Wir sind dankbar, dass Annika Engbers und Frank Kurth für ihre hervorragende technische Unterstützung und Dr. Markus Schäfer (nanoanalytics GmbH) für hilfreiche Diskussionen über TEER-Messungen. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt wird, SFB1009 Projekt A03 bis HW und LK, CRC TR128, Projekte A08; Z1 und B01 bis LK und HW, und das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (Medizinische Fakultät Münster) Gewährungsnummer Kl2 / 2015/14 bis LK.

Für alle Versuche wurden die Mäuse gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in der zentralen Tieranlage an der Universität Münster, nach den deutschen Richtlinien für die Tierpflege gehalten. Alle Versuche wurden nach den Richtlinien des Tierversuchsethikkommission durchgeführt und von den örtlichen Behörden des Landes Nordrhein-Westfalen, Deutschland (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) zugelassen. 1. MBMEC Isolierung und Kultur HINWEIS: Isolieren MBMECs wie zuvor im Detail 14 mit den folgenden Modifizierungen beschrieben: <ol><li> Sacrifice 20 erwachsenen C57BL / 6 - Mäuse (6-8 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation und bestätigen ihr Tod durch Herz- und Atemstillstand festzustellen. </li><li> Spülen Sie die Maus mit 70% Ethanol und enthaupten es Schere; Entfernen Sie die Kopfhaut einer Pinzette und Schere. Machen Einschnitte auf der linken und rechten Seite des Schädels, vom Foramen Magnum beginnen. Heben Sie den Schädel von seinem Schwanz Seite und takE das Gehirn mit einer Pinzette aus. </li><li> Unter einem Laminar-Flow-Haube, sterile Pinzette das Gehirn in einer Petrischale zu legen und den Hirnstamm, Kleinhirn und Thalamus, halten nur die Rinde entfernen. HINWEIS: Die Verwendung eines Mikroskops ist nicht erforderlich, für jeden dieser Schritte. </li><li> Legen Sie die Rinde auf ein Stück sterile Western-Blot-Papier und rollen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette bis Meningen sind nicht mehr sichtbar. </li><li> Nach der mechanischen und enzymatischen Verdau (nach dem Protokoll 14) sammeln Endothelzellen aus der Dichtegradient durch einen langen, sterile Nadel und einen 5 ml Kolben verwendet wird . Endothelial Zellen erscheinen als eine trübe Schicht über dem roten Ring mit Erythrozyten. Transfer 20-25 ml dieser Schicht in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen; ganz oben auf der Röhre mit DMEM auf. </li><li> Nach zwei Runden der Wasch 14, Resuspendieren der Zellen in 6 ml MBMEC Medium , das Puromycin (4 &amp; mgr; g / ml) und sie auf sechs beschichteten Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen Samen; lassen Sie sie in einem GewebeKulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 (bezeichnet als &quot;Inkubator&quot; von hier an) für drei Tage. HINWEIS: Details der MBMEC Beschichtungslösung, siehe Materialien Tabelle. </li><li> Ändern Sie das Medium durch Zugabe von 1 ml zu jeder Vertiefung von frischem MBMEC Medium ohne Puromycin; legte die Platte wieder bei 37 ° C und 5% CO 2 für zwei weitere Tage. </li></ol> 2. Ernte MBMECs <ol><li> Am Tag fünf nach MBMEC Isolation Lösung Precoat-durchlässige Einsätze mit MBMEC Beschichtung: 80 ul Lösung pro Einsatz hinzufügen und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3 Stunden verlassen. </li><li> Pipette vorsichtig die Beschichtungslösung und die Einsätze der Luft trocknen für 30 Minuten lassen. 2 ml Raumtemperatur (RT) PBS in jede Vertiefung der Platte, MBMECs mit dem Medium zu waschen; Wiederholen Sie diesen Schritt. In 0,05% Trypsin-EDTA (300 &amp; mgr; l pro Vertiefung) und lassen Sie die Platte in den Inkubator für 5-10 min. </li><li> 2 ml MBMEC Medium zu jeder Vertiefung zu stoppenTrypsinierung. Übertragung der gesammelten Zellen auf eine 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere sie bei 700 × g für 8 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml MBMEC Medium ohne Puromycin. </li><li> Zählen Sie die Zellen; 10 ul der Zellsuspension mischen mit 90 &amp; mgr; l 0,04% Trypan-Blau (10x Verdünnung der Zellen). Je 10 ul dieser Mischung zwischen der Glasabdeckung und die Zellzählung Kammer (Hämozytometer). Zählen Trypan Blau-freien Zellen in allen vier Quadranten der Kammer (N) und bestimmen die durchschnittliche Anzahl der gezählten Zellen (N &#39;) wie folgt: N&#39; = N / 4 ist. </li><li> Berechnen der Zellkonzentration (in 10 &amp; sup6 ; Zellen / ml) mit der folgenden Formel: C = N &#39;x 10 4 x 10, wobei 10 4 durch die Abmessungen des Hämozytometer gegeben und 10 ist der Verdünnungsfaktor aus Schritt 2.4. </li><li> Seed 2 x 10 4 Zellen in einem Volumen von 260 &amp; mgr; l pro Platte. In 810 ul MBMEC mittleren bis unteren Fach jeder Vertiefung. Legen Sie die Platte mit Einsätzen in den Inkubator, bis sie bereit mit Abschnitt 4 fortzufahren. HINWEIS: Die Volumina für die obere und untere Fach sind einsatzspezifisch und funktionieren nicht für alle 24-Well-Formate. </li></ol> 3. CD4 + T - Zell - Isolierung und Stimulation <ol><li> CD4 + T - Zell - Isolation <ol><li> Sacrifice einer erwachsenen Maus (6-8 Wochen alt) durch CO 2 Inhalation und bestätigen seinen Tod durch Herz- und Atemstillstand festzustellen. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken auf einer sauberen Dissektion Bord und spülen Sie ihn mit 70% Ethanol; Verwenden einer sterilen Schere und Pinzette das Peritoneum zu öffnen und die Milz und Lymphknoten (Leisten, Achsel, brachial und Gebärmutterhalskrebs) zu entfernen; Schließlich übertragen die Gewebe in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, die 5 ml PBS auf Eis. </li><li> Unter laminaren Strömungshaube, übertragen das Gewebe durch PBS mit dem Gewebe in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 70 &amp; mgr; m Zellsieb auf Dekantierung; homogenisierendas Gewebe durch sie mit einer 1 ml Kolben durch das Sieb zu drücken. </li><li> 30 ml FACS-Puffer und Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 10 ml FACS-Puffer. Filtern Sie die Suspension durch eine 40 um Zelle Sieb, fügen Sie eine weitere 20 ml FACS-Puffer auf das Rohr. </li><li> Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer. </li><li> In 20 ul Maus-CD4 magnetischen Mikrokügelchen, gut mischen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C. 25 ml FACS-Puffer und Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> In der Zwischenzeit legen Sie eine LS-Trennsäule in den Magneten und spülen Sie ihn mit 3 ml FACS-Puffer. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 3 ml FACS-Puffer. </li><li> Hinzufügen von Zellen an die Säule. Die Säule wird mit 3 ml FACS dreimal puffern. Entfernen Sie die Säule aus dem Magneten und legen Sie es auf eine neue 15 ml centrifugation Rohr. 5 ml FACS-Puffer, spülen Sie die markierten Zellen mit dem Säulenkolben und Zentrifuge bei 500 xg für 5 min 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 3 ml T-Zellmedium. Zählen Sie die Zellen wie in 2.4 und Samen 1 x 10 5 Zellen in 100 ul Medium pro Vertiefung. </li></ol></li><li> CD4 + T - Zell - Stimulation <ol><li> Polyklonale CD4 + T - Zell - Stimulation <ol><li> Pre-coat eine Rundboden 96-Napf-Platte mit gereinigtem anti-Maus-CD3-Antikörper (Klon 145-2C11) in PBS, bei einer gewünschten Endkonzentration. Zum Beispiel, vor der Beschichtung der volle Platte mit α-CD3 bei 1 &amp; mgr; g / ml, mischen 10 ul der Antikörper (Stammkonzentration = 0,5 mg / ml) mit 5 ml PBS, Wirbel und 50 ul der Mischung jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Lassen Sie die Platte in den Inkubator für 3 Stunden. Nachdem die T-Zellen zu isolieren, waschen Sie die vorgezogene Platte zweimal mit PBS. Hinzufügen gereinigter anti-CD28-Antikörper (Clon37,51) auf isolierte T - Zellen in einer Endkonzentration gewünschte (beispielsweise bei 1 &amp; mgr; g / ml); gut mischen. Samen der T-Zellen und lassen sie in den Inkubator für zwei bis drei Tage. </li></ol></li><li> Antigen-spezifische CD4 + T - Zell - Stimulation mit dendritischen Zellen (DCs) HINWEIS: Wenn DCs als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) verwendet werden, folgen Sie dem Protokoll für die T-Zell-Isolierung, mit folgenden Ausnahmen: <ol><li> Bevor die Milz Homogenisieren, injizieren sie mit 1 ml Kollagenase Typ IA in PBS bei 0,5 mg / ml und übertragen sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Inkubieren im Wasserbad bei 37 ° C für 15 min. Nach Waschen mit PBS, das Pellet in FACS-Puffer resuspendiert und 20 ul Maus CD11c magnetische Microbeads, anstelle von CD4 Microbeads hinzuzufügen. </li><li> Verwenden Sie eine MS Trennsäule und die entsprechenden Volumina: Spülen der Säule mit 1 ml FACS-Puffer; Die Zellen in 1 ml FACS-Puffer und wasche die Säule mit 1 ml FACS-Puffer dreimal. </li><li> Anzeiged Antigen der Wahl zu DCs (zB Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) aa 35-55 bei 20 ug / ml), gut mischen und Samen 5 x 10 4 Zellen in 100 &amp; mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Runden-Bottom Gut. </li><li> 1 x 10 5 T - Zellen in 100 &amp; mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Rundboden-gut am Ende, wie es in dem Protokoll für T - Zell - Isolierung beschrieben. </li></ol></li><li> Antigen-spezifische CD4 + T - Zell - Stimulation mit B - Zellen HINWEIS: Wenn B-Zellen als APCs verwendet werden, folgen Sie dem Protokoll für die T-Zell-Isolierung, mit folgenden Ausnahmen: <ol><li> Verwenden Milzen aus transgenen Mäusen , deren B - Zellen sind Antigen-spezifische ( zum Beispiel IgH MOG (Th) Mäuse, deren B - Zellen spezifisch erkennen MOG 35-55). </li><li> Verwenden antigen-spezifischen T - Zellen (zB von TCR MOG (2D2) -Mäuse). In 20 ul Maus CD19 magnetischen Mikrokügelchen anstelle von CD4-Mikrokügelchen. </li><li> Fügen Sie das Antigen der Wahl an die B cells (zB MOG 35-55 bei 20 ug / ml), gut mischen und Samen 5 x 10 4 Zellen in 100 &amp; mgr; l der B - Zellkulturmedium pro 96-Runden-bottom-gut. </li><li> 1 x 10 5 T - Zellen in 100 &amp; mgr; l der T - Zellkulturmedium pro 96-Runden-bottom-gut, wie es in dem Protokoll für T - Zell - Isolierung beschrieben. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Einrichten und Durchführen TEER Mess <ol><li> Legen Sie die 24-Well-Modul des TEER Instrument unter der Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie die Deckel und Platz Einsätze mit MBMECs im Gerät mit einer Pinzette. </li><li> Pipette 810 ml frisches Medium zu der unteren Kammer des Moduls Brunnen: fügen Sie es sorgfältig zwischen dem Einsatz und der Wand des Moduls gut. </li><li> Schließen Sie den Deckel und legen Sie das Gerät in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät an seinem Computer; schalten Sie die Gerätesteuerung und die Software öffnen. </li><li> Wählen Sie &quot;neue Messung&quot; im Pop-up-Fenster. Check &#39;show TEER &quot;und&quot; show CCL-Boxen; und drücken Sie dann &quot;Start&quot;. Nach der ersten Messung abgeschlossen, wählen Sie &quot;überprüfen Sie alle Brunnen&quot; in der Registerkarte &quot;Ergebnisse&quot; alle TEER und Ccl Werte zu sehen. </li><li> Speichern Sie die Datei: Datei&gt; Speichern unter&gt; &#39;den Namen der Datei&#39;. HINWEIS: Als TEER und Ccl kontinuierlich in einer automatisierten Weise gemessen werden, deren Werte über einen Zeitraum von drei bis fünf Tagen zu überwachen. Mediumwechsel ist nicht erforderlich, es sei denn, die Lebensfähigkeit der Zellen suboptimal ist, wie durch eine fehlende Zunahme in TEER visualisiert. </li><li> Wählen Sie den Zeitpunkt zu Kokultur MBMECs mit Zellen T , wenn Ccl stabil ist und weniger als 1 &amp; mgr; F / cm 2 und TEER seinen Maximalpegel erreicht. </li><li> inspizieren sorgfältig absolute TEER und Ccl Werte und schließen Sie die Vertiefungen, in denen MBMECs nicht konfluent genug Monolayern von unchecking solche Brunnen entwickelt haben. </li><li> Gruppe der Rest aus den Brunnen der rechten Maustaste auf ein gut und wählen Sie &quot;Add gut an neue durchschnittlich gut&quot;. Name es in dem Pop-up-Fenster; das gleiche für alle einzelnen Vertiefungen zu gruppieren. </li><li> Überprüfen Sie alle durchschnittlichen Brunnen, um zu bestätigen, dass sie alle haben die gleichen Ausgangsbedingungen vor der Co-Kultur. Wenn einige signifikant unterschiedliche absolute TEER-Werte haben oder TEER abfällt, oder die Standardfehler zu groß sind, wiederholen Sie die Gruppierung. HINWEIS: Die optimale Gruppierung von Brunnen bietet minimale Variation in TEER-Werte, sowohl innerhalb als auch zwischen den Versuchsgruppen. </li><li> Im &quot;Experiment&quot; Registerkarte, drücken Sie &quot;Pause&quot;, trennen Sie das Gerät und nehmen Sie es aus dem Inkubator. Entfernen Sie die Deckel unter der Laminar-Flow-Haube. </li><li> Vorbereitung voraktiviert und / oder naiven T-Zellen, mit oder ohne spezifische Cytokine, Antikörper oder andere Substanzen, wie gewünscht: Zum Beispiel: gereinigtes mischen NA / LE Ratten-anti-Maus-IFN-γ-Antikörper (Klon XGM1.2) mit vorbereiteten T Zellen bei 20 &amp; mgr; g / ml pro Vertiefung des TEER Instruments. HINWEIS: Wenn Substanzen wie Granzym B-Inhibitor verwendet werden, sind sie einzu T Zellkultur dded zu Beginn der T - Zell - Stimulation: zB Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) in einer Endkonzentration von 10 uM in DMSO mit isolierten T - Zellen gemischt. Siehe Materialien und Geräte für weitere Details. </li><li> Entfernen einen Teil des Mediums aus dem Einsatz (das obere Fach gut): zB vorsichtig pipettiert aus 150 ul (Entfernen all das Medium vermieden werden sollten , da sie die MBMEC einschichtigen stören könnte). </li><li> Hinzufügen T - Zellen zu MBMECs durch vorsichtiges Pipettieren von 150 ul Medium , enthaltend 2 x 10 5 Zellen / Insert. HINWEIS: Bei der Pre-aktivierte T-Zellen zu ernten, zählen nur Strahlen, Trypanblau-freien Zellen. </li><li> Schließen Sie den Deckel und legen Sie das Gerät wieder in den Inkubator. Schließen Sie das Gerät ein und drücken Sie &quot;Resume Messung&quot;. Nach 24 Stunden, drücken Sie &quot;Stop&quot; in der &quot;Experiment&quot; Registerkarte und speichern Sie die Datei (Datei&gt; Speichern). </li></ol> 5. Datenexport und statistische Analyse <ol><li>Exportieren Sie die Ergebnisse, indem Sie Datei&gt; Exportieren. </li><li> In der Registerkarte &quot;Einstellungen&quot; des Pop-up-Fenster, wählen Sie &quot;.dot&quot; in der &quot;Dezimaltrennzeichen&quot; -Option und &quot;Tabulator&quot; in der &quot;Feldtrennzeichen&quot; -Option. </li><li> In der &quot;Exportergebnisse&quot; Registerkarte benennen Sie die Datei, überprüfen Sie alle Brunnen exportiert werden, und überprüfen Sie die &quot;TEER&quot; und &quot;Ccl&quot; Boxen im &quot;wählen Daten&quot; aus. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Exportieren von Daten&quot;, öffnen Sie die exportierte Datei, und die Daten in eine Tabelle kopieren. </li><li> Normalisieren die exportierten Daten (durch jede Wiederholung sortiert, mit TEER und Ccl Werte für jeden Lauf (Messung gegeben)): Set TEER und Ccl Werte der letzten Zeitpunkt vor der Co-Kultur zu 100% und ändern entsprechend die Werte für alle anderen Läufe, bezogen auf die &#39;100%&#39; laufen. </li><li> Kopieren normalisierten Daten in eine Software der Wahl eines Graphen zu generieren, indem die einzelnen Vertiefungen und der Standardfehler des Mittelwerts für jede Behandlungsgruppe anzeigt. </li><li> Perform Zwei-Wege-ANOVA statistischen Test mit Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche, die Statistik-Software der Wahl. </li></ol>

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl and L. Klotz have nothing to disclose. H.-J. Galla is a scientific advisor of nanoAnalytics GmbH, the manufacturer of the automated cell monitor.

Mehrere Schritte des beschriebenen Protokolls sind unerlässlich für ein erfolgreiches Experiment. Während der anfänglichen MBMEC Isolierung und Kultur, ist es entscheidend, dass Arbeiten unter sterilen Bedingungen, so viel wie möglich durchgeführt, um die Kontamination der Zellkultur mit Pilzsporen oder Bakterien zu verhindern. Um eine reine Kultur von ECs zu erhalten, wird empfohlen , ein Medium , das Puromycin für die ersten drei Tage zu verwenden, die das Überleben von ECs ermöglicht, nicht aber andere Zellt...

Die Blut-Hirn - Schranke trennt den systemischen Kreislauf aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) von 1 bis 3. Es stellt eine physikalische Barriere, die die freie Bewegung von Zellen und die Diffusion von wasserlöslichen Molekülen und schützt das Gehirn vor Krankheitserregern und potenziell schädlichen Substanzen hemmt. Zusätzlich zu seiner Barrierefunktion ermöglicht die BBB die Abgabe von Sauerstoff und Nährstoffen an das Hirnparenchym, das einwandfreie Funktionieren des neuronalen Gewebes gewährleistet. Funktionelle Eigenschaften der BHS durch ihre zellulären und azellulären Komponenten stark reguliert, mit hochspezialisierten ECs sein Hauptstrukturelement zu sein. ECs der BBB sind durch die Anwesenheit von tight junction (TJ) -Komplexe, der Mangel an fenestrations, extrem niedrige pinocytic Aktivität und permanent aktive Transportmechanismen aus. Andere Komponenten des BBB die EG Basalmembran, pericytes Einbetten des Endothels, astrozytären Ende Füße und = zugehöriges parenchymal Basalmembran tragen auch zur Entwicklung, Wartung und Funktion der BHS 2,4 - 6 und zusammen mit Neuronen und Mikroglia, bilden die neurovaskuläre Einheit (NVU), das reibungslose Funktionieren des ZNS 7 ermöglicht - 9. In einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen, wie von neurodegenerativen, entzündlichen oder Infektionskrankheiten wird die Funktion der BBB 2,5,10 kompromittiert. Dysregulation von TJ Komplexe und molekulare Transportmechanismen führt BHS-Permeabilität, Leukozytenextravasation, Entzündungen und neuronaler Schädigung erhöht. Um BBB Eigenschaften unter solchen pathophysiologischen Bedingungen, verschiedene in vitro BBB Modelle wurden 9,11,12 etabliert haben zu studieren. Gemeinsam haben sie wertvolle Einblicke in die Veränderungen der Integrität der Barriere, Permeabilität sowie Transportmechanismen zur Verfügung gestellt. Diese Modelle beschäftigen Endothelzellen von Mensch, Maus, Ratte, Schwein oder bSchafen Ursprung 13-18; primären endothelialen Zellen oder Zelllinien kultiviert werden entweder als Monokultur oder zusammen mit Perizyten und / oder Astrozyten , um genauer die BBB in vivo 19 nachzuahmen - 25. In den letzten Jahren Messung der transendothelialen elektrische Widerstand (TEER) hat Eigenschaften 26,27 ein weithin akzeptiertes Werkzeug zur Beurteilung Endothelbarriere werden. TEER reflektiert die Impedanz für den Ionenfluss durch die Zellmonoschicht und die Abnahme ein empfindliches Maß für kompromittiert endothelialen Integrität der Barriere und damit eine erhöhte Durchlässigkeit. Verschiedene TEER Messsysteme wurden entwickelt, darunter Epithelial Cell (Evom), E - Zell-Substrat - Impedanz - Mess (ECIS) und Echtzeit - Zellanalyse 15,28 - 30. TEER reflektiert den Widerstand gegenüber der Ionenfluss zwischen benachbarten ECs (parazellulärer Weg) und ist direkt proportional zu derBarriere Integrität. In der Impedanzspektroskopie 27,31, komplexe Gesamtimpedanz (Z) gemessen wird , die durch die Messung Ccl zusätzliche Informationen über die Integrität der Barriere zur Verfügung stellt. CCL bezieht sich durch die Zellmembran (transzelluläre Route) mit dem kapazitiven Strom: die Zellschicht wirkt wie ein Kondensator in der elektrischen Ersatzschaltung, die Ladungen auf beiden Seiten der Membran trennt und ist umgekehrt proportional zu der Barrierenintegrität. Wenn auf durchlässigen Einsätzen gewachsen, haften ECs, vermehren und die mikroporöse Membran verteilt. Dies widersteht dem Hintergrund kapazitive Strom des Einsatzes (das sich wie ein Kondensator wirkt), und führt zu einer Abnahme in der Kapazität, bis er seinen minimalen Pegel erreicht. Dies wird durch die Errichtung von TJ gefolgt Komplexe, die Dichtung aus dem Raum zwischen benachbarten ECs. Dies beschränkt den Ionenfluss durch den parazellulären Weg und TEER erhöht, bis es seine Plateau erreicht. Unter entzündlichen Bedingungen wird jedoch die endothelial Barriere beeinträchtigt: TEER abnimmt, wenn TJ erhalten gestört Komplexen und Ccl zunimmt, wenn die kapazitive Komponente des Einsatzes wieder ansteigt. Unsere TEER Messung nutzt die automatisierte Zellenüberwachung 32 System: Es folgt dem Prinzip der Impedanzspektroskopie und erweitert seine bisherigen Anwendungen. Hier beschreiben wir ein in vitro BBB Modell, das die Untersuchung der Barriereeigenschaften ermöglicht, einschließlich der Interaktion von Hirn Endothel mit Immunzellen; insbesondere aktivierte T-Zellen. 37 - solche pathophysiologischen Bedingungen sind bei Autoimmunerkrankungen des ZNS, wie Multiple Sklerose und seine Tiermodell experimenteller Autoimmun - Enzephalomyelitis 33 beobachtet. Hierbei ist ein entscheidender Schritt ist die Transmigration von enzephalitogenen, Myelin-spezifischen T-Zellen über die BBB. Dies wird durch die Reaktivierung im perivaskulären Raum und den Eintritt in das Hirnparenchym gefolgt, wo sie rekrutieren andere Immunzellen und mirschen Entzündung und anschließender Demyelinisierung 1,35,38. Jedoch molekularen Mechanismen der Wechselwirkung zwischen diesen T-Zellen und Endothelzellen, die wichtigsten Bestandteile der BBB, sind nicht gut verstanden. Unser Protokoll zielt darauf ab , diese Lücke zu füllen und neue Erkenntnisse über die Auswirkungen auf die Endothelzellen (dh Barriere Integrität und Permeabilität) auf ihren direkten Kontakt und komplexe Zusammenspiel mit aktivierten T - Zellen geben. Das hier beschriebene Protokoll nutzt primäre Mausgehirn mikrovaskulären Endothelzellen, als eine Monoschicht auf durchlässigen Einsätzen mit mikroporösen Membranen gewachsen. Endotheliale Zellen co-kultiviert mit CD4 + T - Zellen, die voraktiviert entweder polyklonal oder in einer Antigen-spezifischen Art und Weise werden kann. Co-Kultur von MBMECs mit voraktivierten, aber nicht naiver T-Zellen induziert eine Abnahme der TEER und eine Zunahme in CCl, die ein quantitatives Maß für die Störung MBMEC Dysfunktion und Barriere bereitstellt. Die Technikist nicht-invasiv: es statt chopstick Elektroden Einbau-Anwendungen, die große Störung der EC-Monoschicht zu verhindern; es kann Barrierefunktion zu überwachen, ohne die Verwendung von Zellmarker verwendet werden. Es macht kontinuierliche Messungen in einer automatisierten Weise und ermöglicht eine unabhängige Beurteilung der beiden Sperrparameter (TEER und CCL) gleichzeitig über die Zeit. Das Verfahren ist auch empfindlich genug, um zwischen verschiedenen Ebenen der T-Zellaktivierung und Wirkungen solcher T-Zellen auf ECs zu unterscheiden. Es kann in einem weiten Bereich von funktionellen Assays verwendet werden: verschiedene Cytokine und / oder bei entzündlichen Prozessen beteiligt Chemokine können zur Kokultur von MBMECs und T-Zellen hinzugefügt werden; Antikörper gegen Zelladhäsionsmoleküle entweder auf der EC oder T-Zellenseite Blockierung kann verwendet werden; und Inhibitoren der T-Zellaktivierungsmarker oder ihrer zytolytischen Eigenschaften können während der T-Zell-Priming oder deren Co-Kultur mit ECs hinzugefügt werden. Der Test ist auch nützlich für die T-Zell-TransmigrationsAssays, da es als Qualitätskontrolle der MBMEC einschichtigen Integrität vor der Zugabe von T-Zellen dienen kann. All dies macht diese Methode ein vielseitiges und zuverlässiges Werkzeug , um die BBB in vitro zu studieren, mit einem Fokus auf die Wirkung von aktivierten T - Zellen , die auf EC einschichtigen Integrität. Dies ist von besonderer Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen der BBB Störung in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise MS und ihre EAE-Tiermodell, wo selbstreaktive, enzephalitogenen T-Zellen, die BBB durchqueren und Entzündungen und neuronalen Schäden führen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>cellZscope</td>
			<td>nanoAnalytics GmbH</td>
			<td>www.nanoanalytics.com</td>
			<td>including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
			<td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>www.beckmancoulter.com</td>
			<td>for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo7.6.5 software</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td>www.flowjo.com</td>
			<td>for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 ml; for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell membrane inserts - pore size 0.4 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>for TEER measurement as the main readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell membrane inserts - pore size 3 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650 180</td>
			<td>flat-bottom; for MBMEC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td>round-bottom; for immune cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td>for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>MF-0640010</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for T cell and B cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD4 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td>for CD4+ T cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD19 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-201</td>
			<td>for B cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD11c MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-001</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>for MBMEC coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td>for MBMEC coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2 (CSL2)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase (C/D)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11097113001</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644-1L</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (+ GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>for MBMEC and immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>for MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>for MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td>for MBMEC culture medium; only for the first three days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>for harvesting MBMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9891</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM + 1% L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21980-032</td>
			<td>for T cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418Q</td>
			<td>protect from light; for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse MOG35&#8212;55 peptide</td>
			<td>Biotrend</td>
			<td>BP0328</td>
			<td>for antigen-specific T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD3 Ab</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100302</td>
			<td>clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553294</td>
			<td>clone 37.51; for polyclonal T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05</td>
			<td>for T-cell transmigration assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td>for T-cell transmigration assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&#947; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554408</td>
			<td>clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granzyme B Inhibitor II</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>368055</td>
			<td>recommended final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116005</td>
			<td>clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Abbildung 1 gibt eine allgemeine Übersicht über die in vitro - Modell BBB die Wechselwirkung zwischen T - Zellen und Endothel - Zellen zu untersuchen verwendet. Das Experiment besteht aus drei Hauptschritten. Der erste Schritt ist die Isolierung von primären MBMECs aus Gehirnrinden, und ihre Kultur für fünf Tage. Wenn sie Konfluenz in der Zellkulturplatte zu erreichen, werden auf MBMECs permeablen Einsätzen trypsinisiert und reseeded, die in der TEER Instr...

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An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

11.1K Aufrufe.  University Hospital Münster. Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Serie: An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Entwicklung eines<em&gt; In vitro</em&gt; Modellsystem für die Untersuchung der Wechselwirkung von<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE mit seinen hochaffinen Rezeptors FcsRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.