الكتاب ليس لديهم الاعترافات.

1. إعداد المخزون العمل أبتمر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع إرشادات الشركة المصنعة وحل النوكليوتيد (5 Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3، سلسلة من مرجع 18) في الماء لتصل إلى تركيز النهائي 100 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل أبتمر العمل التي تمييع الأسهم النوكليوتيد إلى 200 نيوتن متر مع العازلة ملزمة (20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.6، 300 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي MgCl 2، 0.01٪ Tween20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط لمدة 2 دقيقة عند 90 درجة مئوية، والسماح للعينة يبرد على الفور إلى أسفل على الجليد، واستخدام العينة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 2. إعداد والتخفيف سلسلة يجند <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل يجند (أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP)، أحادي فسفات الأدينوزين (AMP)، الأدينين، غوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP)، السيتوزين ثلاثي الفوسفات (CTP)، deoxyadenosine ثلاثي الفوسفات (dATP)، وميثيونين S-adenosyl (SAM) و 10 ملي الأسهم لكل منهما)، إعداد diluti مسلسل 16 خطوةعلى في 200 ميكرولتر أنابيب رد فعل الصغيرة. ملاحظة: الطرد المركزي من أسهم يجند لمدة 5 دقائق في 14000 x ج قد تساعد على إزالة الركام. ، ينصح انخفاض حجم منخفضة أنابيب رد فعل ملزم لتجنب امتصاص الجزيئات على الجدران أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء بأقصى تركيز لا يقل عن 50 مرات أعلى من النسب المقدرة والحد من تركيز يجند بنسبة 50٪ في كل خطوة التخفيف. ملاحظة: أداة تركيز مكتشف في تنفيذ البرامج السيطرة تحاكي ربط البيانات وتساعد في العثور على الحق في مجموعة تركيز لسلسلة التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء 20 ميكرولتر من الأسهم يجند (10 ملم) في أنبوب 1. إضافة 10 ميكرولتر من أبتمر العازلة ملزمة في أنابيب رد فعل الصغرى 2-16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 10 ميكرولتر من أنبوب 1 إلى 2 أنبوب وتخلط بشكل صحيح من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب التالي وكرر هذا التخفيف لأنابيب المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الزيادة 10 ميكرولتر من الأنبوب الماضي. تجنب أي بuffer آثار التخفيف. يجب أن يكون المخزن المؤقت في أنبوب 1 وفي أنابيب 2-16 متطابقة. </li></ol> 3. إعداد مزيج رد الفعل النهائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ردود الفعل ملزمة الفردية مع حجم 20 ميكرولتر (10 ميكرولتر من أبتمر العمل الحل + 10 ميكرولتر من التخفيف يجند المعنية) للحد من الأخطاء pipetting ل. وبلغ حجم التداول ميكرولتر 4 فقط هو صوف فاي cient إلى الفرنسيسكان ليرة لبنانية الشعرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من محلول العمل 200 نانومتر أبتمر إلى 10 ميكرولتر من كل تخفيف يجند وتخلط بشكل صحيح من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه العينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وفاي ليرة لبنانية العينات في الشعيرات الدموية القياسية عن طريق غمس الشعيرات الدموية في العينة. قد تكون أوقات أطول الحضانة اللازمة لبعض التفاعلات. ومع ذلك، 5 دقائق كافية بالنسبة لمعظم. المس الشعيرات الدموية فقط على الجانبين، وليس على الجزء الأوسط، حيث سيتم اتخاذ القياس البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشعيرات الدموية على عشرالبريد علبة الشعرية وبدء تشغيل الجهاز MST. </li></ol> 4. بدء تشغيل جهاز MST ملاحظة: يوفر جهاز اثنين من حزم البرامج المثبتة مسبقا، و &#39;&#39; السيطرة &quot;برنامج لإعداد فني من الظروف التجريبية و &#39;&#39; تحليل&quot; برنامج لتفسير البيانات المنتجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل وضع علبة الشعرية في الجهاز MST، بدء برنامج حاسوبي لمراقبة وضبط درجة الحرارة المطلوبة الشاملة عن طريق اختيار &#39;&#39; تمكين اليدوية التحكم في درجة الحرارة &quot;في&quot; &quot;التحكم في درجة الحرارة&quot; القائمة المنسدلة. ضبط درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية في هذا الطريق. ملاحظة: وثائق MST يمكن أن يكون 22-45 درجة مئوية التحكم في درجة حرارته. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار لدرجة الحرارة للوصول إلى المستوى المتوقع ومن ثم وضع علبة الشعرية في الجهاز MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين القناة أدى إلى &#39;&#39; أحمر &quot;لالأصباغ Cy5 وضبط الصمام السلطة لكسب فلوريدا uorescencإشارة (ه) من 300 إلى 1000 وحدة مضان في الجهاز MST مع جهاز استشعار قياسية. يستخدم 25٪ من الطاقة الصمام في هذه الدراسة. ملاحظة: ينصح 6000 إلى 18،000 وحدة مضان لMST مع جهاز استشعار عالية الحساسية. </li></ol> 5. شعري المسح الضوئي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء مسح الشعرية للتحقق جوانب نوعية مختلفة من العينة عن طريق اختيار موقف شعري على برنامج &quot;السيطرة&quot; والنقر على &quot;بدء المسح الضوئي كاب&quot; قبل البدء في قياس MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد مسح شعري لمضان تعزيز / تبريد والآثار العالقة (قمم على شكل حرف U أو بالارض) في البرنامج. ملاحظة: مزيد من التفاصيل حول الكشف والتعامل مع مضان والآثار العالقة يمكن العثور عليها في المناقشة. </li></ol> 6. قياس MST ملاحظة: قبل البدء في قياس MST، للتأكد من استبعاد التمسك الآثار، وتعزيز / التبريد الآثار، أوأخطاء pipetting ل، والتأكد من أن مسح شعري يشير إلى أن إشارة فلوريدا uorescence هي SUF فاي cient. لمزيد من التفاصيل، انظر المناقشة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين تركيزات يجند من سلسلة تخفيف لموقف الشعرية المعنية في مراقبة البرامج &quot;&quot; النظر في خطوة التخفيف من خلط أبتمر ويجند. (1: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل أعلى تركيز من يجند (5 ملم) لالشعرية # 1، حدد نوع تخفيف الصحيح (هنا، 1: 1)، انقر على التركيز الأقصى، واستخدام وظيفة السحب لتعيين تركيزات المتبقية في الشعيرات الدموية # 2- تلقائيا 16. أقل تركيز هو 152.6 نيوتن متر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل تركيز أبتمر uorescent فلوريدا (هنا، و 100 نيوتن متر) في القسم الخاص بكل من برامج التحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإعدادات الافتراضية، التي كشف عن uorescence فلوريدا لمدة 5 ثانية، تسجيل MST لمدة 30 ثانية، وتسجيل مضان ل 5 ثانية مزيد من بعد تثبيط ر الليزر<html> س مراقبة انتشار الخلفي من الجزيئات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط قوة الليزر إلى 20٪ في قسم منها من برنامج التحكم. ملاحظة: من أجل الحصول على أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء ولتجنب الآثار غير محددة، فمن المستحسن قوة الليزر من 20-40٪. في حالات معينة، قد تكون هناك حاجة إلى قوة الليزر أعلى للحصول على فصل جيد من الجزيئات غير منضم وملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ التجربة بعد اختيار مجلد الوجهة والبدء في قياس MST عن طريق الضغط على زر &#39;&#39; قياس بدء MST &quot;. ملاحظة: سيتم إنشاء الملف .ntp في مجلد الوجهة. باستخدام هذا الإعداد، وقياس واحد يستمر 10-15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء التجريبي على الأقل مرتين لتحديد أكثر دقة للقيمة EC 50. ملاحظة: من أجل اختبار استنساخ التقني، ونفس الشعيرات الدموية يمكن فحصها عدة مرات (تكرار التقنية). </li></ol> 7. تحليل البيانات MST الإقليم الشمالي &quot;&gt; ملاحظة: برامج التحليل يمكن تحليل البيانات على فلوريدا ذ خلال قياس وتحليل البرامج المؤامرات آثار الساعة MST والتغيرات في تطبيع فلوريدا uorescence (F القاعدة) في مقابل تركيز يجند 37. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل برامج التحليل MST (تحليل MO.Affinity) وتحميل الملف .ntp من المجلد الوجهة. حدد &quot;MST&quot; كنوع التحليل في قائمة اختيار البيانات. ملاحظة: في حالة الآثار مضان تعتمد على يجند، مضان الأولي ويمكن اختيار لتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة على المدى التقنية والبيولوجية منها (ق) لتحليل جديد عن طريق السحب والإفلات أو عن طريق الضغط على زر &quot;+&quot; أدناه على المدى التجريبية منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر المعلومات الواردة أدناه على المدى التجريبية منها الحصول على معلومات عن خصائص التجربة، آثار MST، مسح شعري، شكل شعري، مضان الأولي، ومعدل التبييض. ملاحظة: هذه البيانات الخام يمكن آللذلك يتعين تفتيشها في خطوات لاحقة من التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد البصر آثار MST لتجميع وترسيب الآثار وظاهرة للعيان كما المطبات والمسامير. ملاحظة: للحصول على مزيد من المعلومات حول الكشف والتعامل مع آثار التجميع، قراءة المناقشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد البصر الفحص الشعرية والشعرية شكل غطاء لآثار الامتصاص وظاهرة للعيان كما قمم بالارض أو على شكل حرف U. تفقد البصر الفحص الشعرية ومضان الأولي للآثار مضان. تفقد البصر معدل تبيض ل photobleaching الآثار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى وضع الجرعة والاستجابة وتغيير إعداد تحليل لوضع &quot;الخبير&quot; عن طريق الضغط على زر منها. حدد &quot;تي السريع&quot; كما استراتيجية التقييم MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;هيل&quot; نموذجا للtting منحنى فاي. سيتم تلقائيا تحسب المعلمات ملزم. تطبيع البيانات عن طريق اختيار نوع منها التطبيع في القائمة &quot;مقارنة النتائج&quot;. تصديرالبيانات إما .xls أو قوات الدفاع الشعبي. ملاحظة: يلخص الجدول أدناه الرسم البياني ملزم المعلمات ملزمة حساب. </li></ol>

م، وTS هم موظفون من 2bind محدودة، والتي توفر الخدمات التحليلية الفيزيائية الحيوية. يتم دفع رسوم النشر لهذا الفيديو المادة تكفلها 2bind GmbH المزيد.

مراقبة الجودة: غير محددة الشائكة / امتصاص مادة العينة على الأسطح، وكذلك آثار التجميع، يكون لها تأثير كبير على نوعية البيانات تقارب. ومع ذلك، سوى عدد قليل من التقنيات للدولة من بين الفن وتوفر خيارات دقيقة وسريعة لرصد وتجنب هذه الآثا...

التفاعل بين الجزيئات هو أساس الطبيعة. ومن هنا، والعلماء في العديد من مجالات البحوث الأساسية والتطبيقية محاولة لفهم المبادئ الأساسية للتفاعلات الجزيئية من أنواع مختلفة. الميكروسكيل Thermophoresis (MST) تمكن العلماء من أداء ودقيقة، وتوصيف سريع، ومراقبة الجودة فعالة من حيث التكلفة من التفاعلات الجزيئية في الحل، مع حرية اختيار المخازن. وهناك بالفعل أكثر من 1000 المنشورات باستخدام MST، اعتبارا من عام 2016 وحده، واصفا أنواع مختلفة من التحليلات، بما في ذلك عروض مكتبة، ملزمة التصديقات الحدث، فحوصات المنافسة، والتجارب مع شركاء ملزم متعددة 1-8. بشكل عام، يسمح MST دراسة المعلمات ملزمة الكلاسيكية، مثل تقارب ملزمة (بعد الظهر لملم)، رياضيات الكيمياء، والديناميكا الحرارية، من أي نوع من التفاعل الجزيئي. وهناك ميزة كبيرة من MST هي القدرة على دراسة الأحداث ملزمة مستقلة عن حجم شركاء التفاعل. حتى شالالتفاعلات lenging بين الأبتامرات الحمض النووي صغيرة (15-30 الإقليم الشمالي) وأهداف مثل الجزيئات الصغيرة، والمخدرات، والمضادات الحيوية، أو الأيض ويمكن قياس. التكنولوجيات الحالية للدولة من بين الفن لتوصيف التفاعلات أبتمر المستهدفة هي إما مختبر مكثفة ومعقدة للغاية أو تفشل في تحديد-أبتمر صغيرة جزيء التفاعلات 9،10. السطح بلازمون الرنين (SPR) المستندة إلى فحوصات 11،12 والنهج المسعرية حقا خالية من التسمية، مثل متساوي الكالوري المعايرة (ITC) 13-15، شطف isocratic 16، التوازن فاي ltration 17،18، في خط التحقيق 19، gel- تحول المقايسات، stopped- آه فلوريدا فلوريدا uorescence الطيفي 20،21، مضان تباين (FA) 22،23، واحد جزيء فلوريدا uorescence التصوير 24،25، والحيوية طبقة التداخل (BLI) 26 هي أيضا إما غير دقيق أو غير متوافق مع جزيء صغير أبتمر التفاعلات. principa الآخرينقضايا لتر من هذه الأساليب هي حساسية منخفضة، وارتفاع استهلاك عينة، الشلل، والقيود النقل الجماعي على الأسطح، و / أو قيود العازلة. فقط عدد قليل من هذه التقنيات توفر ضوابط متكاملة لتجميع وامتصاص الآثار. يمثل MST أداة قوية للعلماء للتغلب على هذا القيد لدراسة التفاعلات بين الأبتامرات والجزيئات الصغيرة 27-29، فضلا عن أهداف أخرى مثل البروتينات 30-33. وتعتمد هذه التقنية على حركة الجزيئات من خلال تدرجات درجة الحرارة. هذه الحركة موجهة، ودعا &quot;thermophoresis،&quot; تعتمد على حجم وتوجيه التهم وقذيفة الماء من جزيء 34،35. الربط ليجند للجزيء ستغير مباشرة واحدة على الأقل من هذه المعايير، مما أدى إلى التنقل thermophoretic تغييرها. بروابط مع أحجام صغيرة قد لا يكون لها تأثير كبير من حيث حجم التغيير من غير منضم إلى دولة منضمة، ولكنها يمكن أن يكون الدكتور<html> آثار amatic على قذيفة الماء و / أو تهمة. التغييرات في حركة thermophoretic من جزيئات بعد التفاعل مع الشريك ملزم تمكن الكمي من المعلمات ملزمة الأساسية 2،7،34،36،37. كما هو مبين في الشكل 1A، ويتكون الجهاز MST ليزر الأشعة تحت الحمراء التي تركز على العينة داخل الشعيرات الدموية الزجاج باستخدام نفس البصريات، وللكشف عن مضان. يمكن رصد حركة thermophoretic من البروتينات عن طريق uorescence فلوريدا لا يتجزأ من tryptophans 6 أو تفاعل شريك 3،8 fluorescently المسمى في حين أن الليزر يؤسس التدرج في درجة الحرارة (ΔT من 2-6 درجة مئوية). الفرق في درجة الحرارة مما أدى إلى الفضاء، ΔT، يؤدي إلى نضوب أو تراكم الجزيئات في مجال درجات الحرارة المرتفعة، والتي يمكن قياسها كميا بواسطة سوريه coef فاي cient (S T): ز &quot;/&gt; ج يمثل الساخنة التركيز في منطقة ساخنة، وج البرد هو تركيز في المنطقة الباردة الأولية. كما هو مبين في الشكل 1B، نموذجية MST نتائج التجربة في ملف تعريف حركة MST (الوقت أثر)، ويتألف من المراحل المختلفة، والتي يمكن أن تكون مفصولة الجداول الزمنية الخاصة بكل منها. يتم قياس مضان الأولي في أول 5 ثوان في غياب التدرج في درجة الحرارة لتحديد مضان بدءا دقيقة وللتحقق ل photobleaching أو photoenhancement. الوثب درجة الحرارة (T-السريع) يمثل المرحلة التي التغييرات مضان قبل حركة thermophoretic. هذا الانخفاض الأولي في مضان يعتمد على التغييرات التي تعتمد على الحرارة من فلوريدا uorophore العائد الكم. يتبع مرحلة thermophoresis، التي ينخفض ​​مضان (أو زيادة) نتيجة لحركة thermophoretic من الجزيئات حتى توزيع ثابتة للدولة يتم التوصل.ويمكن ملاحظة أن TJump العكس ونشر الظهر يصاحب ذلك من الجزيئات uorescent فلوريدا كما هو مبين في الشكل 1B بعد يتم فيها تشغيل الليزر قبالة. من أجل الوصول إلى معايير ملزمة الأساسية، ويتم تحليل نسب المولي مختلفة من شركاء التفاعل ومقارنة. عادة، يتم دراسة 16 نسب مختلفة في تجربة MST واحد، في حين يتم الاحتفاظ جزيء مرئية بصري مستمر ويتم توفيره مع كمية متزايدة من يجند الخالي من الملصقات. التفاعل بين الشركاء ملزم اثنين يؤدي الى تغييرات في thermophoresis، وبالتالي في uorescence فلوريدا تطبيع، F القاعدة، والذي يحسب على النحو التالي: <img alt="معادلة" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F الساخنة والباردة F تمثل متوسط كثافة uorescence فلوريدا في دي فاي نقطة زمنية نيد من آثار MST. الانتماءات الملزمة (ك د أو EC 50 القيم) ويمكن حساب من المنحنياتالبريد المناسب (الشكل 1C). وعموما، MST هو أداة قوية لدراسة التفاعلات الجزيئية من أي نوع. تقدم هذه المخطوطة بروتوكول لوصف التفاعل تحديا بين ثلاثي صغيرة جزيء الفوسفات (ATP؛ 0.5 كيلو دالتون) و25 الإقليم الشمالي القصير ssDNA أبتمر DH25.42 (7.9 كيلو دالتون). على مدى المخطوطة، يتم تعيين موقع ملزم للأبتمر على جزيء ATP وصولا الى مجموعة الأدينين من لاعبي التنس المحترفين.

<table><tbody><tr><td>Aptamer binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 0.01% Tween-20</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled ATP aptamer</td><td>IDT, Leuven, Belgium</td><td></td><td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-&lt;br/&gt;ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>G8877</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Monolith NT.115&amp;nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-G008</td><td>Blue/Red Channel&lt;br/&gt; MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 capillaries Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tubes</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

في هذه الدراسة، تم تطبيق MST لتميز موقع ملزم للأبتمر DH25.42 الحمض النووي 18 على ATP. وعلى النقيض من الدراسات الأخرى التي تميز تفاعل ATP أو ATP-محاكاة جزيئات صغيرة مع البروتينات وصفت بشكل عشوائي مع واحد أو أكثر من fluorophores 38-40، وتشمل هذه الدراسة نسخة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis at JoVE.com

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على ATP عن طريق الميكروسكيل Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

mapping-binding-site-an-aptamer-on-atp-using-microscale

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K Views.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Video: Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

اختيار ابتمر الحمض النووي ملزم إستر حامض فثاليك وتوصيف وتطبيق أبتاسينسور الكهروكيميائية

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Chemistry

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

مقايسة ربط بروتين سطح الخلية القائمة على قياس التدفق الخلوي لتقييم انتقائية وخصوصية أبتامير مضاد للسرطان

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Cancer Research

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified through an in vitro selection process called Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) to recognize a wide variety of targets, from small molecules to proteins and other macromolecules 2-4. Aptamers have properties that are well suited for in vivo diagnostic and/or therapeutic applications: Besides good specificity and affinity, they are easily synthesized, survive more rigorous processing conditions, they are poorly immunogenic, and their relatively small size can result in facile penetration of tissues.
Aptamers that are identified through the standard SELEX process usually comprise ~80 nucleotides (nt), since they are typically selected from nucleic acid libraries with ~40 nt long randomized regions plus fixed primer sites of ~20 nt on each side. The fixed primer sequences thus can comprise nearly ~50% of the library sequences, and therefore may positively or negatively compromise identification of aptamers in the selection process 3, although bioinformatics approaches suggest that the fixed sequences do not contribute significantly to aptamer structure after selection 5. To address these potential problems, primer sequences have been blocked by complementary oligonucleotides or switched to different sequences midway during the rounds of SELEX 6, or they have been trimmed to 6-9 nt 7, 8. Wen and Gray 9 designed a primer-free genomic SELEX method, in which the primer sequences were completely removed from the library before selection and were then regenerated to allow amplification of the selected genomic fragments. However, to employ the technique, a unique genomic library has to be constructed, which possesses limited diversity, and regeneration after rounds of selection relies on a linear reamplification step. Alternatively, efforts to circumvent problems caused by fixed primer sequences using high efficiency partitioning are met with problems regarding PCR amplification 10.
We have developed a primer-free (PF) selection method that significantly simplifies SELEX procedures and effectively eliminates primer-interference problems 11, 12. The protocols work in a straightforward manner. The central random region of the library is purified without extraneous flanking sequences and is bound to a suitable target (for example to a purified protein or complex mixtures such as cell lines). Then the bound sequences are obtained, reunited with flanking sequences, and re-amplified to generate selected sub-libraries. As an example, here we selected aptamers to S100B, a protein marker for melanoma. Binding assays showed Kd s in the 10-7 - 10-8 M range after a few rounds of selection, and we demonstrate that the aptamers function effectively in a sandwich binding format.

SELEX protocols comprise multiple rounds of selection, each of which require regeneration of bound ligands, which in turn require fixed primer sequences flanking the random library regions. These fixed primer sequences can interfere with the selection process (false positives and negatives). Here we present a primer-free protocol.

خالية من التحديد التمهيدي Aptamer باستخدام مكتبة DNA عشوائية

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Biology

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

تحديد الارتباط الديناميكي الحراري والحركي لأبتامر الحمض النووي والتتراسيكلين باستخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Aptamer-Based Target Detection Facilitated by a 3-Stage G-Quadruplex Isothermal Exponential Amplification Reaction

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules with signal-generation capability. For the system described herein, target recognition through an aptameric domain, Stem II of a modified hammerhead ribozyme, activates the self-cleaving ribozyme by stabilizing the initially unstructured construct. The cis-cleaving RNA acts at the junction of Stem III and Stem I, creating two cleavage products. The longer cleavage product primes an isothermal exponential amplification reaction (EXPAR) of the two similar catalytically active G-quadruplexes. Those resulting amplification products catalyze peroxidase reduction, which is coupled to the reduction of a colorimetric substrate with an output that the naked eye can detect. The 3-part system described in the present study improves detection modalities such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) by producing a visually detectable signal for indicating the presence of as low as 0.5 &#181;M theophylline in as little as 15 min.

The present protocol demonstrates the use of a fast, 3-stage, aptamer-based exponential amplification assay to detect targets. Sample preparation, signal amplification, and color development are covered to implement this system to recognize the presence of theophylline over that of caffeine.

يتم تسهيل الكشف عن الهدف القائم على Aptamer بواسطة تفاعل تضخيم أسي متساوي الحرارة G-quadruplex من 3 مراحل

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules ...

Bioengineering

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

منهج في اختيار الأبتامرات تبديل الهيكل تطبيقها على اللونية الذهب جسيمات متناهية الصغر الفحص

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

Source: Mittermaier, A. K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55959">Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates differential scanning calorimetry &#8212; a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

كالوريمتر المسح التفاضلي لدراسة تفاعل الترابط الحراري للحمض النووي

Source: Mittermaier, A. K., et al. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. ...