Name: an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction
Uploaded: 2016-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction at JoVE.com

ونحن ممتنون لأنيكا Engbers وفرانك كورث حصول على الدعم الفني الممتاز والدكتور ماركوس شافر (nanoAnalytics GmbH ل) لإجراء مناقشات مفيدة بشأن القياسات طير. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، SFB1009 مشروع A03 إلى الأب وLK، CRC TR128، مشاريع A08. Z1 وB01 لوقا والأب، ومركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (كلية الطب في مونستر) عدد المنح Kl2 / 2015/14 لوقا.

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl and L. Klotz have nothing to disclose. H.-J. Galla is a scientific advisor of nanoAnalytics GmbH, the manufacturer of the automated cell monitor.

عدة خطوات من بروتوكول صفها ضرورية لإجراء تجربة ناجحة. خلال العزلة MBMEC الأولية والثقافة، فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ العمل تحت ظروف معقمة قدر الإمكان، لمنع التلوث من ثقافة الخلية مع الجراثيم الفطرية أو البكتيريا. من أجل الحصول على ثقافة نقية من ECS، فمن المستحسن است?...

حاجز الدم في الدماغ يفصل جهاز الدورة الدموية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) 1-3. وهو يوفر حاجز مادي أن يمنع حرية حركة الخلايا وانتشار الجزيئات القابلة للذوبان في الماء ويحمي الدماغ من مسببات الأمراض والمواد الضارة المحتملة. بالإضافة إلى وظيفة الجدار العازل، وBBB تمكن من إيصال الأوكسجين والمواد المغذية لحمة الدماغ، والتي تضمن حسن سير العمل في الأنسجة العصبية. الخصائص الفنية للBBB درجة عالية من التنظيم من قبل المكونات الخلوية وديكي لها، مع درجة عالية من التخصص ECS كونها العنصر الهيكلي الرئيسي. تتميز ECS من BBB من وجود تقاطع ضيق (TJ) المجمعات، وعدم وجود fenestrations، النشاط pinocytic منخفضة للغاية، وآليات النقل نشطة بشكل دائم. مكونات أخرى من BBB الغشاء القاعدي EC، pericytes تضمين البطانة، قدم نهاية نجمي و= المرتبطة قدم المساواةenchymal الغشاء القاعدي أيضا أن تسهم في تطوير وصيانة وظيفة من BBB 2،4 - 6 و، جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة، تشكل وحدة وعائية عصبية (NVU)، والتي تمكن حسن سير العمل في الجهاز العصبي المركزي 7-9. في مجموعة متنوعة من الأمراض العصبية، مثل الاعصاب، والأمراض الالتهابية أو المعدية، وظيفة BBB للخطر 2،5،10. ديسريغولاتيون من TJ المجمعات وآليات النقل الجزيئية يؤدي إلى زيادة نفاذية BBB، تسرب الكريات البيض، والتهاب وتلف الخلايا العصبية. من أجل دراسة خصائص BBB في ظل هذه الظروف المرضية، وقد وضعت مختلف في المختبر نماذج BBB 9،11،12. معا كانوا قد قدموا معلومات قيمة حول التغييرات النزاهة الحاجز، نفاذية وكذلك آليات النقل. هذه النماذج تستخدم الخلايا البطانية من البشر، الجرذان والفئران، الخنزير أو بالأغنام أصل 13-18. الخلايا البطانية الأولية أو خطوط الخلايا يتم استزراع إما الأحادية أو جنبا إلى جنب مع pericytes و / أو الخلايا النجمية لتحاكي بشكل وثيق BBB في الجسم الحي 19-25. في السنوات الأخيرة، أصبح قياس المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) أداة مقبولة على نطاق واسع لتقييم خصائص حاجز غشائي 26،27. يعكس طير مقاومة لتدفق الأيونات عبر أحادي الطبقة الخلية ويوفر انخفاضه مقياس حساسية للخطر سلامة حاجز غشائي، وبالتالي زيادة نفاذية. وقد وضعت العديد من أنظمة قياس طير، بما في ذلك طلائي Voltohmmeter (EVOM)، الكهربائية الخلوي الركيزة الممانعة الاستشعار (ECIS)، وتحليل الخلايا في الوقت الحقيقي 15،28 - 30. يعكس طير المقاومة لتدفق الأيونات بين ECS المجاورة (paracellular الطريق) وهو يتناسب طرديا معسلامة الحاجز. في مقاومة الطيفي 27،31، يتم قياس مقاومة الإجمالية المعقدة (Z)، الذي يوفر معلومات إضافية حول سلامة الحاجز عن طريق قياس جنة علم المناخ. لجنة علم المناخ يتعلق بالسعة الحالية من خلال غشاء الخلية (الطريق العابر لل): طبقة الخلايا تتصرف مثل مكثف في الدائرة الكهربائية ما يعادلها، فصل رسوم على جانبي الغشاء وهي عكسيا يتناسب مع سلامة الحاجز. عندما نمت على إدراج قابلة للاختراق، ECS الالتزام بها وتتكاثر وتنتشر على غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها. هذا يقاوم الخلفية بالسعة الحالية للإدراج (الذي في حد ذاته يتصرف مثل مكثف) ويؤدي إلى انخفاض في السعة حتى يصل إلى مستوى الحد الأدنى. ويعقب ذلك من خلال إنشاء مجمعات TJ أن ختم قبالة الفضاء بين ECS المجاورة. وهذا يحد من تدفق الأيونات عبر الطريق paracellular، وطير يزيد حتى يصل إلى هضبة لها. في ظل ظروف التهابات، ومع ذلك، فإن endotheliتم المساس آل الحاجز: طير يتناقص مجمعات TJ الحصول على تعطلت ولجنة علم المناخ يزيد باعتبارها العنصر بالسعة من إدراج يرتفع مرة أخرى. يستخدم قياس طير لدينا نظام آلي مراقبة الخلية 32: يترتب على مبدأ التحليل الطيفي مقاومة وتمتد تطبيقاته السابقة. هنا، نحن تصف في المختبر نموذج BBB التي تمكن من دراسة خصائص الحاجز، بما فيها تفاعل بطانة الدماغ مع الخلايا المناعية. ولا سيما تنشيط خلايا تي. ولوحظت هذه الظروف المرضية في أمراض المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي، مثل التصلب المتعدد ونموذج حيواني التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي في 33-37. هنا، خطوة حاسمة هي التهجير من دماغي المنشأ، وخلايا T-المايلين محددة عبر BBB. ويتبع ذلك تنشيط في الحيز المحيط بالأوعية ودخول حمة الدماغ، حيث تجنيد الخلايا المناعية الأخرى، وليالتهاب diate ولاحق إزالة الميالين 1،35،38. ومع ذلك، الآليات الجزيئية للتفاعل بين هذه الخلايا التائية والخلايا البطانية، والمكونات الرئيسية من بي بي بي، ليست مفهومة جيدا. ويهدف بروتوكول لدينا لملء هذه الفجوة وإعطاء رؤى جديدة في العواقب على الخلايا البطانية (أي سلامة الحاجز والنفاذية) عند الاتصال بهم مباشرة وتفاعل معقد مع تنشيط خلايا تي. بروتوكول الموصوفة هنا يجعل من استخدام الماوس الأساسي خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البطانية، كما نمت أحادي الطبقة على إدراج نفاذية الأغشية مع الصغيرة التي يسهل اختراقها. وشارك في تربيتها الخلايا البطانية مع خلايا CD4 + T، التي يمكن أن تكون مرحلة ما قبل تفعيلها إما polyclonally أو بطريقة مستضد معين. شارك في ثقافة MBMECs مع خلايا T قبل تفعيلها، ولكن ليس ساذجا يؤدي الى انخفاض في طير وزيادة في لجنة علم المناخ، والذي يقدم مقياسا كميا لMBMEC الخلل وحاجز انقطاع. التقنيةهو غير الغازية: ويستخدم في البناء بدلا من الأقطاب الكهربائية عود، التي تحول دون اضطراب كبير من أحادي الطبقة EC. أنها يمكن أن تستخدم لمراقبة وظيفة الحاجز من دون استخدام علامات الخلية. يجعل القياسات المستمرة بطريقة آلية وتمكن تقييم مستقل من المعلمات حاجز اثنين (طير ولجنة علم المناخ) في وقت واحد مع مرور الوقت. هذه الطريقة أيضا حساسة بما يكفي للتمييز بين مستويات مختلفة من تنشيط الخلايا T وآثار هذه الخلايا التائية على ECS. ويمكن استخدامه في مجموعة واسعة من المقايسات الفنية: السيتوكينات مختلفة و / أو كيموكينات المتورطين في عمليات التهابات يمكن أن تضاف إلى ثقافة مشتركة من MBMECs وخلايا تي. منع الأجسام المضادة ضد جزيئات التصاق الخلية على أي من المفوضية الأوروبية أو الجانب تي خلية يمكن استخدامها. ومثبطات تي علامات تنشيط الخلايا أو ممتلكاتهم لحل الخلايا يمكن أن تضاف خلال فتيلة تي خلية أو زملائهم في الثقافة مع ECS. الفحص مفيد أيضا للهجرة خلايا Tالمقايسات، لأنها يمكن أن تكون بمثابة مراقبة جودة MBMEC سلامة أحادي الطبقة السابقة لإضافة خلايا تي. كل هذا يجعل هذه الطريقة أداة مرنة وموثوق بها لدراسة BBB في المختبر، مع التركيز على تأثير تنشيط خلايا تي في المفوضية الأوروبية سلامة أحادي الطبقة. هذا الأمر أهمية خاصة لفهم آليات تعطل BBB في التسبب في أمراض المناعة الذاتية، مثل مرض التصلب العصبي المتعدد ونموذج حيواني لEAE، حيث تعبر، وخلايا T دماغي المنشأ ذاتية التفاعل بي بي بي وتسبب التهاب وتلف الخلايا العصبية.

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com</td><td>including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>FlowJo7.6.5 software</td><td>Tree Star</td><td>www.flowjo.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 ml; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 0.4 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>for TEER measurement as the main readout</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 3 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay</td></tr><tr><td>24-well cell culture plate</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>flat-bottom; for MBMEC culture</td></tr><tr><td>96-well cell culture plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>round-bottom; for immune cell culture</td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns</td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns</td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS LS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>for T cell and B cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD4 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td>for CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD19 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>for B cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Collagen type IV from human placenta</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Fibronectin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Collagenase 2 (CSL2)</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase (C/D)</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DMEM (+ GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>for MBMEC and immune cell isolation</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>for MBMEC culture medium; only for the first three days</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>for harvesting MBMECs</td></tr><tr><td>Collagenase Type IA</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>IMDM + 1% L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>for T cell culture medium</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE04-418Q</td><td>protect from light; for B cell culture medium</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>mouse MOG&lt;sub&gt;35&amp;mdash;55 &lt;/sub&gt;peptide</td><td>Biotrend</td><td>BP0328</td><td>for antigen-specific T cell activation</td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD3 Ab</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>clone 37.51; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>Recombinant Murine IFN-&amp;gamma;</td><td>PeproTech</td><td>315-05</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>Recombinant Murine TNF-&amp;alpha;</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&amp;gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Granzyme B Inhibitor II</td><td>Calbiochem</td><td>368055</td><td>recommended final concentration: 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD4 antibody</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration</td></tr></tbody></table>

an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

ويقدم الشكل 1 لمحة عامة عن نموذج BBB في المختبر تستخدم لدراسة التفاعل بين الخلايا T والخلايا البطانية. وتتكون هذه التجربة من ثلاث خطوات رئيسية. الخطوة الأولى هي عزل MBMECs الابتدائي من القشور الدماغ، وثقافتهم لمدة خمسة أيام. عندما تصل إلى ن?...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction at JoVE.com

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من حاجز الدم في الدماغ عن طريق التحليل الطيفي المعاوقة: التركيز على التفاعل خلية تي خلية البطانية

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

an-vitro-model-blood-brain-barrier-using-impedance-spectroscopy-focus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

11.2K Views.  University Hospital Münster. Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Video: An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

وضع ما يصل إلى<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الفئران حاجز الدم في الدماغ (BBB): التركيز على BBB عدم النفاذ والنقل مستقبلات بوساطة

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medicine

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

تحسين أسلوب لإنشاء في المختبر حاجز الدم – المخ نموذج استناداً إلى خلايا المخ الخنزيري بطانية

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

تحليل نفاذية حاجز الدم في الدماغ من قبل اجتياز الميكروبات من خلال الخلايا البوائية الدقيقة

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

تحليل نماذج الحاجز الدموي الدماغي عن طريق تلطيخ التألق المناعي

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير استخدام تكنولوجيا رقائق الأنسجة لدراسة الأنسجة البشرية 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

استخدام منصة الأنسجة الحاجزة MicroSiM (μSiM) لنمذجة الحاجز الدموي الدماغي

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Bioengineering

قياس المقاومة عبر بطانة الرحم لتقييم سلامة حاجز الخلية

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

تسليط الضوء على المؤلف: تطبيقات اكتشاف TEER لتقييم سلامة حاجز الخلية 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

تسجيل السلامة الوظيفية للحاجز على bEnd.3 الخلايا البطانية الوعائية عبر اكتشاف المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

ل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

وضع ما يصل إلى

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام

تحسين أسلوب لإنشاء في المختبر حاجز الدم – المخ نموذج استناداً إلى خلايا المخ الخنزيري بطانية

تحليل نفاذية حاجز الدم في الدماغ من قبل اجتياز الميكروبات من خلال الخلايا البوائية الدقيقة

استخدام منصة الأنسجة الحاجزة MicroSiM (μSiM) لنمذجة الحاجز الدموي الدماغي

استخدام منصة الأنسجة الحاجزة MicroSiM (μSiM) لنمذجة الحاجز الدموي الدماغي

استخدام منصة الأنسجة الحاجزة MicroSiM (μSiM) لنمذجة الحاجز الدموي الدماغي

تسجيل السلامة الوظيفية للحاجز على bEnd.3 الخلايا البطانية الوعائية عبر اكتشاف المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم

تسجيل السلامة الوظيفية للحاجز على bEnd.3 الخلايا البطانية الوعائية عبر اكتشاف المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم

تسجيل السلامة الوظيفية للحاجز على bEnd.3 الخلايا البطانية الوعائية عبر اكتشاف المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم