يمكّن هذا البروتوكول الباحث من تحديد النيمونات البحرية المتحولة أثناء تولد الأجنة المبكر بحيث يمكن تحليل النمط الظاهري التنموي بعد الجنين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لأسلوب الحياة البحرية الفردية في وقت مبكر من التناضح دون التضحية بحياة الحيوان. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون ميغيل سيلفا، وهو طالب دراسات عليا من مختبري.
في اليوم السابق لتفريخ الحث ، ضع نزعة النعمة الخيطية في vectenella في حاضنة درجة الحرارة والضوء ، وبرمجة الحاضنة بحيث تتعرض الحيوانات لثماني ساعات من الضوء عند 25 درجة مئوية. في اليوم التالي، إزالة الحيوانات من الحاضنة وتركها على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة مع الضوء على للسماح بالتفريخ، والتي سوف تحدث في غضون ساعة ونصف إلى ساعتين التالية. استخدم ماصة نقل يتم قطع طرف لتكبير الفتحة لوضع حزم البويضات من حاوية الإناث إلى حاوية ذكور تحتوي على الحيوانات المنوية وتركها في حاوية الذكور لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح بالتخصيب.
بعد الإخصاب ، إلى dejelly حزم البيض ، ووضعها في مياه البحر التي تحتوي على 3 ٪ السيستين على طبق بيتري الزجاج والتحريض بلطف على شاكر لمدة 12 دقيقة. ثم تفريق كتل مع ماصة بلاستيكية والاستمرار في التحريض لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق أخرى حتى dejellied تماما. الحفاظ على البيض المخصب على نفس الطبق في 16 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة.
في اليوم التالي، قم بإعداد العازلة استخراج الحمض النووي كما هو موضح في المخطوطة، وخلط جيدا من قبل دوامة، و aliquot ذلك في أنابيب PCR عن طريق إضافة 20 ميكرولترات لكل أنبوب. تذوب 1٪ agarose في مياه البحر، وتصب في طبق بيتري لتغطية الجزء السفلي، وتبرد على أعلى مقاعد البدلاء لجعل سرير هلام. غطي سرير الجل بمياه البحر العذبة.
نقل الأجنة ما بعد الإخصاب على مدار 24 ساعة باستخدام ماصة في طبق بيتري الذي يحتوي على هلام agarose. إدراج إبرة التنغستن في حامل الحاجة وتعقيم عن طريق غمس طرف في الكحول ووضعه في اللهب لحرق الكحول. تحت مجهر تشريح، وجعل الاكتئاب على agarose باستخدام إبرة التنغستن لإزالة قطعة من أغاروز السطح حول حجم الجنين ليتم التلاعب بها.
ثم، باستخدام إبرة التنغستن، وضع الجنين في الاكتئاب مع الجانب الجانبي التي تواجه لأسفل من أجل تقييد حركة الجنين لجراحة الميكروستور. من أجل إجراء جراحة ناجحة ، من المهم تقييد حركة الجنين. مع إبرة التنغستن ، قم بإزالة قطعة من الأنسجة البورال جراحيًا على طول محور البورال الفموي ، وتقع مقابل فتحة blastoporal الفموية.
مع ماصة P20، نقل الأنسجة المعزولة إلى أنبوب PCR تحتوي على 20 ميكرولترات من العازلة استخراج الحمض النووي. نقل الجنين بعد الجراحة إلى بئر من 24 بئر لوحة تحتوي على ما لا يقل عن 500 ميكرولترات من مياه البحر الطازجة. ووضع لوحة تحتوي على الأجنة بعد الجراحة في حاضنة في 16 درجة مئوية حتى يتم الانتهاء من جينوتوبينغ.
لاستخراج الحمض النووي الجينومي من أجنة واحدة، تدور أولا لفترة وجيزة أسفل أنابيب PCR التي تحتوي على العازلة استخراج الحمض النووي والأنسجة الجنينية المعزولة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. ثم احتضان الأنابيب في 55 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات في حين دوامة لمدة 30 ثانية كل 30 دقيقة لضمان تفكك كتل الخلية وتعزيز تحلل الخلية. بعد تعطيل البروتينات K في 95 درجة مئوية لمدة أربع دقائق، وإعداد تفاعل PCR باستخدام الحمض النووي الجينوم المستخرج كقالب لتضخيم موضع الاهتمام.
التصميم المطلوب التمهيدي كما هو موضح في المخطوطة. إعداد 20 ميكرولتر تفاعل PCR. بعد اكتمال PCR، تشغيل agarose هلام electrophoresis لتحديد حجم ووجود أو غياب منتجات PCR، مع التأكد من ضبط حالة agarose جل electrophoresis اعتمادا على الحجم المتوقع من منتجات PCR.
استخدم نتائج PCR فيما يتعلق بالحجم والوجود أو الغياب أو منتجات PCR لتعيين نمط جيني لكل جنين بعد الجراحة ثم فرز الأجنة وفقًا للنمط الجيني الخاص بها. يحتوي جينوم نيماتوستيلا على موضع واحد يقوم بترميز بروتين السلائف لـ neuropeptide، GLWamide. ثلاثة أليل متحولة بالضربة القاضية في مركز الغفران تم الإبلاغ عنها سابقاً
نتائج PCR من الأجنة عينة عشوائيا بين ذرية من الصليب F1 بين أنثى واحدة heterozygous تحمل أ أليل بالضربة القاضية والذكور heterozygous تحمل أليل C بالضربة القاضية تظهر أنواع جينية مختلفة. الأجنة واحد واثنين تظهر فرقة PCR واحدة المقابلة للحجم المتوقع من أ أليل بالضربة القاضية. الأجنة ثلاثة وستة تظهر اثنين من العصابات PCR مع الأحجام المتوقعة للضوضاء المغلوب أ وC.Embryos أربعة، سبعة، وثمانية تظهر فرقة PCR واحد المقابلة لحجم المتوقع من أليل خروج المغلوب C.
يظهر الجنين 5 لا عصابات، مما يشير إلى عدم وجود ربط التمهيدي. لاستبعاد إمكانية فشل استخراج الحمض النووي الجينومي ، تم تشغيل PCR آخر باستخدام التمهيدي العكسي الذي يمكن أن يرتبط تسلسل نوع البرية. وفي حالة اكتشاف منتج من الـ PCR بحجم متوقع، كان استخراج الحمض النووي الجيني ناجحاً.
في حين أن أي منتج يشير إلى فشل في الاستخراج. وعلى الرغم من أن هذا البروتوكول مصمم لأجنة شقوق البحر، فمن المؤكد أنه من الممكن تطبيق هذه الطريقة على الـ cnidarians الآخرين، مثل الشعاب المرجانية وقناديل البحر، حيث يمكن الوصول إلى المعلومات الجينية والأجنة. بعد هذا الإجراء، يتم استخدام المسوخ المحددة لتقييم النمط الظاهري التنموي.
على سبيل المثال، يمكن استخدام تقنيات الأنسجة مثل الكبت المناعي لتقييم العيوب في مورفولوجيا، في حين يمكن استخدام التهجين في الموقع، والتكرار الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR، و RNA-seq لتقييم العيوب في التعبير الجيني. كما يمكن استخدام التصوير الحي لتقييم العيوب في السلوك أثناء التطور الجنيني، كما هو الحال في اليرقات أو في الاورام الحميدة المبكرة.
