Name: an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction
Uploaded: 2016-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
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私たちは、TEERの測定に関する有用な議論のためのアニカEngbers及びそれらの優れた技術サポートのためのフランク・クルトと博士はマーカス・シェーファー（nanoAnalytics GmbH社）に感謝しています。この作品は、ドイツ学術協会（DFG）によってサポートされていました、HWとLKへSFB1009プロジェクトA03、CRC TR128は、A08を投影します。 LKにZ1とB01 LKとHWに、臨床研究のための学際センター（ミュンスターの医学部）認可番号KL2 / 14分の2015。

動物のケアのためのドイツのガイドラインに従って、すべての実験のために、マウスを交配したとミュンスター大学の中央動物施設における特定の病原体を含まない条件下で維持しました。全ての実験は、動物実験倫理委員会のガイドラインに従って行われ、ノルトライン=ヴェストファーレン州、ドイツ（LANUV、AZ 84-02.05.20.12.217）の地方当局によって承認されました。 1. MBMEC単離および培養注：以前に以下のように変更して詳細14に記載されているようにMBMECsを分離： <ol><li> CO 2吸入によって20成人（6〜8週齢）C57BL / 6マウスを生け贄に捧げる、心と呼吸停止を確認することによって彼らの死を確認します。 </li><li> 70％エタノールでマウスをすすぎ、はさみを使用してそれを刎ねます。ピンセットやハサミを使って頭皮を削除します。大後頭孔から出発し、頭蓋骨の左側と右側の切開を行います。その尾側とTAKから頭蓋骨を持ち上げ鉗子で脳を電子。 </li><li>層流フードの下では、唯一の皮質を保ち、ペトリ皿に脳を置き、脳幹、小脳、及び視床を除去するために滅菌ピンセットを使用しています。 注：顕微鏡の使用は、これらのステップのいずれかのために必要ではありません。 </li><li>無菌ウェスタンブロッティング一枚の紙の上に皮質を置き、髄膜が見えなくなるまでピンセットで軽く転がしていません。 </li><li> （プロトコル14以下）機械的および酵素消化した後、長い間、滅菌針と5ミリリットルのプランジャーを使用して密度勾配から内皮細胞を収集します。内皮細胞は、赤血球と赤いリング上記の濁った層として表示されます。新しい50ミリリットルの遠心分離管に、この層20〜25ミリリットル転送。 DMEMでチューブをトップアップ。 </li><li>洗濯14 2ラウンドの後、ピューロマイシンを含むMBMEC培地（4 / mlの）の6ミリリットル中に細胞を再懸濁し、24ウェルプレートの6コーティングされたウェル上にそれらをシード。組織でそれらを残します3日間（ここでは上から「インキュベータ」という）37℃、5％CO 2で培養インキュベーター。 注：MBMEC塗布液の詳細については、 材料表を参照してください。 </li><li>ピューロマイシンを含まない新鮮なMBMEC媒体の各ウェルに1ミリリットルを追加することで、メディアを変更します。 2日以上のために戻って37℃、5％CO 2のプレートを置きます。 </li></ol> 2.収穫MBMECs <ol><li> MBMEC分離後の5日目、MBMECコーティング溶液でプレコート透過性インサートは：3時間インサートあたりの溶液80μlを添加し、37℃でそれらを残す、5％CO 2。 </li><li>慎重にコーティング溶液をピペットし、30分間のインサートの空気乾燥をしましょう。培地を洗浄するためにMBMECsを使用して、プレートの各ウェルに室温（RT）PBSの2ミリリットルを追加します。この手順を繰り返します。 0.05％トリプシン-EDTA（ウェルあたり300μl）を加え、5〜10分間インキュベーターでプレートを残します。 </li><li>停止するために各ウェルにMBMEC培地2mlを追加トリプシン処理。 15ミリリットルの遠心分離管に採取した細胞を移し、4℃で8分間、700×gで、それらを遠心分離します。上清を捨て、ピューロマイシンなしMBMEC培地1mlに細胞を懸濁します。 </li><li>細胞を数えます。 0.04％トリパンブルー（細胞の10倍希釈）の90μlの10μlの細胞懸濁液を混ぜます。ピペットガラスカバーと細胞計数室（血球計数器）の間、この混合物10μl。チャンバー（N）のすべての4つの象限でのトリパンブルーを含まない細胞をカウントし、カウントした細胞（N &#39;）の平均数を決定し、次のように：N&#39; = N / 4。 </li><li> C = N 10 4は、血球計算板の寸法によって与えられ、10は、ステップ2.4からの希釈係数である「×10 4×10、次の式を用いて（10 6細胞/ ml）で細胞濃度を計算します。 </li><li>シードインサートあたり260μlの量の2×10 4個の細胞。各ウェルの下部コンパートメントにMBMEC媒体の810μLを追加。セクション4を続行する準備ができるまでインキュベーター中に挿入して、プレートを置きます。 注：上部と下部コンパートメントのためのボリュームが挿入に固有のものであり、全ての24ウェルフォーマットには対応していません。 </li></ol> 3. CD4 + T細胞の単離と刺激<ol><li> CD4 + T細胞の単離<ol><li> CO 2吸入によって（6〜8週齢）1成体マウスを犠牲にし、心臓や呼吸停止を確認することによって、その死を確認します。 </li><li>きれいな解剖ボード上の背中の上でマウスを置き、70％エタノールでそれを洗い流し;腹膜を開き、脾臓およびリンパ節（鼠径部、腋窩、上腕および子宮頸部）を除去し、滅菌ハサミやピンセットを使用します。最後に、氷上で5mlのPBSを含む15ミリリットルの遠心分離管に組織を移します。 </li><li>層流フードの下で、上に70μmのセルストレーナーで50ml遠心チューブに組織を含むPBSをデカントすることにより、組織を移します。均質化しますストレーナを介して1ミリリットルプランジャとそれを押すことによって組織。 </li><li> FACS緩衝液30 mlを加え、4℃で5分間、500×gでそれを遠心。上清を捨て、FACS緩衝液10mlに細胞を再懸濁。チューブにFACS緩衝液の別の20ミリリットルを追加し、40μmのセルストレーナーを介してサスペンションをフィルタリングします。 </li><li> 4℃で5分間、500×gでそれを遠心。上清を捨て、FACS緩衝液500μlの中に細胞を懸濁します。 </li><li> 、マウスCD4磁気マイクロビーズの20μl加えよく混ぜ、4℃で15分間インキュベートします。 FACS緩衝液25 mlを加え、4℃で5分間、500×gでそれを遠心。 </li><li>一方、磁石にLS分離カラムを配置し、FACS緩衝液3mlでそれをすすぎます。上清を捨て、FACS緩衝液3mlに細胞を再懸濁。 </li><li>列にセルを追加します。 FACS緩衝液3mlの3回でカラムを洗浄します。磁石から列を削除し、新しい15ミリリットルセントリの上に置きますfugationチューブ。 、FACS緩衝液5mlを加えることは、5分、4℃、500×gで列プランジャと遠心分離機で標識された細胞を洗い流します。 </li><li>上清を捨て、T細胞培地3mlに細胞を再懸濁。ウェル当たり100μlの培地で2.4および種子1×10 5細胞で説明したように細胞をカウントします。 </li></ol></li><li> CD4 + T細胞刺激<ol><li>ポリクローナルCD4 + T細胞刺激<ol><li>精製抗マウスCD3抗体でプレコート丸底96ウェルプレート（クローン145-2C11）を、PBS中で、所望の最終濃度。たとえば、を1μg/ mlのα-CD3でフルプレートをコートを事前にPBS 5mlで抗体（ストック濃度= 0.5 mg / mlで）を10μlを混合し、ボルテックスとにミックス50μlのを追加マルチチャンネルピペットで各ウェル。 </li><li> 3時間インキュベーターでプレートを残します。 T細胞を単離した後、PBSで2回予備コーティングされたプレートを洗浄します。 （クローン精製した抗CD28抗体を追加します。1μg/ mlの所望の最終濃度（ 例えば、）で単離されたT細胞の37.51）。よく混ぜます。 T細胞に接種し、2〜3日間インキュベーターでそれらを残します。 </li></ol></li><li>樹状細胞（DC）による抗原特異的CD4 + T細胞刺激 注：DCは、抗原提示細胞（APC）として使用される場合、これらの例外を除いて、T細胞の単離のためのプロトコルに従います。 <ol><li>脾臓を均質化する前に、0.5 mg / mlとなるようにPBS中のコラゲナーゼタイプIAの1ミリリットルでそれを注入し、15ミリリットルの遠心チューブに移します。 </li><li> 15分間37℃の水浴中でインキュベートします。 PBSで洗浄した後、FACS緩衝液中にペレットを再懸濁し、代わりにCD4マイクロビーズの、マウスのCD11c磁性マイクロビーズの20μlを添加します。 </li><li> MS分離カラムと適切なボリュームを使用：FACS緩衝液1mlでカラムをすすぎます。 FACS緩衝液1mlで再懸濁細胞およびFACS緩衝液1mlの3回カラムを洗浄。 </li><li>広告樹状細胞（ 例えば 、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）のaa 35-55 20時/ mlの）に選択のD抗原は、よく混ぜシード5×10 4細胞のT細胞培養培地100μl中あたり96ラウンドボトムよく。 </li><li> T細胞の単離のためのプロトコルに記載のように、最後に96丸底ウェルあたりのT細胞培養培地100μl中1×10 5 T細胞を加えます。 </li></ol></li><li> B細胞と抗原特異的CD4 + T細胞刺激 注：B細胞をAPCとして使用される場合、これらの例外を除いて、T細胞の単離のためのプロトコルに従います。 <ol><li> B細胞の抗原特異的（B細胞特異的にMOG 35-55を認識例えば、IgH遺伝子MOG（TH）マウス、）トランスジェニックマウスからの脾臓を使用してください。 </li><li> （TCR MOG（2D2）マウスから、例えば ）抗原特異的T細胞を使用してください。マウスCD19磁気マイクロビーズの代わりにCD4マイクロビーズの20μlを添加します。 </li><li> Bのセルに選択した抗原を追加します。lsが（ 例えば 、20μgの/ mlのMOG 35-55）は 、96丸底ウェルあたりのB細胞培養培地100μl中5×10 4個の細胞をよく混ぜ、種。 </li><li> T細胞の単離のためのプロトコルに記載されるように、96丸底ウェルあたりのT細胞培養培地100μl中1×10 5 T細胞を加えます。 </li></ol></li></ol></li></ol> 4.設定とTEER測定を行います<ol><li>層流フードの下でTEER機器の24ウェルモジュールを配置します。ふたを外し、ピンセットを用いて、機器にMBMECsでインサートを配置します。 </li><li>モジュールウェルの下部コンパートメントに新鮮な培地810μLをピペット：インサートとよくモジュールの壁との間に慎重にそれを追加します。 </li><li>蓋を閉じ、インキュベーター内に配置してください。そのコンピュータに楽器を接続します。機器コントローラをオンにしてソフトウェアを開きます。 </li><li>ポップアップウィンドウで「新たな計測」を選択します。チェCK &#39;ショーTEER&#39;と &#39;ショーCCL」ボックス。その後、「開始」を押してください。最初の測定を完了した後、すべてのTEERとCCLの値を参照するには、「結果」タブで「すべてのウェルをチェック」を選択します。 </li><li> 「ファイル名 &#39;&gt;名前を付けて保存&gt;ファイル：ファイルを保存します。 注：TEERとCCLを連続的に自動化された方法で測定されたように、3〜5日の期間にわたってその値を監視します。 TEERの増加の欠如によって可視化されるように、細胞生存率は、次善のでない限り、培地を変更することは、必要ありません。 </li><li> CCLは安定であり、より低い1μF/ cm 2であり、TEERが最大レベルに達した時点をT細胞とする共培養MBMECsを選択します。 </li><li>慎重に絶対TEERとCCLの値を検査し、MBMECsは、このような井戸をオフにしてコンフルエントに十分な単層を発症していないいる井戸を除外します。 </li><li>グループ井戸の残り：よく上で右クリックし、「新しい平均のウェルにも追加」を選択します。ナムポップアップウィンドウでそれを電子。すべての個々のウェルをグループ化するために同じことを行います。 </li><li>それらのすべてが共培養する前に、同じ初期条件を持っていることを確認するために、すべての平均井戸を確認してください。いくつかの著しく異なる絶対TEER値を有するか、TEERが傾斜、または標準誤差が大きすぎる場合は、グループ化をやり直します。 注：井戸の最適なグループ分けは、実験群内および間の両方、TEER値の最小の変化を提供します。 </li><li> 「実験」タブを押して「一時停止」で、楽器を切断し、インキュベーターの外にそれを取ります。層流フードの下蓋を外します。 </li><li>所望のように、特定のサイトカイン、抗体または他の物質の有無にかかわらず、予備活性化および/またはナイーブT細胞を準備します。たとえば、次のように精製されたNA / LEラットを混在抗マウスIFN-γ抗体（クローンXGM1.2）準備されたTとTEER器具のウェルに20μg/ mlの細胞。 注：このようなグランザイムB阻害剤のような物質が使用される場合、それらはT細胞刺激の開始時にT細胞培養にdded： 例えば 、グランザイムB阻害剤II（Calbiochem社）をDMSO中に10μMの最終濃度で、単離されたT細胞と混合されます。詳細については、材料および装置を参照してください。 </li><li>インサートから培地（上部ウェルコンパートメント）の一部を削除します。（それはMBMEC単層を乱す可能性があるので、すべての媒体は避けるべきで除去） など 、慎重に150μlをピペット。 </li><li>慎重に2×10 5細胞/インサートを含む培地150μlのピペッティングすることによってMBMECsにT細胞を追加します。 注：前活性化T細胞を採取する場合、唯一のブラスト、トリパンブルーを含まない細胞をカウントします。 </li><li>蓋を閉じて、バックインキュベーターに配置してください。楽器を押す「リジューム測定 &#39;を再接続します。 24時間後「実験」タブで、を押して「停止」して、ファイル（ファイル]&gt; [保存]）を保存します。 </li></ol> 5.データのエクスポートと統計解析<ol><li>[ファイル]&gt; [エクスポート]を選択して、結果をエクスポートします。 </li><li>ポップアップウィンドウの「設定」タブで、「フィールド区切り文字」オプションの「桁区切り記号」オプションと「タブ」の「の.dot」を選択します。 </li><li> 「エクスポート結果」タブでは、ファイルに名前を付けるエクスポートするすべてのウェルをチェックし、「データを選択」オプションで「TEER」と「CCL」チェックボックスをオンにします。 </li><li>押して「エクスポートデータは、「エクスポートされたファイルを開き、スプレッドシートにデータをコピーします。 </li><li> （各によってソートされた各ラン（測定）のために与えられたTEERとCCLの値で、複製）エクスポートされたデータを正規化：100％の共培養前の最後の時点のTEERとCCL値を設定し、それに応じて他のすべての値を変更「100％」のランの相対動作し、。 </li><li>個々のウェルを使用し、各処置群について平均値の標準誤差を表示し、グラフを生成するために選択したソフトウェアに正規化されたデータをコピーします。 </li><li> P選択肢の統計ソフトウェアを使用して、多重比較のためのボンフェローニ補正で双方向ANOVA統計検定をerform。 </li></ol>

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl and L. Klotz have nothing to disclose. H.-J. Galla is a scientific advisor of nanoAnalytics GmbH, the manufacturer of the automated cell monitor.

記載されたプロトコルのいくつかのステップが成功した実験のために不可欠です。初期MBMEC単離および培養の間、仕事を真菌胞子または細菌を細胞培養物の汚染を防止するために、可能な限り無菌条件下で行われることが重要です。 ECの純粋な培養物を得るためには、41,42（特に、周皮細胞）、他の細胞型ECの生存を可能にする最初の3日間、ピューロマイシンを含有する培地を使用す?...

3 -血液脳関門は、中枢神経系（CNS）1から全身循環を分離します。それは、細胞の自由な移動と水溶性の分子の拡散を抑制し、病原体および潜在的に有害な物質から脳を保護する物理的障壁を提供します。そのバリア機能に加えて、BBBは、神経組織の適切な機能を確実に脳実質に酸素や栄養素の配信を可能にします。 BBBの機能特性は、高度に専門性の高い電気部品は、その主要構成要素であると、その細胞および無細胞成分によって規制されています。 BBBの電気部品は、タイトジャンクション（TJ）錯体、開窓の欠如、非常に低いピノサイトーシスの活動、および恒久的に能動輸送機構が存在することを特徴とします。 BBBの他の成分EC基底膜、内皮を埋め込む周皮細胞、アストロサイトのエンドフィート=関連するパーenchymal基底膜はまた、BBB 2,4の開発、保守および機能に寄与- 6と、一緒にニューロンおよびミクログリアで、CNS 7を適切に機能可能に神経血管ユニット（NVU）、形成- 9。 このような神経変性、炎症や感染症などの神経疾患、種々のでは、BBBの機能が2,5,10損なわれています。 TJ複合体および分子輸送機構の調節不全は、BBBの透過性、白血球の血管外遊出、炎症および神経損傷の増加につながります。そのような病態生理学的条件下で、BBBの特性を研究するために、様々なインビトロ BBBモデルは9,11,12が確立されています。彼らは一緒に障壁の完全性、透過性だけでなく、輸送機構の変化に貴重な洞察を提供してきました。これらのモデルは、ヒト、マウス、ラット、ブタまたはBの内皮細胞を用いますヒツジの原点13から18; 25 -初代内皮細胞または細胞株は、モノカルチャーとして、あるいは一緒に生体内 19 でより密接にBBBを模倣するために、周皮細胞および/またはアストロサイトのいずれかで培養されます。近年では、経内皮電気抵抗（TEER）の測定は、内皮バリア特性26,27を評価するための広く受け入れられているツールとなっています。 TEERは、細胞単層を横切るイオンフラックスに対するインピーダンスを反映し、その減少が損なわ内皮障壁の完全性、したがって透過性の増大の敏感な尺度を提供します。 30 -様々なTEER測定システムは、上皮Voltohmmeter（EVOM）、電気細胞-基質インピーダンスセンシング（ECIS）、リアルタイム細胞解析15,28を含む、開発されてきました。 TEERは、隣接するECの間のイオンフラックス（傍細胞経路）に対する抵抗性を反映し、に直接比例しています関門の完全性。インピーダンス分光法27,31においては、複素合計インピーダンス（Z）は、CCLを測定することによって、障壁の完全性についての追加情報を提供する、測定されます。 CCLは、細胞膜（経細胞経路）を介して容量性電流に関する：細胞層は、膜の両側での電荷分離、等価電気回路におけるコンデンサと同様に機能し、障壁の完全性に反比例します。透過性インサート上で成長させた場合には、ECが、付着増殖し、微多孔膜に広がります。これは、（それ自体がコンデンサのように作用する）のインサートのバックグラウンド容量性電流に抵抗し、その最低レベルに達するまでの容量の低下を招きます。これは、TJの確立隣接する電気部品との間のスペースからそのシールを複合体が続いています。これは、傍細胞経路を介してイオン流束を制限し、そしてそれがそのプラトーに達するまでTEERが増加します。炎症状態下で、しかし、endotheliアル障壁が侵害された：TJが破壊を取得複合体およびインサートの容量成分が再び上昇するとCCLが増加するにつれて、TEERは減少します。 私たちのTEERの測定は、自動化されたセル監視32システムを使用しています。それは、インピーダンス分光法の原理に従っており、その前のアプリケーションを拡張します。ここでは、免疫細胞と脳内皮の相互作用を含むバリア性の研究を可能にインビトロ BBBモデルを記述します。特に、T細胞を活性化します。 37 -このような病態生理学的状態は、多発性硬化症およびその動物モデルの実験的自己免疫性脳脊髄炎33のようなCNSの自己免疫疾患において観察されます。ここで、重要なステップは、BBBを横切る脳炎誘発性、ミエリン特異的T細胞の遊出があります。これは、それらが他の免疫細胞を動員し、私血管周囲空間と脳実質への参入、中にそれらの再活性化が続いていますdiate炎症およびその後の脱髄1,35,38。しかしながら、このようなT細胞と内皮細胞との相互作用の分子機構は、BBBの主な成分は、よく理解されていません。私たちのプロトコルは、このギャップを埋め、活性化T細胞との直接接触との複雑な相互作用の際に内皮細胞（ すなわち、障壁の完全性と透過性）に影響新たな洞察を与えることを目指しています。 ここで説明するプロトコルは、微多孔膜と通気性のインサート上の単層として成長した初代マウス脳微小血管内皮細胞を利用します。内皮細胞を、ポリクローナルまたは抗原特異的な様式で予備活性化することができるCD4 + T細胞と共培養されます。予め活性化とMBMECsの共培養ではなく、ナイーブT細胞TEERの低下やMBMEC機能障害およびバリア破壊の定量的な尺度を提供するCCLの増加を誘導します。技術非侵襲的である：それは、EC単層の主要な乱れを防ぐビルトインの代わりに箸電極を、使用しています。細胞マーカーを使用することなく、バリア機能を監視するために使用することができます。これは、自動化された方法で連続測定を行うと同時に、時間をかけて2バリアパラメータ（TEERとCCL）の独立した評価を可能にします。この方法はまた、別のT細胞活性化のレベルとのECのようなT細胞の効果を区別するのに十分な感度です。 これは、機能的アッセイの広い範囲で使用することができる：炎症プロセスに関与する種々のサイトカインおよび/またはケモカインはMBMECs及びT細胞の共培養物に添加することができます。 ECまたはT細胞側のいずれかの細胞接着分子に対するブロッキング抗体を使用することができます。およびT細胞活性化マーカーの、またはそれらの細胞傷害特性の阻害剤は、T細胞プライミングまたは電気部品との共培養の間に添加することができます。アッセイはまた、T細胞の遊出するのに便利ですこれはT細胞の添加前にMBMEC単層の完全性の品質管理としての役割を果たすことができるようにアッセイ。このすべてが、この方法EC単層の完全性に活性化T細胞の効果に焦点を当てて、in vitroで BBBを研究するための汎用性と信頼性の高いツールになります。これは、自己反応、脳炎誘発性T細胞がBBBを横断し、炎症および神経損傷を引き起こすMS、その動物モデルEAEなどの自己免疫疾患の病因にBBB破壊のメカニズムを理解するために特に重要です。

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com</td><td>including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>FlowJo7.6.5 software</td><td>Tree Star</td><td>www.flowjo.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 ml; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 0.4 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>for TEER measurement as the main readout</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 3 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay</td></tr><tr><td>24-well cell culture plate</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>flat-bottom; for MBMEC culture</td></tr><tr><td>96-well cell culture plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>round-bottom; for immune cell culture</td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns</td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns</td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS LS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>for T cell and B cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD4 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td>for CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD19 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>for B cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Collagen type IV from human placenta</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Fibronectin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Collagenase 2 (CSL2)</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase (C/D)</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DMEM (+ GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>for MBMEC and immune cell isolation</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>for MBMEC culture medium; only for the first three days</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>for harvesting MBMECs</td></tr><tr><td>Collagenase Type IA</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>IMDM + 1% L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>for T cell culture medium</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE04-418Q</td><td>protect from light; for B cell culture medium</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>mouse MOG&lt;sub&gt;35&amp;mdash;55 &lt;/sub&gt;peptide</td><td>Biotrend</td><td>BP0328</td><td>for antigen-specific T cell activation</td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD3 Ab</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>clone 37.51; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>Recombinant Murine IFN-&amp;gamma;</td><td>PeproTech</td><td>315-05</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>Recombinant Murine TNF-&amp;alpha;</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&amp;gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Granzyme B Inhibitor II</td><td>Calbiochem</td><td>368055</td><td>recommended final concentration: 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD4 antibody</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration</td></tr></tbody></table>

an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

図1は、T細胞および内皮細胞間の相互作用を研究するために使用されるのin vitro BBBモデルの一般的な概要を提供します。実験は、次の3つの主要手順で構成されています。最初のステップは、脳皮質からの一次MBMECsの単離、および5日間彼らの文化です。それらは、細胞培養プレート中でコンフルエンスに達したとき、MBMECsをトリプシン処理し、次い...

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An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

11.2K ビュー.  University Hospital Münster. Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

ビデオ: An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

医学

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

免疫・感染学

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイス モデル

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

神経科学

免疫蛍光染色による血液脳関門モデルの解析

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

著者スポットライト:ヒト組織研究のための組織チップ技術の使用の促進 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

生物工学

細胞バリアの完全性を評価するための経内皮抵抗測定

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

著者スポットライト:細胞バリアの完全性を評価するためのTEER検出の応用 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

アン

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使用してリンパ球血管外漏出の分析

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイスモデル

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

経内皮電気抵抗検出による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

経内皮電気抵抗検出による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

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体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイス モデル

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイスモデル

経内皮電気抵抗検出による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

経内皮電気抵抗検出による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

経内皮電気抵抗検出による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録