ونود أن نشكر أليخاندرو سانشيز ألفارادو، الذين أيدوا في التحسين الأولية وتطوير هذه التقنية. العمل في مختبر كارولين أدلر معتمد من قبل جامعة كورنيل أموال بدء التشغيل.

1-إعداد
<ol><li>
إعداد المياه المستورقات 17<ol>
<li>الحفاظ على بلاناريانس في محلول ملح X Montjuïc 1. لإعداد البلاناريا المياه، جعل الحلول الأسهم الفردية كاكل 1 م2، 1 م MgSO4، 1 "مجكل م"2، 1 م بوكل وكلوريد الصوديوم م 5 في الماء عالي النقاوة. عامل التصفية-تعقيم مع تخزين طويل الأجل فيلتيرفور أعلى زجاجة 0.2 ميكرون. ملاحظة: استخدم فقط عالي النقاوة المياه (مع أومه MΩ 18.2 عند 25 درجة مئوية) لإعداد مونتجويك الأملاح.</li>
		<li>إعداد مخزون 1 لتر من 5 س الحل الملح، الجمع بين 5 مل م 1 كاكل2, 5 مل من 1 م MgSO4، 0.5 مل من مجكل2، 0.5 مل من بوكل و 1.6 مل م 5 حلول كلوريد الصوديوم في الماء عالي النقاوة 900 مل. لهذا الحل، إضافة ز 0.504 ناكو3 وآثاره للخلط. قم بضبط درجة الحموضة 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك.</li>
		<li>تمييع هذا 5 × الحل الأسهم 1 × تركيز العمل في الماء عالي النقاوة في حاوية معقمة مثل كاربوي قدرة كبيرة (انظر الجدول للمواد). استخدام هذا الحل X 1 للحفاظ على بلاناريانس مخصي. ملاحظة: كبديل للحل الملح مونتجويك، استخدام مياه الينابيع التي تم شراؤها محلياً أو عالي النقاوة المياه التي تحتوي على ملح حوض السمك متاحة تجارياً مزيج (انظر الجدول للمواد) في غرام/لتر of0.5 تركيز18.</li>
		<li>لمنع العدوى البكتيرية في ثقافة ثابتة19، الحفاظ على بلاناريانس في المياه التي تحتوي على المضادات الحيوية. إعداد 50 ملغم/مل الحل الأسهم من كبريتات الجنتاميسين في الماء عالي النقاوة وتعقيم عامل التصفية. للحاويات حيث يتم الاحتفاظ بالحيوانات، إضافة كبريتات الجنتاميسين لتركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل (تخفيف 1: 1000).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد معجون الكبد
	<ol>
<li>كما تزدهر بلاناريانس على نظام غذائي من العضوية، شراء اللحوم بنك الاحتياطي الفيدرالي العشب الكبد، الكبد الطازج وعملية ضمن 24 h. إزالة الكبسولة الغشائي تغليف الكبد التي يسقط بلطف. قطع الكبد إلى مكعبات ~ 1 سم، واستخدام شفرة كشط قبالة وتجاهل جميع عروق الكبد والشرايين.</li>
		<li>مسرات استخدام مطحنة المواد غذائية أو الطعام معالج قطعة الكبد وثم نقله من خلال مصفاة سلك شبكة غذاء. الجمع بين أكياس الحلويات، والاستغناء عن الحقن أو أطباق بتري 35 ملم. قبل اﻹطعام، الطرد المركزي برفق لإزالة فقاعات الهواء.</li>
		<li>تخزين مختبرين للكبد في-80 درجة مئوية لتصل إلى السنة، وذوبان الجليد قبل استخدام. بعد ذوبان الجليد، إعادة تجميد أي بقايا الكبد مرة واحدة، أو تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
الحفاظ على الحيوانات
	<ol>
<li>بلاناريانس سوف تنمو ويتقلص بأحجام مختلفة تبعاً لتواتر التغذية. آر بلاناريانس كل أسبوع (مرة واحدة كل 14 يوما). للمدى الطويل معظم الثقافات، استخدام حاويات بلاستيكية بأحجام مختلفة (انظر الجدول للمواد).</li>
		<li>لعلف الحيوانات واستخدام ملعقة معدنية أو بيبيت نقل البلاستيك لتضع قطره الحجم البازلاء من الكبد في مربع. السماح للحيوانات للأكل حاء – 1-2 إزالة المواد الغذائية المتبقية قبل تنظيف المربع.</li>
		<li>تنظيف الديدان مرتين في أسبوع إذا كان بنك الاحتياطي الفيدرالي (مرة واحدة مباشرة بعد الرضاعة ومرة بعد ذلك بيومين)، أو مرة واحدة في أسبوع إذا لم تغذي. لتنظيف، تصب المياه في كوب بلاستيك بصب الماء بعناية مع الاحتفاظ بلاناريانس في المربع. مسح سطح مربع مع منشفة ورقية، ثم كرر على جميع الجوانب حتى يصبح المربع نظيفة.</li>
		<li>استبدال الماء (إلى حوالي ¾ حجم مربع) وإضافة الجنتاميسين لتركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل. تخزن الحيوانات في خزانة مظلمة أو في حاضنة 20 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تحديد ديدان
	<ol>
<li>حدد الديدان غذيت 5-7 أيام السابقة. ملاحظة: أنها أكثر صعوبة إلى حد كبير إلى بتر فارينجيس من الديدان التي قد تم تغذية مؤخرا (1-2 أيام قبل البتر). تغذية الحيوانات أيضا أكثر حساسية لأزيد الصوديوم.</li>
		<li>حدد الديدان التي تقريبا 6 مم في الطول. ولتقدير حجم الدودة، أنه نقل إلى طبق بتري ماصة نقل بلاستيك باستخدام. ضع المسطرة في شقة 6-أو ورق الرسم البياني 5 مم × 5 مم تحت طبق بيتري وقياس طول الدودة بينما كان يزحف. ملاحظة: الديدان أصغر من 6 مم في الطول أكثر صعوبة بتر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد أزيد الصوديوم
	<ol>
<li>تحضير حلاً 100 ملم بتذويب مسحوق أزيد الصوديوم في المياه المستورقات. تنبيه: أزيد الصوديوم السامة وينبغي التعامل معها بعناية. عدم تجاهل أزيد الصوديوم هباء. وبعد الاستخدام، أنه جمع كل على حدة للتخلص منها كنفايات خطرة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-البلعوم البتر
<ol><li>مكان الديدان في قطرها 35 ملم طبق بيتري. بعناية إزالة جميع البلاناريا المياه من الطبق باستخدام بيبيت نقل بلاستيك. ملاحظة: كحد أقصى من 20 ملم 6 الديدان يمكن استيعابها بشكل مريح في طبق بهذا الحجم.</li>
	<li>ضع الصحن تحت المجهر وضبط التكبير بحيث يمكن مشاهدة الديدان متعددة في وقت واحد (مثلاً 10 X التكبير). استبدال المياه البلاناريا بمحلول أزيد الصوديوم 100 مم. ملاحظة: لطبق بتري 35 ملم، حوالي 5 مل أزيد الصوديوم غير كافية. وينبغي أن تغرق الحل الكامل بلاناريانس. ضبط حجم الحل للاطباق أكبر عند الضرورة.</li>
	<li>مراقبة الحيوانات تحت المجهر وتمتنع عن تحريك الطبق لأول 3-4 دقيقة.</li>
	<li>مراقبة البثق البلعوم عن طريق المجهر؛ وسوف تبرز من الحقيبة البلعوم البلعوم وتمتد بالكامل (حوالي 1 مم في الطول) كما هو مبين في الشكل 1 باء. ملاحظة: من المهم الانتظار لحين انتهاء البلعوم تمديد تماما قبل المضي قدما. وبمجرد البلعوم يخرج من الحيوان، يأخذ التمديد الكامل تقريبا 1 دقيقة.</li>
	<li>استخدام بيبيت نقل بلاستيك لبخ الحيوانات حول الطبق. امتصاص الحيوانات إلى بيبيت وقسرا الإفراج عنهم إلى الطبق بضع مرات. إذا مددت البلعوم هو تماما، هذا بيبيتينج قوية سوف يؤدي إلى فصل.</li>
	<li>وبدلاً من ذلك، فهم البلعوم أما عمودياً على طوله، أو أفقياً على طول محيط استخدام زوج من غرامة الملقط (انظر الجدول للمواد) كما هو مبين في الشكل 1. مع البلعوم مقروص في الملقط، رفع الحيوان صعودا نحو غضروف. كما أثير الحيوان، سوف يسبب التوتر السطحي البلعوم لفصل من الحيوان. ملاحظة: يمكن استخدام هذا الأسلوب لإزالة فارينجيس الحيوانات الصغيرة (1-3 ملم في الطول) حيث يحوم قوية ليست كافية. تجنب دس أو خلاف ذلك مما أسفر عن إصابة جسم الحيوان.</li>
	<li>استخدام بيبيت نقل، نقل الحيوانات المبتورة إلى طبق جديد يحتوي على المياه العذبة المستورقات.</li>
	<li>بمجرد نقل، بترت شطف الحيوانات جيدا في المياه المستورقات، تماما تبادل المياه ثلاث مرات. نقل إلى طبق جديد يحتوي على الماء المستورقات مع 50µg/مل جنتاميسين. ملاحظة: تبادل المخزن المؤقت كاملة خلال هذه يغسل ثلاث ضروري لضمان التخلص أزيد الصوديوم.</li>
	<li>في اليوم التالي، استبدال الماء في الطبق مع المياه العذبة المستورقات التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين. كرر كل يوم بعد ذلك.</li>
</ol>3-تقييم لإزالة البلعوم بعد بتر
<ol><li>دراسة الحيوانات تحت مجهر (مع 10-20 X التكبير) لتحديد ما إذا كانت بقعة مظلمة قد ظهرت بعد نجاح إزالة البلعوم، كما هو مبين في الشكل 2 ألف.</li>
	<li>وبدلاً من ذلك، إصلاح والتبييض الحيوانات وفقا لبروتوكول وصف بيرسون et al. 20-الحيوانات نقع بين عشية وضحاها في 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) أو ستريبتافيدين فلوريسسينتلي مترافق (1: 500 1 مغ/مل مخففة في 1 × الفوسفات خفف المحلول الملحي الذي يحتوي على 0.3% تريتون العاشر). جبل الحيوانات على الشرائح في glycerol/20% 80% 1 × الفوسفات خفف المحلول الملحي والصورة تحت ستيريوميكروسكوبي نيون (الشكل 2). ملاحظة: تم القبض على جميع الصور في هذه المخطوطة في ستيريوميكروسكوبي فلورية ذات هدف X 1.0.</li>
</ol>4-تقييم التجدد البلعوم بقياس تغذية السلوك
<ol><li>
إعداد الكبد
	<ol>
<li>نقل الكمية المطلوبة من معجون الكبد إلى ميكروسينتريفوجي أو أنبوب مخروطي. تدور بإيجاز لإزالة فقاعات الهواء. تقدير حجم الكبد، ثم قم بإضافة المياه المستورقات إلى 1/5 حجمها، و 2 في المائة من الحجم الإجمالي في تلوين الطعام حمراء. على سبيل المثال، إلى 1000 ميليلتر للكبد لصق، إضافة 200 ميليلتر من الماء المستورقات و 24 ميليلتر لتلوين الطعام.</li>
		<li>باستخدام مدقة بلاستيكية أو ماصة تلميح أو ملعقة معدنية، مزيج دقيق حتى تلوين الطعام موزعة بالتساوي في لصق الكبد. تدور مرة أخرى بإيجاز. يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية عن ح 24 لصق الكبد أو المجمدة في مختبرين في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.</li>
		<li>إذا كان اختبار الحيوانات تصل إلى 25، إعداد 25 ميليلتر من معجون الكبد كل طبق (حوالي 1 ميليلتر من معجون الكبد للحيوان الواحد).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تغذية الحيوانات
	<ol>
<li>سبعة أيام بعد البتر الكيميائية ونقل الحيوانات إلى طبق بتري جديدة. إذا كان اختبار الحيوانات 10-15، استخدم طبق 35 مم؛ وينبغي اختبار الحيوانات أكثر من 15 في طبق بتري 60 ملم. إبقاء الحيوانات في الظلام، دون عائق، لقرابة 1 ح قبل التغذية.</li>
		<li>باستخدام مقص، زيادة عرض تلميح ماصة P200 بالتشذيب تقريبا ½ سم قبالة نهاية الضيقة. بيبيت 25 ميليلتر لصق الكبد الأحمر إلى الطبق. ملاحظة: تقليم النهاية يجعل بيبيتينج لصق الكبد لزج أسهل. لمنع الكبد من تطفو على السطح، تلمس في تلميح إلى الجزء السفلي من الطبق أثناء الاستغناء.</li>
		<li>السماح للحيوانات لإطعام لمدة 30 دقيقة.</li>
		<li>نقاط عدد الحيوانات التي قد أكلت بوضع الحيوانات على خلفية بيضاء أو فحصها تحت مجهر مع 10-20 X التكبير.</li>
		<li>بعد الرضاعة، إزالة الكبد من الطبق ونظيفة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+for+animal+regeneration.">The cellular basis for animal regeneration.</a> Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+and+Cellular+Choreography+of+Appendage+Regeneration.">The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration.</a> Cell. 165, 1598-1608 (2016).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).</li><li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish.">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62, 232-240 (2013).</li><li>Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+growth+in+Drosophila+imaginal+discs+is+regulated+by+Wingless+and+Myc.">Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc.</a> Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).</li><li>Smith-Bolton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Imaginal+Discs+as+a+Model+of+Epithelial+Wound+Repair+and+Regeneration.">Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration.</a> Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).</li><li>Newmark, P. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+your+father's+planarian:+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics.">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).</li><li>Reddien, P. W., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+planarian+regeneration.">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).</li><li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration.">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li><li>Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoblast+specialization+in+regeneration+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).</li><li>van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+reveals+functionally+distinct+classes+within+the+planarian+stem+cell+compartment.">Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment.</a> Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).</li><li>Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+amputation+of+the+pharynx+identifies+a+FoxA-dependent+regeneration+program+in+planaria.">Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria.</a> Elife. 3, e02238 (2014).</li><li>Adler, C. E., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHRED-1+is+a+divergent+neurexin-1+homolog+that+organizes+muscle+fibers+and+patterns+organs+during+regeneration.">PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration.</a> Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).</li><li>Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+using+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system.">Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system.</a> Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).</li><li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C+elegans+chemotaxis+assay.">C elegans chemotaxis assay.</a> J. Vis. Exp. , e50069 (2013).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).</li><li>Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Stem+Cell+Motility+In+Vivo+Based+on+Immunodetection+of+Planarian+Neoblasts+and+Tracing+of+BrdU-Labeled+Cells+After+Partial+Irradiation.">Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation.</a> Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).</li><li>Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomics+screen+in+planarians+reveals+regulators+of+whole-brain+regeneration.">A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Arnold, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+shifts+in+endogenous+microbiota+impede+tissue+regeneration+via+distinct+activation+of+TAK1/MKK/p38.">Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians.">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li><li>LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+Absence+Does+Not+Regulate+Planarian+Stem+Cells+during+Eye+Regeneration.">Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration.</a> Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).</li><li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dopaminergic+neurons+after+6-hydroxydopamine-induced+lesion+in+planarian+brain.">Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain.</a> J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).</li><li>Wilson, D. F., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azide+inhibition+of+mitochondrial+electron+transport.+I.+The+aerobic+steady+state+of+succinate+oxidation.">Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).</li><li>Duncan, H. M., Mackler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Transport+Systems+of+Yeast:+III.+Preparation+and+properties+of+cytochrome+oxidase.">Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).</li><li>Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-specific+composition,+assembly+and+kinetics+of+stress+granules+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).</li><li>Cebri&#224;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+nervous+system+in+the+model+planarian+Schmidtea+mediterranea:+An+immunocytochemical+study.">Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study.</a> Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).</li><li>Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Neuropeptide-Coding+Genes+Involved+in+Planarian+Pharynx+Extension.">Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension.</a> Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).</li><li>Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphic+regeneration+of+the+distal+part+of+the+planarian+pharynx.">Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx.</a> Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).</li><li>Bueno, D., Espinosa, L., Bagu&#241;&#224;, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+pharynx+regeneration+in++tail+fragments+monitored+with+cell-specific+monoclonal+antibodies.">Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies.</a> Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).</li><li>Hyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

ويصف هذا البروتوكول طريقة التذرية انتقائية البلعوم باستخدام أزيد الصوديوم. استخدمت دراسات أخرى الاجتثاث المستهدفة في بلاناريانس تعديل عملية جراحية لإزالة photoreceptors21 أو العلاج الدوائي ليجتذ تتميز الخلايا العصبية22. واحد ميزة هامة من بتر الكيميائية عبر الطرق الحا?...

التجديد هو ظاهرة تحدث في جميع أنحاء المملكة الحيوانية، مع قدرات التجدد بدءاً من تجديد كامل الجسم في بعض اللافقاريات إلى قدرات أكثر تقييداً في الفقاريات1. استبدال أنسجة وظيفية عملية معقدة، وكثيراً ما يستتبع إعادة متزامنة بأنواع متعددة من الخلايا. على سبيل المثال، تجديد أطرافهم [سلمندر]، خلايا الاوستيوبلاستس، chondrocytes، والخلايا العصبية، والعضلات، والخلايا الظهارية في حاجة إلى أن يكون محل2. هذه أنواع الخلايا التي تم إنشاؤها حديثا تحتاج أيضا إلى أن تنظم بشكل صحيح لتيسير وظيفة جديدة من أطرافهم. فهم هذه العمليات المعقدة تتطلب التقنيات التي تركز على التجديد لأنواع محددة من الخلايا واندماجها في الأجهزة.
واحدة من الاستراتيجيات المستخدمة لتبسيط دراسة استجابات التجدد هو الاجتثاث المستهدفة أما بعض أنواع الخلايا أو مجموعات أكبر من الأنسجة. على سبيل المثال، في الزرد، التعبير عن نيتروريدوكتاسي في أنواع محددة من الخلايا يؤدي إلى تدميرها بعد تطبيق ميترونيدازول3،4. في اليرقات المورفولوجية ، يمكن التعبير عن الجينات برو-أبوبتوتيك تحت المروجين الأنسجة على حدة بشكل انتقائي يجتذ مناطق محددة من5،إيماجينال القرص6. كل من هذه الاستراتيجيات تسبب التلف السريع الخاضعة للرقابة، وقد استخدمت لتشريح الآليات الجزيئية والخلوية المسؤولة عن التجدد.
في هذه المخطوطة، يمكننا وصف أسلوب انتقائي يجتذ جهازا أسرة تسمى البلعوم في البلاناريا mediterranea شميدتيا. بلاناريانس نموذج كلاسيكية للتجدد، معروفة بقدرتها التجدد غزير، حيث يمكن أن تنمو شظايا دقيقة حتى الحيوانات كله 7،8. لديهم عدد سكانها كبيرة وغير متجانسة من الخلايا الجذعية تتكون من خلايا pluripotent وفروعه المقيدة بالنسب9،،من1011. تتكاثر هذه الخلايا والتفريق ليحل محل جميع الأنسجة المفقودين، بما في ذلك البلعوم ونظم الجهاز العصبي والجهاز الهضمي والإخراج، والعضلات والخلايا الظهارية9،،من1012. وفي حين أننا نعرف أن هذه الخلايا الجذعية الشروع في التجديد، نحن لا يفهم تماما الآليات الجزيئية التي تدفع بهم استبدال كل هذه الأنواع المختلفة من الخلية. يمكن أن تساعد الأساليب مما أسفر عن إصابة محددة بأن الحصول على ردود محددة من الخلايا الجذعية تحدد هذه العملية المعقدة.
البلعوم عبارة عن أنبوب أسطواني كبير، واللازمة لتغذية، ويحتوي على الخلايا العصبية، والعضلية، والخلايا الظهارية والافرازيه13،29. عادة مخبأة في حقيبة على الجانب البطني للحيوان، فهي تمتد من خلال جسم الحيوان واحد فتح عند استشعار وجود الغذاء. إلى بتر البلعوم بشكل انتقائي، ونحن نقع بلاناريانس في أزيد صوديوم تسمى كيميائية، مخدر استخداماً في C. ايليجانس14،،من1516. استخدامها في بلاناريانس وأبلغت أولاً أدلر et al.، في عام 201412. في غضون دقائق تعرض لأزيد الصوديوم، بلاناريانس قذف بهم فارينجيس، ويفصل البلعوم مع الانفعالات لطيف، من الحيوان. نشير إلى هذه الخسارة كاملة وانتقائية البلعوم ك "بتر الكيميائية". أسبوع واحد بعد بتر الأطراف، البلعوم تعمل بكامل طاقتها هو استعادة12. لأن البلعوم مطلوب للتغذية، يمكن قياس التجدد الوظيفية برصد سلوك التغذية. أدناه، ونحن تصف البروتوكول لبتر الكيميائية، وتقييم تجديد البلعوم وإعادة تغذية السلوك.

<table><tbody><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-3</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65-3</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Acros/VWR</td><td>41341-5000</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>196770010</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>207790050</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>123360010</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot</td><td>ThermoFisher Scientific/VWR</td><td>2324-0015</td><td>Storing planaria water</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Spectrum Brands</td><td>Amazon</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-100P</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Mincing liver&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Disposable pastry bags-16&amp;rdquo;, 12 pack</td><td>Wilton</td><td>Amazon</td><td>Liver aliquots</td></tr><tr><td>5 mL syringes</td><td>BD/VWR</td><td>309647</td><td>Liver aliquots</td></tr><tr><td>Petri dishes-35mm/60mm</td><td>Greiner Bio-One/VWR</td><td>82050-536/82050-544</td><td></td></tr><tr><td>Plastic containers (various sizes)</td><td>Ziploc</td><td>Amazon</td><td>Housing planarians in static culture</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Globe Scientific</td><td>138030</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - Dumont Tweezer, Style 5</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>72700-D (0203-5-PO)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-1</td><td></td></tr></tbody></table>

chemical amputation and regeneration of the pharynx in the planarian schmidtea mediterranea

بلاناريانس هي فلاتورمس التي فعالة للغاية في التجديد. أنهم مدينون بهذه القدرة على عدد كبير من الخلايا الجذعية التي يمكن الاستجابة بسرعة لأي نوع من الضرر. نماذج الإصابات الشائعة في هذه الحيوانات إزالة كميات كبيرة من الأنسجة، مما يضر بأجهزة متعددة. للتغلب على هذه الأضرار الأنسجة واسعة، يصف لنا هنا طريقة لإزالة جهاز واحد، البلعوم، بشكل انتقائي في البلاناريا mediterranea شميدتيا. نحقق ذلك بالحيوانات مغطس بمحلول يحتوي على أزيد الصوديوم مثبطات السيتوكروم أوكسيديز. تعرض موجزاً لأزيد الصوديوم يسبب بثق البلعوم من الحيوان، والتي نسميها "الكيميائية البتر." بتر الكيميائية يزيل البلعوم كامل، ويولد جرحا صغيراً حيث تولي البلعوم للامعاء. وبعد الشطف واسعة النطاق، تجديد جميع الحيوانات المبتورة البلعوم تعمل بكامل طاقتها في أسبوع واحد تقريبا. الخلايا الجذعية في بقية أنحاء الجسم محرك التجديد البلعوم الجديدة. هنا، نحن نقدم مفصل البروتوكول لبتر الكيميائية، ووصف طرق غذائها والسلوكية على السواء لتقييم نجاح البتر والتجديد.

التعرض لأزيد الصوديوم يعطل حركية طبيعية من بلاناريانس، مما تسبب في الحيوانات على امتداد وتلوي. قوة هذه الحركات البلعوم الخروج من الجانب البطني للحيوان، وبعد حوالي 6 دقائق في محلول أزيد الصوديوم، يمكن رؤية تلميح أبيض البلعوم (الشكل 1B-اللوحة اليسرى)</str...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea at JoVE.com

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

الكيميائية البتر والتجديد البلعوم في البلاناريا mediterranea شميدتيا

البلاناريا mediterranea شميدتيا نموذج ممتاز لدراسة الخلايا الجذعية وتجديد الأنسجة. ويصف هذا المنشور أسلوب لإزالة جهاز واحد، البلعوم، بشكل انتقائي بتعريض الحيوانات لأزيد الصوديوم الكيميائية. ويوجز هذا البروتوكول أيضا أساليب لرصد التجديد البلعوم.

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

chemical-amputation-regeneration-pharynx-planarian-schmidtea

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K Views.  Cornell University. البلاناريا mediterranea شميدتيا نموذج ممتاز لدراسة الخلايا الجذعية وتجديد الأنسجة. ويصف هذا المنشور أسلوب لإزالة جهاز واحد، البلعوم، بشكل انتقائي بتعريض الحيوانات لأزيد الصوديوم الكيميائية. ويوجز هذا البروتوكول أيضا أساليب لرصد التجديد البلعوم.

Video: Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

يعاير بالسكان خلية الدم لل<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; اليرقة

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

حمل كاملة ورم التجديد من مجافي الفم المنفخة من البحر شقائق النعمان النجيم<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

الجراحية تذرية الفحص لدراسة التجديد العين في مستورقات

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

مقايسة حركية بلاناية لقياس خصائص المنتجات الطبيعية ذات الخواص الحيوية

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Biochemistry

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

الكبار الماوس أرقام بتر وتجديد: نموذج بسيط للتحقيق في تكوين بلاسيما الثدييات والتحجر intramembranous

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

فحوصات الوراثية الدوائية وظيفية للتلاعب تجديد مستورقة Dugesia تفرضه اليابان</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Biology

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

تجميد مستورقة، التشعيع جزئي، والنسج

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

بلانكوري Scrunching كما قراءات سلوكية كمية لتحسس المحفزات الضارة

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Planarian Ovary Dissection for Ultrastructural Analysis and Antibody Staining

Accessibility to germ cells allows the study of germ cell development, meiosis, and recombination. The sexual biotype of the freshwater planarian, Schmidtea mediterranea, is a powerful invertebrate model to study the epigenetic specification of germ cells. Unlike the large number of testis and male germ cells, planarian oocytes are relatively difficult to locate and examine, as there are only two ovaries, each with 5-20 oocytes. Deeper localization within the planarian body and lack of protective epithelial tissues also make it challenging to dissect planarian ovaries directly. 
This protocol uses a brief fixation step to facilitate the localization and dissection of planarian ovaries for downstream analysis to overcome these difficulties. The dissected ovary is compatible for ultrastructural examination by transmission electron microscopy (TEM) and antibody immunostaining. The dissection technique outlined in this protocol also allows for gene perturbation experiments, in which the ovaries are examined under different RNA interference (RNAi) conditions. Direct access to the intact germ cells in the ovary achieved by this protocol will greatly improve the imaging depth and quality and allow cellular and subcellular interrogation of oocyte biology.

<meta charset="utf8"></head><body>تشريح المبيض المستوي للتحليل الهيكلي وتلطيخ الأجسام المضادة

This protocol presents steps taken to dissect ovaries in the freshwater planarians, Schmidtea mediterranea. The dissected ovaries are compatible for antibody immunostaining and ultrastructural analysis with transmission electron microscopy to study the cell biology of the oocytes and somatic cells, providing an imaging depth and quality that were previously inaccessible.

الكيميائية البتر والتجديد البلعوم في البلاناريا mediterranea شميدتيا

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

يعاير بالسكان خلية الدم لل

حمل كاملة ورم التجديد من مجافي الفم المنفخة من البحر شقائق النعمان النجيم