وأيد هذا العمل من قبل الخلايا الجذعية نيويورك العلوم (NYSTEM C028107) منحة لGHT.

1. تكييف من الحيوانات لدرجة الحرارة والتغذية ودورة الضوء / الظلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البالغين Nematostella vectensis من واحدة من العديد من المختبرات Nematostella في جميع أنحاء العالم، أو مورد غير ربحية (الجدول 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على Nematostella في درجة حرارة ثابتة (عادة ما بين 18 و 21 درجة مئوية) في الظلام، في &quot;1 / 3X&quot; الاصطناعي مياه البحر (مضادة للغواصات) في الملوحة من 12 أجزاء في الألف (باور بوينت). الحفاظ على الثقافات في أطباق ثقافة زجاج الصودا والجير بسيطة، وعادة 250 مل أو 1.5 لتر سعة 11. ملاحظة: يتم استخدام هذه الشروط ثقافة بسيطة عادة بين المختبرات التي تدرس Nematostella، ولكن يمكن أيضا رعاية الثقافة أن يكون آليا (19). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية Nematostella فقست حديثا الأرتيميا اليرقات 2 - 4X في الأسبوع. الخراجات هاتش الأرتيميا في كامل قوتها (36 جزء في الألف) أو 1 / 3X مضادة للغواصات في 30 درجة مئوية، في الضحلة طبق زجاج مستطيلة 20 أو فيأي عدد من نطاق صغير، المفرخات الأرتيميا تجارية أو محلية الصنع. إذا حاضنة غير متوفرة، والروبيان يفقس في RT ولكن القيام بذلك ببطء أكثر. ملاحظة: هذا غالبا ما يتطلب أكثر من 24 ساعة لاستكمالها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المياه ثقافة النعمان مرة واحدة على الأقل في الأسبوع. للحصول على أفضل صحة البالغين، نظيفة تماما (بدون صابون) ثقافة الطاسات مرة واحدة في الأسبوع من الإفرازات المخاطية المتراكمة، التي معطف وعاء ويمكن فخ المواد الغذائية غير مأكول والنفايات، وتوريط الحيوانات. </li></ol> 2. اختيار والاسترخاء من الحيوانات مكيفة من الناحية التغذوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر المتطابقة حجم الاورام الحميدة من تقريبا نفس طول (3-5 سم، وعندما خففت بشكل طبيعي) ووضعها في وعاء فصلها عن مستعمرة لمدة ثلاثة أيام قبل البتر. ملاحظة: سيتم تحديد عدد الحيوانات التي اختيرت لقطع من التجربة التي أجريت، وبطبيعة الحال، ولكن بشكل عام نحن نوصي على الأقل خمسة حيوانات في كل نقطة عينة مع ستة مكررات. وهكذا،في تجربة نموذجية سيتم انتقاؤه ما لا يقل عن 30 الحيوانات. بشكل عام، فإنه من الحكمة لاختيار أكثر من الحد الأدنى لعدد (30) منذ بتر الأطراف التي هي غير منتظمة (انظر أدناه) يمكن أن تؤثر لاحقا التهديف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طبق من الحيوانات المختارة من الحاضنة إلى ضوء غرفة ساعة واحدة على الأقل قبل البتر. ملاحظة: سوف التعرض لضوء الغرفة والاهتزازات من التعامل المرجح أن يسبب الحيوانات للتعاقد، لذلك هم بحاجة إلى أن تتكيف أو &quot;الاسترخاء&quot; التي الحضانة على مقاعد البدلاء المختبر. وسوف تصبح الحيوانات الحرارية لمسة والتعرض للضوء وعند هذه النقطة يمكن نقلها من قبل pipetting لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: تخدير الحيوانات بإضافة 7.5٪ MgCl 2 (في 1 / 3X مضادة للغواصات). إضافة بلطف حل MgCl 2 إلى وعاء مع معيار البلاستيك 5 مل ماصة. ملاحظة: على الرغم من الحيوانات سوف تصبح في نهاية المطاف تعود على ضوء والتلاعب الجسدي، قد يكون من المفيد لتخدير الحيوانات للحفاظ على أو &quot;إصلاح&quot; تيانه خففت الدولة بعد أن أصبحت 16،21،22 ممدود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تجويف واسع (&gt; 0.5 سم) البلاستيك ماصة للنقل (في 1 / 3X مضادة للغواصات) خمسة حيوانات من تجمع لابد من بتر، في الجزء السفلي من طبق قطع الزجاج المعقم بقطر 100 ملم تحتوي على 12 جزء في الألف مضادة للغواصات. وضع الطبق على المسرح من مجهر تشريحي مع التكبير متغير بين 10 - 40X. ملاحظة: إذا لم يتم تخدير الحيوانات والاسترخاء لعدة قطاعات، فإنها قد لا تزال تستجيب لمسة والإضاءة المجسام، وبالتالي قد تحتاج إلى بضع دقائق لتصبح مرتاحا ثانية. </li></ol> 3. البتر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط معقم، بتر المنفخة مجافي الفم من كل ورم، وذلك بهدف الحصول على قسم من المنفخة أن ما يقرب طالما أنها واسعة وتحتوي على أي مساريق. ملاحظة: وخفض الموقع المثالي هو مجرد مجافي الفم لإنهاء مساريق. في الطائرة من قطع هناك انتقال من مساريق المناسب لل رقيقةإيناس المقابلة لكل الإدراج المساريقية (انظر الشكل 1، السهام). غياب مساريق أمر بالغ الأهمية لأنها تنتج المخاطية التي قد تسهل &quot;سد&quot; ثقب 17،30. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع شفرة المشرط في اتصال مع الحيوان في الموقع المطلوب من البتر. القيام بذلك إما بدون مساعدة (مرفوعة)، أو عن طريق استيعاب بلطف جسم الحيوان مع # 5 ملقط (نمط دومون أو ما شابه ذلك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع طريق الأنسجة من خلال الاستفادة من شفرة منحنية من مشرط في &quot;الهزاز&quot; الحركة في جميع أنحاء الجسم. ملاحظة: يجب أن الأنسجة تقطع نظيفة كما هزت مشرط وتحرير القسم المطلوب من المنفخة من الجهة المانحة. ومع ذلك، إذا كان قطعة صغيرة من الأنسجة لا يزال يربط الجسم والمنفخة، قطع عليه مع مشرط. لا تحاول فصل القطع متصلة عن طريق سحب، لأن هذا قد يؤدي إلى تلف المنفخة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كل بتر &quot;المانحة&quot; ورم من الطبق وإعادته إلى سيباعاء معدل المسمى &quot;مبتوري الأطراف المجمعة؛ التاريخ وعاء وإعادته إلى ثقافة الأسهم. ملاحظة: سوف الاورام الحميدة بتر شفاء الجرح مجافي الفم خلال يوم واحد وبعد ذلك يمكن أن يكون الطعام بشكل طبيعي. وسوف إعادة إنشاء المنفخة تبدو طبيعية في غضون أسبوعين وعند هذه النقطة والمنفخة يمكن بتر مرة أخرى إذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المنفخة رفعه التي تبقى في طبق القطع في 12 ASW باور بوينت، ثم نقل كل المنفخة إلى بئر العقيمة مستقل في لوحة الثقافة خلية متعددة جيدا أن لديها بالفعل 10 مل من 12 ASW جزء في الألف في كل بئر. ملاحظة: يستخدم هذا المثال لوحة جيدا ستة، مع كل عقد أيضا في 10 مل من مياه البحر وخمسة المنفخة رفعه. في مياه البحر العام يجب أن يغطي المنفخة بما فيه الكفاية لتجنب التعرض للهواء بسبب حركة في التعامل والتبخر. يجب أن يكون غطاء لوحة أو الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،3 لجمع ما لا يقل عن 5 المنفخة في كل محفوظة بشكل جيد لكل علاجا تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المنفخة عند درجة حرارة من شأنها أن سفر الأمثالبيئة تطوير متكاملة على أفضل سعر للتجديد لاستجواب التجريبية المخطط لها. وضع لوحة تحتوي على المنفخة في تنظيم درجة الحرارة حاضنة، عند درجة حرارة ثابتة يحددها معدل المطلوب للتجديد. ملاحظة: سوف المنفخة تجديد الأنسجة المفقودة وتشكيل ورم كامل عندما حضنت في درجات حرارة تتراوح بين 15 و 27 درجة مئوية. معدل تجديد هو درجة الحرارة يعتمد باستثناء المرحلتين الأوليين. في اليوم في المتوسط ​​للوصول إلى المرحلة 4 في جميع درجات الحرارة هو 7 أيام بعد أن قطع وهذا يتزامن أيضا مع تجديد في 21 درجة مئوية. في 27 درجة مئوية، ويتم التوصل إلى المرحلة 4 في وقت سابق عن 3 أيام، وعند 15 درجة مئوية، ويتم تأخير المرحلة 4 بحوالي 3 د مقابل تجديد في 21 ° C (انظر أيضا المرجع 10). </li></ol> 4. تقييم التجديد مع نظام التدريج Nematostella التجديد (NRSS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسجل المنفخة باستخدام مجهر ستيريو مركب مع Magnific على متغيرأوجه (10 - 80X). يسجل Nematostella المنفخة قطع طازجة كما المرحلة 0 ويستمر التسجيل في نفس الوقت كل يوم بعد بتر (د ب أ) باستخدام NRSS 10. ملاحظة: للحصول على معايير انطلاق الرئيسية وتفاصيل تشير المرجعي 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسجل المنفخة كما المرحلة 0 (الجرح المفتوح) إذا ظهرت قطع طازجة المنفخة باعتباره cup- على شكل كتلة تشبه البالون مترهلة، مع موقع جرح مفتوح من المرجح مرئية. ملاحظة: قد عصا حواف الجرح معا أيضا منذ البداية، ولكن ستظل انهار الأنسجة وتفتقر إلى الصلابة. يمكن ملاحظة حواف الجرح المفتوح تمر انكماش شعاعي كما يشفى الجرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسجل المنفخة كما المرحلة 1 (الجرح مقفلة) إذا يبدو الجرح بتر مغلقة. ملاحظة: موقع الجرح تتوافق مع القطب عن طريق الفم في المستقبل. السطح الخارجي حول القطب عن طريق الفم في المستقبل قد تبدأ في عرض أقواس متميزة الموافق الكامنة الإدراج المساريقية الأديم الباطن متماثل شعاعيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتاه النتيجةYSA كما المرحلة 2 (شعاعي الأقواس) إذا كان سطح القطب عن طريق الفم يبدو مبالغا، وكشف عن ثمانية أقواس رفع مرتبة في نمط متماثل شعاعيا ومفصولة الأخاديد. نلاحظ، الفقاعات نصف كروية صغيرة في قمة الأقواس. وسوف يكون حوالي مثل طويل القامة واسع كما، عابرة المرجح، وتتألف في البداية من قبل طبقة الخلايا الأدمة واحدة. ملاحظة: في بعض الحالات قد تستقر الفقاعات المزدوج الطبقات. ملاحظة: في هذا أو في وقت لاحق مراحل طبقة المخاطية قد تظهر لتغليف المنفخة (الشكل 2) في &quot;غمد&quot; غشائي. يجب إزالة هذه المواد التغليف لتسهيل التهديف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسجل المنفخة كما المرحلة 3 (اللامسة) إذا تم تشكيل براعم مخالب تحتوي على الأديم الباطن والأدمة طبقات الأنسجة ثابت في نهاية الفم من بعض الأقواس الشعاعية على الأقل. ملاحظة: مخالب أطول مما هي واسعة وتكون متحركة الحد الأدنى. سوف تظهر المنفخة زيادة، ولكن التضخم متغير بحيث اساسيات مساريق قد تصبح فيماible تمتد من الإدراج المساريقية في تجويف الجسم (معى بدائي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسجل المنفخة كما المرحلة 4 (الخطي المساريقا) إذا كان المنفخة تحتوي على ثمانية، المساريقا مرئية المتميزة التي تمتد إلى معى بدائي من الإدراج في جدار الجسم، مع أطوال عن طريق الفم مجافي الفم التي هي أكثر من ضعف عرض شعاعي على قياس من حيث ظهورها للاتصال إلى البلعوم في نهاية مجافي الفم لها (enterostome). ملاحظة: أربعة أو أقل المساريقا لها &quot;مطوي&quot; الحواف الحرة الداخلية. البلعوم مرئيا. أكثر من ثمانية مخالب واضحة، متحركة وأحيانا التعاقد في الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسجل المنفخة كما المرحلة 5 (في الغالب مطوي المساريقا) إذا كان المنفخة لديها أكثر من أربعة المساريقا مع ضفائر، وضفائر أكثر الكامل ومتعرج مما كانت عليه في المرحلة 4. الحيوان لديه تقريبا &quot;العادي&quot; مظهر الكبار، ولكن لا توجد مرئية خلايا الغدد التناسلية. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , (1986).</li><li>Trembley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M&#233;moires pour servir &#224; l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, &#224; bras en forme de cornes. , (1744).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra,+a+fruitful+model+system+for+270+years.">Hydra, a fruitful model system for 270 years.</a> Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).</li><li>Gold, D. A., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+Cnidaria:+are+there+unifying+principles?.">Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles?.</a> Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarians:+an+evolutionarily+conserved+model+system+for+regeneration?.">Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration?.</a> Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).</li><li>Amiel, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Morphological+and+Cellular+Events+Underlying+Oral+Regeneration+in+the+Sea+Anemone,+Nematostella+vectensis.">Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis.</a> Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).</li><li>Warren, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+perlecan/HSPG2+gene+and+its+activation+in+regenerating+Nematostella+vectensis.">Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis.</a> PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).</li><li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+of+the+starlet+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis.</a> Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).</li><li>Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+staging+system+for+the+regeneration+of+a+polyp+from+the+aboral+physa+of+the+anthozoan+Cnidarian+Nematostella+vectensis.">A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis.</a> Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).</li><li>Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting,+rearing,+spawning+and+inducing+regeneration+of+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).</li><li>Tucker, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombospondin+in+the+anthozoan+Nematostella+vectensis+is+associated+with+the+nervous+system+and+upregulated+during+regeneration.">A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration.</a> Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).</li><li>Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+is+necessary+for+the+regeneration+of+oral+structures+in+the+anthozoan+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Dev Biol. 12, (2012).</li><li>Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+canonical+Wnt+signaling+by+alsterpaullone+is+sufficient+for+oral+tissue+fate+during+regeneration+and+embryogenesis+in+Nematostella+vectensis.">Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis.</a> Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).</li><li>Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+muscle-specific+transgenic+reporter+line+of+the+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).</li><li>Burton, P. M., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+novel+gene+expression+between+regeneration+and+asexual+fission+in+Nematostella+vectensis.">Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis.</a> Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).</li><li>DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiating+a+regenerative+response;+cellular+and+molecular+features+of+wound+healing+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Biol. 12, (2014).</li><li>Hand, C., Uhlinger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+reproduction+by+transverse+fission+and+some+anomalies+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Invert Biol. 114, 9-18 (1995).</li><li>Fritzenwanker, J. H., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+gametogenesis+in+the+basal+cnidarian+Nematostella+vectensis(Anthozoa).">Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa).</a> Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).</li><li>Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science's+super+star:+The+starlet+sea+anemone+is+an+ideal+tool+for+student+inquiry.">Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry.</a> The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).</li><li>Genikhovich, G., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+starlet+sea+anemone+(Nematostella+vectensis)+embryos,+larvae,+and+polyps.">In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps.</a> Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).</li><li>Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+inventory+and+expression+of+Sox+and+Fox+genes+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).</li><li>Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+response+element+binding+protein+(CREB)+as+an+integrative+HUB+selector+in+metazoans:+clues+from+the+hydra+model+system.">The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system.</a> Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).</li><li>Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+developmental+trajectories+in+the+starlet+sea+anemone+Nematostella+vectensis:+embryogenesis,+regeneration,+and+two+forms+of+asexual+fission.">Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission.</a> Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).</li><li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALEN+and+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis.">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nat Commun. 5, 5486 (2014).</li><li>Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+epithelial+organisation+of+muscle+cells+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Front Zool. 11, 44 (2014).</li><li>Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eumetazoan+nervous+systems:+insights+from+cnidarians.">Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).</li><li>Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+systems+of+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis+are+generated+by+ectoderm+and+endoderm+and+shaped+by+distinct+mechanisms.">Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms.</a> Development. 139 (2), 347-357 (2012).</li><li>Richards, G. S., Rentzsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+analysis+of+a+SoxB+gene+reveals+neural+progenitor+cells+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).</li><li>DuBuc, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+Nematostella+vectensis+embryogenesis+and+late+development+using+fluorescent+probes.">In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes.</a> BMC Cell Biol. 15, (2014).</li><li>Kaur, J., Debnath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+at+the+crossroads+of+catabolism+and+anabolism.">Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).</li><li>Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+autophagy:+cross-talk+and+co-operation+to+control+cellular+homeostasis.">Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis.</a> Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).</li><li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li><li>Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+and+progenitor+cells.">Autophagy in stem and progenitor cells.</a> Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).</li><li>Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tightrope+act:+autophagy+in+stem+cell+renewal,+differentiation,+proliferation,+and+aging.">Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging.</a> Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).</li><li>Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+zebrafish.">Autophagy in zebrafish.</a> Methods. 75, 172-180 (2015).</li><li>Varga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+zebrafish+caudal+fin+regeneration.">Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration.</a> Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).</li><li>Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+apoptosis+in+planarians.">Autophagy and apoptosis in planarians.</a> Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).</li><li>Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+investigate+autophagy+during+starvation+and+regeneration+in+hydra.">Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra.</a> Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).</li><li>Tettamanti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+invertebrates:+insights+into+development,+regeneration+and+body+remodeling.">Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling.</a> Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

استخدام Nematostella كنموذج للالتئام الجروح وتجديد تزداد شعبية. وبالتالي، فمن المهم أن تكون قادرا على تصور أنماط شكلية بروتوكول معين قبل التحاليل الخلوية والجزيئية فعالة يمكن تعيين ومقارنة. Nematostella يكون على درجة عالية من &quot;المرونة&quot; التجدد، أن تكون قادرة على ?...

كانت الملاحظة التجديد في هيدرا واحد من الحدث البارز في ظهور البيولوجيا باعتبارها 1،2 العلم التجريبي. يبقى تجديد ظاهرة نداء واسع للغاية إلى الأحياء ووضع الشخص على حد سواء. إمكانية علماء البيولوجيا التطورية والأطباء وعلماء الطب الحيوي والمهندسين الأنسجة لفهم والتغلب على القيود المفروضة على تجديد البشري يجعل البيولوجيا تجديد أكثر من مثيرة للاهتمام في جوهرها. الآن، مع استخدام التكنولوجيات الناشئة مثل تسلسل الجينوم والربح والخسارة من أدوات وظيفة، تستعد الميدان لندف آليات التجدد، وبصرف النظر لفهم في النهاية كيف الأنواع المختلفة يمكن أن تتجدد في حين لا يمكن للآخرين. وتبقى درجة من القواسم المشتركة في الردود الجزيئية الخلوية والمورفولوجية إلى توضيح، ولكن حتى الآن يبدو أن ردود الأساسية بين الحيوانات التي يمكن أن تتجدد هو أكثر مماثلة مما كان imagiنيد فقط قبل عقد من الزمن 3. الكائنات المجوفة على وجه الخصوص هي السطحية في تجديد ما يقرب من جميع أجزاء جسمها وسط مجموعة واسعة من التنوع الصرفي. من الانفرادي ورم المياه العذبة، هيدرا جنبا إلى جنب مع الاورام الحميدة البحرية الصغيرة التي تبني الشعاب المرجانية الهائلة، إلى siphonophores الاستعماري معقدة، مثل البرتغالية رجل-O-الحرب، وتجديد وغالبا ما يكون وضع الإنجاب، بالإضافة إلى آلية ل إصلاح أو إصلاح أجزاء الجسم التالفة أو المفقودة الناتجة من الاصابة والافتراس. إذا كانت الأنواع المختلفة من القراصات استخدام آليات مماثلة أو مختلفة لتجديد هو مسألة مثيرة للاهتمام بشكل أساسي 4-6. ونحن، والبعض الآخر تم تطوير وanthozoan، Nematostella vectensis كنموذج للتجديد 7-17. نحن وضعت مؤخرا نظام التدريج لوصف تجديد لكامل الجسم من قطعة موحدة شكليا من الأنسجة شطر من أبورال نهاية ورم 10. بينما الاورام الحميدة Nematostella يمكن تجديد عندما شطر على أي مستوى، اخترنا لخفض البالغين في موقف مجافي الفم في المنطقة الأكثر بسيطة شكليا، والمنفخة، في جزء منه لأن هذا هو على مقربة من الطائرة العادية للانشطار اللاجنسي الطبيعي 18، وأيضا لأنه مراقبة التصاريح والتحليلات الجزيئية لكيفية تجميعها على كامل الجسم من أبسط المكونات الشكلية. والتدريج النظام Nematostella التجديد (NRSS) يوفر مجموعة بسيطة نسبيا من المعايير الشكلية التي يمكن استخدامها ليسجل تقدم في أي جانب من جوانب التجديد من قبل المنفخة بتر، في ظل ظروف ثقافة العادية أو أقلقت تجريبيا الحالات مثل علاج جزيء صغير، والتلاعب الجيني ، أو تغيير البيئة. كما كان متوقعا، وأصبح اعتمدت NRSS كما سقالة المورفولوجية التي الأحداث الخلوية والجزيئية للتجديد يمكن الرجوع إليها10. أخيرا أسلوبنا في قطع تنتج فجوة عدة أوامر من حجم أكبر من ثقب نقطة دبوس المستخدمة في دراسة حديثة 17، إلا أن كلا من الجروح تلتئم في حوالي 6 ساعات. يجب توثيق مراحل اعتقال بصريا ومتميزة من إغلاق الجرح اقتراح نهج التجريبية لشرح استقلال واضح من حجم الجرح والوقت الذي يستغرقه لإغلاقه. وبالتالي، فهم البصرية أعمق لعملية بتر مجافي الفم، المنصوص عليها في هذا البروتوكول، سيساعد مزيد من التحقيقات في هذا النظام تجديد نموذج وتوسيع تطبيق هذا النظام انطلاق باستخدام Nematostella vectensis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nematostella vectensis, adults</td>
			<td>Marine Biological Lab (MBL)</td>
			<td></td>
			<td>non-profit supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Dish, 250 ml</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>741004</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Dish, 1,500 ml</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>741006</td>
			<td>1,500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene transfer pipette, 5ml&#160;</td>
			<td>USA Scientific&#160;</td>
			<td>1022-2500</td>
			<td>narrow bore, graduated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene transfer pipet, tapered</td>
			<td>Samco</td>
			<td>202-205</td>
			<td>cut off 1 inch of tip to make wide bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Feather Safety Razor Co. Ltd</td>
			<td>no. 10</td>
			<td>blade should be curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Dumont Fine point tweezers</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS5045</td>
			<td>alternative suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dish, 100 mm diameter</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3160</td>
			<td>can substitute other glass petri plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 well plate</td>
			<td>Corning Falcon&#160;</td>
			<td>353046</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12 well plate</td>
			<td>Nunc&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24 well plate</td>
			<td>Cellstar, Greiner bio-one</td>
			<td>662-160</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp hathery kit</td>
			<td>San Francisco Bay; drsfostersmith.com</td>
			<td>CD-154005</td>
			<td>option for growing brine shrimp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyrex baking dish</td>
			<td>common in grocery stores</td>
			<td></td>
			<td>option for growing brine shrimp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artificial seawater mix 50 gal or more&#160;</td>
			<td>Instant Ocean; drsfoster-smith.com</td>
			<td>CD-116528</td>
			<td>others brands may suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tub for stock ASW preparation</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>common 25 gallon plastic trash can OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Carboy</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>716391</td>
			<td>For working stock of ASW @ 12 ppt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, Graduated, 4,000ml</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>B199</td>
			<td>For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope and light source</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td></td>
			<td>with continuous 1 - 40x magnification&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing complete polyp regeneration from the aboral physa of the starlet sea anemone nematostella vectensis

الكائنات المجوفة، وعلى وجه التحديد هيدرا، كانت أول الحيوانات أظهرت لتجديد الهياكل التالفة أو المقطوعة، وبالفعل مثل هذه الدراسات أطلقت القول التحقيق البيولوجية الحديثة من خلال عمل Trembley منذ أكثر من 250 عاما. في الوقت الحاضر وقد شهدت دراسة تجديد تجدد باستخدام كل الكائنات التجدد &quot;الكلاسيكية&quot;، مثل الهيدرا، المستورقات وUrodeles، فضلا عن طائفة واتساع الأنواع التي تغطي مجموعة من metazoa، من الإسفنج من خلال الثدييات. وإلى جانب الفائدة الجوهرية بوصفها ظاهرة بيولوجية، وفهم كيفية عمل تجديد في مجموعة متنوعة من الأنواع سوف تبلغنا حول ما إذا كانت عمليات التجدد تشترك الميزات و / أو الأنواع الشائعة أو الآليات الخلوية والجزيئية للسياق معين. وشقائق البحر نجيمة، Nematostella vectensis، هو كائن نموذجا الناشئة على التجدد. مثل هيدرا، Nematostella هو عضو في الأسرة في اللغات القديمة، القراصات، ولكن في غضون رانه الطبقة الحيزهير، كليد شقيقة لالهدروانيات هذا هو أكثر تطويريا القاعدية. والجوانب وبالتالي من تجديد في Nematostella تكون مثيرة للاهتمام لمقارنة ومع تلك هيدرا والكائنات المجوفة الأخرى. في هذه المقالة، فإننا نقدم وسيلة لشطر، ومراقبة وتصنيف تجديد نهاية مجافي الفم من الكبار Nematostella، وهو ما يسمى المنفخة. والمنفخة يخضع بطبيعة الحال الانشطار كوسيلة من التكاثر اللاجنسي، وإما الانشطار الطبيعي أو بتر اليدوي للالمنفخة يؤدي إعادة النمو والإصلاح من الأشكال التضاريسية المعقدة. هنا قمنا دونت هذه التغييرات الشكلية البسيطة في نظام Nematostella التجديد التدريج (وNRSS). نحن نستخدم NRSS لاختبار آثار الكلوروكين، المانع من وظيفة الليزوزومية الذي يمنع الالتهام الذاتي. وأظهرت النتائج أن تجديد هياكل ورم، لا سيما المساريقا، غير طبيعي عندما يتم تثبيط الالتهام الذاتي.

يظهر تطور الأحداث المورفولوجية خلال تجديد في المنفخة قطعت في الشكل 1A، الذي يتضمن آراء تمثيلية من المنفخة في كل مرحلة NRSS. يشار إلى نموذجي موقع قطع المنفخة على الكبار (السهام). تظهر الصور في الشكل 1A تجديد التدريجي للهياكل الفم والجسم...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis at JoVE.com

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

حمل كاملة ورم التجديد من مجافي الفم المنفخة من البحر شقائق النعمان النجيم<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

inducing-complete-polyp-regeneration-from-aboral-physa-starlet-sea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

8.4K Views.  Stony Brook University. Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Video: Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

اشتقاق كفاءة خلايا الظهارة الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

يعاير بالسكان خلية الدم لل<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; اليرقة

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

و&quot;حيدة الخلية والروتيفر طريقة الاستزراع متعدد الأنواع&quot; كاملة ومحدثة للتربية اسماك الزرد الأولى تغذية

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

الكيميائية البتر والتجديد البلعوم في البلاناريا mediterranea شميدتيا

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

أساليب لدراسة التجديد في ستنتور

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

أسلوب مبسط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

جيل أورجانويد الجلد 3D من سلك المستمدة من الدم الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the life of the animal. Following in vitro fertilization and de-jellying, zygotes are allowed to develop for 24 h at room temperature to reach the early- to mid-gastrula stage. The gastrula embryos are then placed on an agarose gel bed in a Petri dish containing seawater. Under the dissecting microscope, a tungsten needle is used to surgically separate an aboral tissue fragment from each embryo. Post-surgery embryos are then allowed to heal and continue development. Genomic DNA is extracted from the isolated tissue fragment and used as a template for locus-specific PCR. The genotype can be determined based on the size of PCR products or presence/absence of allele-specific PCR products. Post-surgery embryos are then sorted according to the genotype. The duration of the entire genotyping process depends on the number of embryos to be screened, but it minimally requires 4&#8211;5 h. This method can be used to identify knockout mutants from a genetically heterogeneous population of embryos and enables analyses of phenotypes during development.

The goal of this protocol is to genotype the sea anemone Nematostella vectensis during gastrulation without sacrificing the embryo.

الكتابة الجينية لعنابة النعمان البحرية خلال التنمية المبكرة

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

جيل أورجانويدس من القنوات الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...