يسهل البروتوكول تشريح عضلة الطيران غير المباشرة التي تحمل علامة GFP من دروسوفيليا في وقت مختلف أثناء تطور الجراء لتقييم التغيرات في التعبير الجيني والبروتيني. باستخدام هذه التقنيات، يمكن تحقيق عينة عالية من عضلات الطيران الغنية مع الحد الأدنى من تدهور البروتين الحمض النووي الريبي مناسبة لRT-PCR، لطخة الغربية، أو النهج omic. هذه التشريحات المتخصصة تتطلب الممارسة والمهارة ، ولكن عدد من pupae التي يمكن تشريحها ونوعية العينات تتحسن مع الخبرة.
إن البرهان البصري على هذا التشريح أمر بالغ الأهمية لتحديد كيفية تمييز عضلات الطيران عن الأنسجة غير العضلية وتسهيل العزلة السريعة لعضلات الطيران عن عينات الجرو. لمرحلة pupae، واستخدام فرشاة الطلاء ترنيد لجمع ونقل ما قبل pupae في طبق بيتري 60 ملليمتر، والجنس من pupae تحت مجهر منظار. يتم تحديد الذكور من خلال وجود الخصيتين، والتي تظهر على أنها كرات شفافة على خوارة معتمة خلاف ذلك.
بعد وضع علامة على الطبق مع الوقت والتاريخ والنمط الجيني للذباب ، سن pupae في حاضنة درجة 25 إلى 27 درجة مئوية حتى المرحلة المناسبة. لتشريح IFM قبل 48 H APF ، استخدم فرشاة طلاء متجمدة لنقل الجراء المُهدَّم بشكل مناسب إلى طبق أسود تشريحي حول 2 /3 مليء بـ PBS المبرد. تحت المجهر الفلورسنت تشريح، واستخدام 5 ملقط لدفع واحد من pupae إلى الجزء السفلي من طبق تشريح الأسود.
ضبط المجهر التكبير والتركيز حتى يمكن تصور pupae بوضوح. باستخدام زوج واحد من ملقط لفهم الأمامي من pupae، كزة pupae مع طرف واحد من زوج ثان من ملقط، قليلا خارج المركز في البطن، خلف الصدر. استخدام أول زوج من ملقط لإزالة النصف الأمامي من حالة pupal، وقرص pupae المكشوفة وراء الصدر مباشرة لفصل البطن من الصدر.
بعد ذلك ، اضغط بلطف على الجزء الأمامي من الصدر لفضح IFMs المسمى بالفلورسنت. ثم، استخدام ملقط لتجاهل الذبيحة المتبقية إلى الجانب الآخر من الطبق، وتشريح pupae اللاحقة بنفس الطريقة. عندما تم تشريح كل من pupae، واستخدام ملقط لجمع ألياف IFM، وتنظيم الألياف في كومة في الجزء السفلي من طبق تشريح الأسود.
استخدام ملقط لدفع أي حطام من مجال الرؤية، وإزالة أي من العضلات IFM غير، والدهون، و بشرة، أو الأنسجة الأخرى غير المرغوب فيها من العينات. ثم، استخدم طرف ماصة مقطوعة لنقل كومة من IFMs إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر تحتوي على 250 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مبردة. لتشريح IFM بعد 48 H APF ، استخدم فرشاة طلاء مُنهية طفيفة لنقل الجراء المُهدَّم على شريط من الشريط اللاصق على الوجهين المثبت على شريحة المجهر.
توجيه pupae في خط، الجانب البطني إلى أسفل، والوجة نحو الجزء السفلي من الشريحة. عندما تم وضع كل من pupae، واستخدام ملقط لندف وبصرف النظر وفتح أول حالة pupal فوق spiracles الأمامية، وشريحة بلطف زوج من ملقط dorsally، نحو الخلفي، وقطع حالة pupal كما تتحرك ملقط. تحرير pupae من القضية المفتوحة ، ونقل على الفور pupae إلى قطرة من برنامج تلفزيوني على شريحة المجهر الثاني.
عندما يتم تحرير جميع من pupae، واستخدام مقص غرامة لقطع البطن من pupae بعيدا عن الصدر، ودفع البطن في كومة منفصلة. عندما تم إزالة جميع الصدريات، استخدم قطعة من الورق الأنسجة لإزالة غالبية برنامج تلفزيوني وكومة البطن. إضافة قطرة من برنامج تلفزيوني الطازجة والمبردة إلى الصدر المتبقية، قبل استخدام مقص لقطع من الرأس على طول محور الجسم الطولي في حركة واحدة لتقسيم الصدر في النصف.
عندما تم تشريح جميع pupae، استخدم 5 ملقط لتحديد واحد من hemisections، وبلطف إدراج نصائح من ملقط واحد فوق وتحت منتصف IFMs. عقد الزوج الأول من ملقط لا يزال, استخدام مقص غرامة لقطع نهاية واحدة من IFM بعيدا عن بشرة والأوتار, قبل تناوب pupae 180 درجة, للسماح الطرف الآخر من IFM أن تكون قطع خالية من بشرة والأوتار. استخدام ملقط لنقل حزمة IFM من الصدر إلى حافة فقاعة برنامج تلفزيوني، وذلك باستخدام التوتر المياه لعقد حزمة في مكان.
ثم، دفع الذبيحة إلى الجانب الآخر من الشريحة، وتشريح بقية IFM بنفس الطريقة. عندما تم جمع كل من IFMs، واستخدام 5 ملقط لإزالة أي شظايا العضلات أو بشرة التي قد وجدت طريقها إلى العينات. ثم استخدام التوتر المياه لالتقاط بلطف IFMs تشريح بين زوج من ملقط، ووضع IFM في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر التي تحتوي على 250 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مبردة.
تُظهر بيانات تسلسل الـ mRNA من نظام الـ BRUNO1 IR IFMs التغيرات في التعبير على مستوى الوحدة الجينية مقارنة ببيانات تسلسل النمط البري. باستخدام كامل البروتيوم الطيفية الكتلة على تشريح IFMs، ويلاحظ تنظيم مماثل في مستويات isoform البروتين والبروتين. بعد إدخال خط فخ البروتين في intron النهائي من Mhc، ويمكن ملاحظة دمج البروتين المسمى GFP في IFM كنقاط اثنين على جانبي خط M-في 90 H APF، بينما في أنسجة عضلات الساق يمكن ملاحظة إشارة GFP بشكل موحد عبر ساركومير M-الخط.
عند استخدام RT-PCR على IFM تشريح، يمكن الكشف عن التبديل isoform Mhc من الحدث exon 34 إلى 37 المسمى GFP إلى الحدث 34 إلى 35 غير المسمى، بين 30 و 48 ساعة بعد تشكيل الجراء في 27 درجة مئوية. من بيانات تسلسل مرنا، الساق والقفز الأنسجة العضلية التعبير عن جميع isoforms Mhc الثلاثة، والحفاظ على التعبير عن isoform المسمى GFP في العضلات الناضجة. فشل كل من Spalt متحولة الرئيسية وBRU1 IR-IFM، لإيقاف التعبير عن isoform Mhc المسمى GFP لأنها تتطور، مما أدى إلى ملف تعريف تعبير isoform تشبه أن من الساق والقفز الأنسجة العضلية.
تذكر أن تشريح ينبغي أن يتم في أقل من 30 دقيقة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي. و، للعناية للحد من التلوث بأنواع الخلايا الأخرى. هذه الطريقة تولد عينات من IFM المخصب مناسبة للنهج الكيميائية الحيوية مثل RT-PCR، أو النشاف الغربي، فضلا عن نهج نمط omic، مثل الطيف الشامل، تسلسل الإنتاجية العالية، ضبط التشكل الكروماتين، والمستقلولوميات.
ويمكن أن تكمل هذه التشريحات الأساليب الجينية القوية في دروسوفيليا ببيانات على مستوى النظم من أجل التحقيق في الآليات الأساسية للتنمية وتنظيم الجينات.
