 (ciano) e UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) após a adição de tampão de activação (AH). O Ca 2+ onda inicia a partir do pólo posterior e recupera como na Figura 1. Actina parece estar mudando ao longo do tempo, as setas brancas (A vs H). A falta de detecção do sinal de Ca2 + no centro do óvulo maduro é devido ao movimento da amostra durante a captura de imagem. Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation at JoVE.com

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Este artigo descreve um protocolo adaptável ex vivo para a visualização de Ca2 + durante a ativação do ovo em Drosophila.

Imagens de cálcio na<em&gt; Drosophila</em&gt; At Activation Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K visualizações.  University of Cambridge.  Este artigo descreve um protocolo adaptável ex vivo para a visualização de Ca2 + durante a ativação do ovo em Drosophila. 

Vídeo: Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imagem Vertical de<em&gt; Drosophila</em&gt; Câmaras de ovo

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Biologia do Desenvolvimento

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neurociência

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

Um Protocolo para Imunohistoquímica e Distribuição In-situ de RNA dentro do Embrião Drosophila Precoce

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Monitoramento de eventos epileptiformes em Drosophila por meio de imagens de cálcio

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

Autor em destaque: insights sobre as técnicas e descobertas de avanços recentes na pesquisa da epilepsia 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

Calcium Imaging in Individual Neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans

Source: Ravi, B. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56911">Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique for calcium imaging in individual neurons of behaving Caenorhabditis elegans using genetically encoded fluorescent reporter proteins. It outlines the steps involved in imaging worm movement and measuring reporter fluorescence ratios from neurons to correlate intracellular calcium levels with neuronal activity and behavioral changes during egg-laying.

Imagem de cálcio em neurônios individuais que regulam o comportamento de postura de ovos em Caenorhabditis elegans

1. Strains, Culture Media, and Mounting of Animals

	Grow&#160;C. elegans&#160;worms at 20 &#176;C on standard 60-mm Nematode Growth Medium (NGM) agar ...

Imagens de cálcio na

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Imagem Vertical de

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

Um Protocolo para Imunohistoquímica e Distribuição In-situ de RNA dentro do Embrião Drosophila Precoce

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Imagem de cálcio em neurônios individuais que regulam o comportamento de postura de ovos em Caenorhabditis elegans