Biz TEER ölçümlerine ilişkin yararlı tartışmalar için Annika ENGBERS ve mükemmel teknik destek için Frank Kurth ve Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) minnettarız. Bu çalışma, HW ve LK, CRC TR128, için SFB1009 proje A03 A08 projeleri Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenmiştir; Z1 ve B01 LK ve LK HW ve (Münster Tıp Fakültesi) Klinik Araştırma Disiplinlerarası Merkezi hibe sayısı Kl2 / 2015/14 için.

hayvan bakımı Alman kurallarına göre tüm deneyler için, fareler yetiştirilmiş ve Münster University merkezi bir hayvan tesisine spesifik patojenden serbest durumlar altında tutulur. Bütün deneyler hayvan deneylerinin etik komitenin kurallarına göre yapılır ve Kuzey Ren-Vestfalya, Almanya (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) yerel otoriteler tarafından kabul edildi. 1. MBMEC İzolasyon ve Kültürü Not: Daha önce şu değişiklikler detaylı 14&#39;de anlatıldığı gibi MBMECs izole: <ol><li> CO 2 inhalasyon yoluyla (6-8 haftalık) 20 yetişkin C57BL / 6 fareler kurban ve kalp ve solunum arrest araştırarak onların ölümünü onaylayın. </li><li> % 70 etanol ile fare durulayın ve makas kullanarak başını kesmek; forseps ve makas kullanılarak kafa derisi çıkarın. foramen magnum başlayarak, kafatasının sol ve sağ tarafında kesiler olun. onun kuyruk tarafı ve tak gelen kafatası kaldırınforseps ile beyin dışarı e. </li><li> Laminer akış kaputu altında, sadece korteks tutarak, bir Petri kabındaki beyin yerleştirin ve beyin sapı, beyincik ve talamus kaldırmak için steril forseps kullanabilir. NOT: Bir mikroskop kullanımı, bu herhangi bir aşaması için gerekli değildir. </li><li> Steril Western lekeleme bir kağıt parçası üzerine korteksi yerleştirin ve meninks artık görünür olana kadar forseps ile yavaşça yuvarlayın. </li><li> (Protokol 14 Aşağıdaki) mekanik ve enzimatik sindirimden sonra, uzun, steril bir iğne ve 5 mi piston kullanılarak yoğunluk gradyanı endotel hücreleri toplamak. Endotel hücreleri eritrositler ile kırmızı halka üzerinde bir karanlık bir tabaka olarak görünür. Yeni 50 mi santrifüj tüpe bu katmanın devri 20-25 mi; DMEM ile tüp kontör. </li><li> Yıkama 14 iki tur sonra, puromisin içeren MBMEC ortamında (4 ug / ml), 6 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 24 oyuklu plaka altı kaplanmış oyuklarına üzerine onları tohum; bir dokuda onları terk37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 kültür inkübatörü üç gün (buradan itibaren &quot;kuluçka&quot; olarak adlandırılır). NOT: MBMEC kaplama çözeltisinin ayrıntılar için Malzemeler Tablosuna bakınız. </li><li> Puromisinin olmayan, taze MBMEC ortam, her sıra için, 1 ml ilave edilerek orta değiştirme; iki gün daha geri 37 ° C ve% 5 CO2 de tabak koydu. </li></ol> 2. Hasat MBMECs <ol><li> MBMEC izolasyondan sonra Beşinci günde MBMEC kaplama solüsyonu ile ön kaplama geçirgen eklerde: uç başına çözeltisi 80 ul ilave edin ve 3 saat boyunca CO2 37 ° C&#39;de bırakmak ve% 5. </li><li> Dikkatle kaplama çözüm pipet ve 30 dakika boyunca ekler hava kurumaya bırakın. orta yıkamak MBMECs kullanılarak plaka her oda sıcaklığında 2 ml (RT) PBS ilave et; bu adımı tekrarlayın. % 0.05 tripsin-EDTA (oyuk başına 300 ul) ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca inkübatör plaka bırakın. </li><li> durdurmak için her bir oyuğa MBMEC orta 2 ml ilave edilirtrypsinization. 15 ml santrifüj tüpüne hücreler toplandı aktarın ve 4 ° C &#39;de 8 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüj. Süpernatantı atın ve Puromisinin olmadan MBMEC orta 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Hücreleri saymak; % 0.04 tripan mavi 90 ul (hücre 10x seyreltme) hücre süspansiyonu 10 ul karıştırın. Pipet cam kapak ve hücre sayım odasına (hemositometre) arasındaki bu karışımı 10 ul. odanın (N), dört çeyrek Tripan Mavisi içermeyen hücrelerin sayısı ve sayılan hücrelerin (N &quot;) &#39;nin ortalama sayısını belirlemek aşağıdaki gibidir: K&#39; = K / 4. </li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak (10 6 hücre / ml), hücre konsantrasyonu hesaplanır: C = N x 10 4 hemasitometre boyutlarıyla verildi ve 10 adım 2.4 seyreltme faktörüdür 10 x 10 4,. </li><li> Tohum uç başına 260 ul&#39;lik bir hacim içinde 2 x 10 4 hücre. her bir alt bölmeye MBMEC ortamının 810 ul ekle. bölüm 4 ile devam etmek için hazır olana kadar inkübatör ekler ile plaka koyun. NOT: Üst ve alt bölüm için hacimleri insert spesifik ve tüm 24-kuyu biçimleri için işe yaramaz. </li></ol> 3. CD4 + T hücre izolasyonu ve Uyarım <ol><li> CD4 + T hücre Isolation <ol><li> CO 2 inhalasyon yoluyla (6-8 haftalık) bir yetişkin fare Kurban ve kalp ve solunum arrest ascertaining ederek ölüme onaylayın. </li><li> Temiz bir diseksiyon gemide sırtında fare yerleştirin ve% 70 etanol ile durulayın; dalak ve lenf nodları (inguinal, koltuk altı, brakiyal ve rahim ağzı) periton açıp kaldırmak için steril makas ve forseps kullanabilir; Son olarak, buz üzerinde 5 ml PBS içeren 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne doku aktarın. </li><li> Laminer akış Kaputun altında, üstünde bir 70 mikron hücre süzgecinden ile 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne doku ile PBS boşaltılarak doku transferi; homojenleştirmeksüzgecinden 1 ml pistonu ile bastırarak dokusudur. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de FACS tamponu ve santrifüj bunu 30 ml ekleyin. Süpernatant atılır ve FACS tamponu, 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri. tüp FACS tampon diğer 20 ml ekleyin, 40 mikron hücre süzgecinden süspansiyon filtre. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de o santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve FACS tampon 500 ul hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Fare CD4 manyetik mikro boncuklar 20 ul ekle karıştırın ve 4 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de FACS tamponu ve santrifüj bunu 25 mL ekleyin. </li><li> Bu süre zarfında, mıknatıs bir LS ayırma sütunu yerleştirin ve FACS tamponu 3 ml ile durulayın. Süpernatant atılır ve FACS tamponu, 3 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> sütun hücreleri ekleyin. üç kez FACS tamponu 3 ml sütun yıkayın. mıknatıstan sütunu kaldırmak ve yeni bir 15 ml merkezkaç üzerine yerleştirinfugation tüp. FACS tampon 5 ml ekleyin 5 dakika 4 ° C için 500 xg&#39;de sütun piston ve santrifüj onu etiketli hücreleri yıkayın. </li><li> Süpernatant atılır ve T hücre ortamının 3 ml tekrar süspansiyon hücreleri. Oyuk başına ortam 100 ul 2.4 ve tohum 1 x 10 5 hücre tarif edildiği gibi hücre sayımı. </li></ol></li><li> CD4 + T hücre uyarımı <ol><li> Poliklonal CD4 + T hücre uyarımı <ol><li> Ön kaplama, istenen nihai konsantrasyonda saflaştınlmış anti-fare CD3 antikoru PBS (klon 145-2C11), bir yuvarlak dipli 96 oyuklu plaka. Örneğin, 1 ug / ml&#39;de α-CD3 ile tam plaka ön kaplama için, PBS, girdap, 5 ml antikor 10 ul (stok konsantrasyon = 0.5 mg / ml) karıştırmak ve karışımın 50 ul iyi çok kanallı pipet ile her. </li><li> 3 saat inkübatörde plaka bırakın. T hücrelerinin izole edilmesi sonra PBS ile iki kez önceden kaplanmış plakayı yıkayın. (Klon saflaştırılmış anti-CD28 antikor ekleyinArzu edilen bir nihai konsantrasyonda izole edilmiş T hücreleri (kadar 37.51), örneğin, 1 ug / ml); iyice karıştırın. T hücrelerini Tohum ve iki ya da üç gün boyunca inkübatör onları bırakın. </li></ol></li><li> Dendritik hücreler (DC&#39;ler) ile antijene özgü CD4 + T hücresi uyarımı Not: DCler antijen sunan hücreler (APC&#39;ler) olarak kullanılması halinde, bu özel durumlar dışında, T hücresi izolasyon Protokolü izleyin: <ol><li> dalak homojenize önce, 0.5 mg / ml PBS içinde kollajenaz tip Ia 1 ml enjekte ve 15 mi santrifüj tüpe aktarın. </li><li> 15 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içinde inkübe edin. PBS ile yıkandıktan sonra, FACS tampon pelet tekrar süspansiyon ve 20 fare CD11c, manyetik mikro boncuklar ul yerine CD4 mikro ekleyin. </li><li> MS ayrımı kolonu ve uygun hacimlerde: FACS tampon 1 ml kolon durulama; FACS tampon 1 ml ve tekrar süspansiyon Hücreler, FACS tamponu üç kez 1 ml sütun yıkayın. </li><li> ilanDCler (örneğin, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) aa 35-55 20 de ug / ml) için tercih edilen bir D antijen, iyice karıştırın ve tohum 5 x 10 4 hücre T hücre kültür ortamında 100 ul başına 96 yuvarlak Alt- iyi. </li><li> Protokol T hücre izolasyonu tarif edildiği gibi, sonunda 96 yuvarlak dipli-oyuk başına T hücre kültür ortamında 100 ul 1 x 10 5 T hücrelerini ekleyin. </li></ol></li><li> B hücreleri antijen-spesifik CD4 + T hücresi uyarımı NOT: B hücreleri APC &#39;olarak kullanılması halinde, bu istisnalar, T hücre izolasyonu için Protokolü izleyin: <ol><li> Olan B hücreleri (B hücreleri, özellikle MOG 35-55 tanır, örneğin, IgH MOG (Th) fareler) antijen spesifik transgenik farelerden dalak kullanın. </li><li> (TCR MOG (2B2) fareler arasında, örneğin) antijen-spesifik T hücreleri kullanır. Fare CD19 manyetik mikro boncuklar yerine CD4 mikro 20 ul ekleyin. </li><li> B cel için tercih edilen antijen ekleLS (örneğin, 20 ug / ml&#39;de MOG 35-55), 96-yuvarlak dipli oyuklu her B hücre kültür ortamında 100 ul 5 x 10 4 hücrelerini karıştırın ve tohum. </li><li> Her T hücre kültür ortamında 100 ul 1 x 10 5 T hücrelerini ekleme 96 yuvarlak dipli çukurlu T hücresi izolasyon Protokolü hazırlanır. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Kurma ve TEER Ölçümü Sahne <ol><li> Laminer akış kaputun altında TEER aletinin 24 kuyu modülünü yerleştirin. forseps kullanarak enstrüman MBMECs ile kapakları ve yer ekler çıkarın. </li><li> Modül kuyu alt bölmesine taze ortam 810 ul pipet: uç ve de modülün duvarı arasında dikkatli bir şekilde ekleyin. </li><li> kapaklarını kapatın ve inkübatör aleti koyun. kendi bilgisayarına aleti bağlayın; Gösterge denetleyicisi açmak ve yazılımı açın. </li><li> Pop-up pencerede &#39;yeni ölçüm&#39; seçeneğini seçin. Check &#39;şov TEER&#39; ve &#39;gösteri CCI&#39; kutuları; tuşuna basın &#39;start&#39;. İlk ölçüm tamamladıktan sonra, tüm TEER ve Ccl değerlerini görmek için &#39;sonuçları&#39; sekmesinde &#39;tüm kuyuları kontrol&#39; seçeneğini seçin. </li><li> &#39;Dosyanızın adı&#39;&gt; Farklı kaydet&gt; Dosya: Dosyayı kaydedin. NOT: TEER ve Ccl sürekli olarak, otomatik bir şekilde ölçülür olarak, üç ila beş günlük bir süre boyunca değerlerini izler. hücre canlılığı, optimal olmadığı sürece TEER artış eksikliği ile gösterildiği gibi orta değiştirme gerekli değildir. </li><li> Ccl istikrarlı ve daha düşük 1 mF / cm 2 ve TEER maksimum seviyeye ulaştığında T hücreleri ile MBMECs kültür eş zamanlı noktasını seçin. </li><li> Dikkatle mutlak TEER ve Ccl değerlerini incelemek ve MBMECs bu tür kuyular işaretini kaldırarak konfluan yeterli mono tabakaları gelişmemiş olan kuyular hariç. </li><li> Grup kuyuların kalanı: Bir kuyu üzerinde sağ tıklayın ve &#39;yeni ortalama kuyu iyi eklemek&#39; seçeneğini seçin. namPop-up pencerede e; tüm bireysel kuyuları gruplandırılmış olması için de aynı şeyi. </li><li> hepsi ko-kültür önce aynı başlangıç ​​koşullarına sahip olduğunu doğrulamak için tüm ortalama kuyu kontrol edin. Bazı önemli ölçüde farklı mutlak TEER değerlere sahip veya TEER eğimli veya standart hatalar çok büyükse, gruplama kokan. NOT: Kuyular optimal gruplama içinde ve deney grupları arasında hem TEER değerlerinde minimum varyasyon sağlar. </li><li> &#39;Deney&#39; sekmesinde, basının &#39;pause&#39;, enstrüman ayırın ve inkübatör dışına götürün. Laminer akış kaputun altında kapaklarını çıkarın. </li><li> Hazırlanan önceden aktive arzu edildiği gibi, veya belirli sitokinler, antikorlar ya da diğer maddeler olmadan ve / veya naif T hücreleri: hazırlanmış T saflaştırılmıştır mix NA / LE sıçan anti-fare IFN-γ antikoru (klon XGM1.2): Örnek hücreler, TEER aygıtının oyuk başına 20 ug / ml&#39;de. NOT: Bu Granzim B inhibitörü olarak maddeler kullanıldığında, bunlar, birT hücresi stimülasyon başında olan T hücre kültürüne dded: örneğin, Granzim B inhibitörü II (Calbiochem) DMSO içinde 10 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda izole edilmiş T hücreleri ile karıştırılır. Daha fazla bilgi için malzemeler ve donatım bakın. </li><li> Ovülden orta (üst kuyu bölmesi) bazı kaldırın: (Bu MBMEC tek tabaka rahatsız olabilir gibi tüm orta kaçınılmalıdır kaldırma), örneğin dikkatlice 150 ul dışarı pipetle. </li><li> Dikkatli bir şekilde 2 x 10 5 hücre / parçasını içeren ortam 150 ul pipetleme MBMECs T hücrelerinin ekleyin. NOT: Önceden aktive T hücreleri hasat, yalnızca, Tripan Mavi-serbest hücreleri patlatma saymak. </li><li> kapaklarını kapatın ve tekrar inkübatör cihazı yerleştirin. enstrüman ve basın &#39;özgeçmiş ölçümü&#39; yeniden bağlayın. ve &#39;deney&#39; sekmesinde 24 saat, basın &#39;dur&#39; sonra dosyayı (Dosya&gt; Kaydet) kaydedin. </li></ol> 5. Veri Aktarma ve İstatistiksel Analiz <ol><li>Dosya&gt; Dışa Aktar&#39;ı seçerek sonuçları ihracat. </li><li> Pop-up pencere &quot;ayarları&quot; sekmesinde, &quot;alan sınırlayıcı&quot; seçeneğinde &quot;ondalık ayracı&quot; seçeneğinde &quot;.dot&quot; ve &quot;sekme&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;İhracat sonuçları&quot; sekmesinde, dosya adı tüm kuyuları ihraç edilecek kontrol ve &quot;verileri seçmek&quot; seçeneğindeki &quot;teer&quot; ve &quot;Ccl&quot; onay kutularını. </li><li> Basın &quot;ihracat verileri,&quot; aktarılan dosyayı açın ve bir elektronik tabloya veri kopyalama. </li><li> ko-kültür önceki son zaman noktasında Set TEER ve Ccl değerleri% 100 ve diğer tüm için buna göre değerleri değiştirmek: (Her çalışma (ölçüm için verilen TEER ve Ccl değerleri ile, her tekrarında sıralama kriteri:)) ihraç veri normalleştirmek &#39;% 100&#39; vadede göreceli çalışır. </li><li> ayrı ayrı kuyuların kullanılarak ve her tedavi grubu için ortalama standart hata gösteren bir grafik oluşturmak için bir seçim yazılımı normalleştirilmiş verileri kopyalama. </li><li> Pseçim istatistiksel yazılımı kullanarak, çoklu karşılaştırmalar için bir Bonferroni düzeltmesi İki yönlü ANOVA istatistik testi erform. </li></ol>

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl and L. Klotz have nothing to disclose. H.-J. Galla is a scientific advisor of nanoAnalytics GmbH, the manufacturer of the automated cell monitor.

tarif edilen protokol birkaç adım başarılı deney için gereklidir. Başlangıç ​​MBMEC izolasyonu ve kültürü sırasında, çalışma mantar sporları, bakteri veya hücre kültürünün bulaşmasını önlemek için, mümkün olduğu kadar, steril koşullar altında gerçekleştirilir çok önemlidir. EC saf bir kültür elde etmek için, bir EC hayatta kalmasını sağlayan, ilk üç gün puromisin içeren ortam, ancak diğer hücre türleri (özellikle perisitler) 41,42 kullanılması tavsiye e...

3 -, kan-beyin bariyeri, merkezi sinir sistemi (MSS) 1 sistemik dolaşıma ayırır. Bu hücrelerin serbest dolaşımını ve suda çözünen moleküllerin difüzyon engeller ve patojenler ve potansiyel olarak zararlı maddelerden koruyan beyin fiziksel bir engel oluşturur. bariyer fonksiyonuna ek olarak, BBB nöronal doku düzgün işleyişini sağlayan beyin parankimi, oksijen ve besin iletimini sağlar. BBB fonksiyonel özellikleri son derece son derece uzmanlaşmış EC ana yapı elemanı olmak üzere, hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri tarafından düzenlenir. BBB EC sıkı birleşme (TJ) kompleksleri, fenestrasyonlar eksikliği, aşırı düşük pinocytic aktivitesi ve kalıcı olarak aktif taşıma mekanizmaları varlığı ile karakterize edilir. endotel, astrositik uç ayak ve = ilişkili par katıştırma Diğer BBB bileşenleri AK bazal membran, perisitlerenchymal bazal membran da bbb 2,4 geliştirilmesi, bakım ve işlevine katkıda - 6 ve birlikte nöronlar ve mikroglia ile merkezi sinir sistemi 7 doğru çalışmasını sağlayan nörovasküler birimi (NVU) meydana - 9. Bu gibi nörodejeneratif, enflamatuar veya bulaşıcı hastalıklar gibi nörolojik hastalıklar, çeşitli, BBB fonksiyonu 2,5,10 ele almaktadır. TJ kompleksleri ve moleküler taşıma mekanizmaları düzensizliği BBB geçirgenliği, lökosit ekstravazasyonu, enflamasyon ve nöronal hasarı sebep olur. Böyle patofizyolojik koşullarda BBB özelliklerini incelemek amacıyla, çeşitli in vitro BBB modelleri 9,11,12 kurulmuştur. Birlikte bariyer bütünlüğünün, geçirgenlik yanı sıra taşıma mekanizmaları değişiklikleri değerli bilgiler sağlamıştır. Bu modeller, insan, fare, sıçan, domuz veya b endotel hücrelerini kullanırKoyun kökenli 13-18; 25 - primer endotel hücreleri ya da hücre hatları, in vivo 19 daha yakından BBB taklit etmek için perisitler ve / veya astrositler ile tekli kültür olarak ya da birlikte kültürlenir. Son yıllarda, endotel elektrik direnci (TEER) ölçümü endotel bariyer özelliklerinin 26,27 değerlendirmek için yaygın olarak kabul gören bir araç haline gelmiştir. TEER hücre tek tabaka boyunca iyon akı empedansı yansıtan ve onun azalma tehlikeye endotel bariyer bütünlüğünün ve dolayısıyla artan geçirgenliği hassas bir ölçümünü sağlar. 30 - Çeşitli TEER ölçüm sistemleri Epitelyal Voltohmmeter (EVOM), elektrik Hücre alt-tabaka empedansını algılayarak, (ECIS) ve gerçek zamanlı hücre analizi 15,28 dahil olmak üzere geliştirilmiştir. TEER bitişik EC arasındaki iyon akımının (paraselüler yol) direnç gösterir ve doğru orantılıdırbariyer bütünlüğü. Empedans spektroskopisi 27,31 yılında, karmaşık toplam empedansı (Z) CCL ölçerek bariyer bütünlüğünün hakkında ek bilgi sağlar, hangi ölçülür. CCL hücre zarı (transsellüler yol) üzerinden kapasitif akımı ile de ilgilidir: hücre katmanı zarın her iki tarafında ücretleri ayırma eşdeğer elektrik devresinde bir kapasitör gibi davranır ve ters bariyer fonksiyonunun orantılıdır. geçirgen ekler üzerinde yetiştirilen zaman, EC, uygun çoğalırlar ve mikro gözenekli membran yayıldı. Bu (kendisi bir kondansatör gibi davranır) ve minimal seviyeye ulaşana kadar kapasitans bir azalmaya yol açar ucun arka kapasitif akımını direnç gösterir. Bu TJ kurulması takip eder komşu EC arasındaki boşluk kapalı olduğu mühür kompleksleri. Bu parasellüler yoldan iyon akı kısıtlar ve onun plato ulaşana kadar TEER arttırır. inflamatuar koşullar altında, ancak, endothelial bariyer tehlikeye: TJ bozulur olsun kompleksleri ve ekin kapasitif bileşeni tekrar yükseldiğinde Ccl arttıkça TEER azalır. Bizim TEER ölçümü otomatik hücre izleme 32 sistemi kullanır: Bu empedans spektroskopisi prensibini takip eder ve önceki uygulamalarını uzanır. Burada, bağışıklık hücreleri ile beyin endotel etkileşimi de dahil olmak üzere bariyer özellikleri çalışma, sağlayan in vitro BBB modeli tarif; özellikle aktive edilmiş T hücreleri. 37 - Bu patofizyolojik koşullar, çoklu skleroz ve hayvan modeli, deneysel otoimmün ensefalomiyelit 33 olarak merkezi sinir sisteminin bağışıklık hastalıklarının gözlenmektedir. Burada, çok önemli bir adımdır BBB boyunca ensefalitojenik, miyelin özgü T hücrelerinin göçü olup. Bu beyin parankimi içine perivasküler alanda ve giriş onların reaktivasyonuna tarafından takip edilir, diğer bağışıklık hücrelerini işe ve bana neredeACİL enflamasyon ve daha sonra demiyelinasyon 1,35,38. Bununla birlikte, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimin moleküler mekanizması, BBB temel bileşenler, iyi anlaşılmamıştır. Bizim protokol bu boşluğu doldurmak ve aktive T hücreleri ile bunların doğrudan temas ve karmaşık etkileşimi üzerine endotel hücreleri (yani, bariyer bütünlüğü ve geçirgenlik) üzerinde sonuçları yeni bir bakış açısı kazandırmayı amaçlamaktadır. Burada açıklanan protokol mikro-gözenekli membran ile geçirgen eklerde üzerinde tek-katman olarak yetiştirilen primer fare beyni mikrovasküler endotel hücreleri, kullanır. Endotel hücreleri, ortak-kültürlenir poliklonal veya antijen spesifik şekilde ya da ön-aktive edilebilir, CD4 + T hücreleri ile. Ön-aktifleştirilmiş, ancak saf T hücreleri ile MBMECs Co-kültür TEER bir azalmaya ve MBMEC fonksiyon bozukluğu ve engelleyici bir bozulma nicel ölçümünü sağlar CCl bir artışa da neden olur. tekniknon-invaziv: built-in yerine AT tek tabaka büyük olumsuz yönde etkilenmemesi çubuk elektrotlar, kullanır; hücre belirteçleri kullanılmadan bariyer fonksiyonunu izlemek için de kullanılabilir. Bu otomatik bir şekilde sürekli ölçümler yapar ve aynı anda zamanla iki bariyer parametreleri (TEER ve Ccl) bağımsız bir değerlendirmesini sağlar. Yöntem ayrıca, farklı T hücresi aktivasyonunun seviyeleri ve EC ile T hücrelerinin etkilerini ayırt kadar hassastır. Bu fonksiyonel analizlerin geniş bir kullanılabilir: inflamatuar süreçlere de karışırlar farklı sitokinler ve / veya kemokin MBMECs ve T hücrelerinin ko-kültür ilave edilebilir; EC ya da T-hücresi, her iki yanında, hücre yapışma moleküllerinin karşı bloke edici antikorlar kullanılabilir; ve T hücre aktivasyon işaretleme maddelerinin veya sitolitik özellikleri inhibitörleri, T-hücresi priming veya EC ile ko-kültür sırasında ilave edilebilir. Tahlil, aynı zamanda, T-hücresi göçü için kullanışlıdırdeneyler, bu T hücrelerinin ilave edilmesinden önce, MBMEC tek tabaka bütünlüğünün bir kalite kontrol olarak hizmet edebilmektedir. Bütün bu yöntemini AK tek tabaka bütünlüğünü aktive T hücrelerinin etkisi odaklanarak, in vitro BBB incelemek için çok yönlü ve güvenilir bir araçtır. Bu, kendi kendine reaktif ensefalitojenik T hücreleri BBB çapraz ve enflamasyon ve nöronal zarara neden MS ve hayvan modeli EAE gibi oto-bağışıklık hastalıklarının patojenezinde BBB bozulma mekanizmalarının anlaşılması için özel bir önem taşımaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>cellZscope</td>
			<td>nanoAnalytics GmbH</td>
			<td>www.nanoanalytics.com</td>
			<td>including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
			<td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>www.beckmancoulter.com</td>
			<td>for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo7.6.5 software</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td>www.flowjo.com</td>
			<td>for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 ml; for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell membrane inserts - pore size 0.4 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>for TEER measurement as the main readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell membrane inserts - pore size 3 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650 180</td>
			<td>flat-bottom; for MBMEC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td>round-bottom; for immune cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td>for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>MF-0640010</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for T cell and B cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD4 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td>for CD4+ T cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD19 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-201</td>
			<td>for B cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD11c MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-001</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>for MBMEC coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td>for MBMEC coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2 (CSL2)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase (C/D)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11097113001</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644-1L</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (+ GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>for MBMEC and immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>for MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>for MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td>for MBMEC culture medium; only for the first three days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>for harvesting MBMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9891</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM + 1% L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21980-032</td>
			<td>for T cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418Q</td>
			<td>protect from light; for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse MOG35&#8212;55 peptide</td>
			<td>Biotrend</td>
			<td>BP0328</td>
			<td>for antigen-specific T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD3 Ab</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100302</td>
			<td>clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553294</td>
			<td>clone 37.51; for polyclonal T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05</td>
			<td>for T-cell transmigration assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td>for T-cell transmigration assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&#947; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554408</td>
			<td>clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granzyme B Inhibitor II</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>368055</td>
			<td>recommended final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116005</td>
			<td>clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

Şekil 1, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılan in vitro BBB modelinin genel bir bakış sağlar. Deney üç ana adımdan oluşur. İlk adım beyin korteks primer MBMECs izolasyonu ve beş gün boyunca onların kültürüdür. Onlar hücre kültürü plakasına izdiham ulaştığınızda, MBMECs tripsinize ve sonra TEER enstrüman yerleştirilir geçirgen ekler, üzerine reseeded edilir. TEER ve MBMECs CCL sürekl...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction at JoVE.com

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

an-vitro-model-blood-brain-barrier-using-impedance-spectroscopy-focus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

11.1K Görüntüleme.  University Hospital Münster. Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Video: An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Bir Geliştirilmesi<em&gt; In vitro</emEtkileşimini incelemek için&gt; bir model sistem<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</emYüksek afiniteli reseptör FcεRI&gt; ile IgE

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.