Yazarlar hiçbir onayları var.

Aptamer Çalışma Stok 1. Hazırlık <ol><li> Üreticinin talimatlarını takip ve 100 uM nihai konsantrasyon ulaşan su (18 referans 5-Cy5 CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sıra) oligonükleotidi çözülür. </li><li> Bağlama tamponu ile 200 nM oligonükleotid stokları seyreltilerek aptamer çalışma çözeltisi hazırlayın (20 mM Tris, pH 7.6, 300 mM NaCI, 5 mM MgCl2,% 0.01 Tween 20). </li><li> 90 ° C&#39;de 2 dakika süreyle inkübe karışımı Numune hemen buz üzerinde soğuması ve oda sıcaklığında örneğini kullanır. </li></ol> Ligand seyreltme serisi 2. hazırlanması <ol><li> ) SAM (her ligandın (adenozin trifosfat (ATP), adenosin difosfat (ADP), adenosin monofosfat (AMP), adenin, guanosin trifosfat (GTP), sitosin trifosfat (CTP) deoksiadenosin trifosfat (dATP), ve S-adenosil metiyonin ; 10 mM stok her), bir 16 adım seri diluti hazırlamaküzerinde 200 ul mikro reaksiyon tüpleri. NOT: agrega kaldırmak için yardımcı olabilir 14.000 xg&#39;de 5 dakika boyunca ligand stoklarının Santrifüj. Düşük hacimli, düşük bağlanma reaksiyon tüpleri tüp duvarları moleküllerin adsorpsiyonu önlemek için tavsiye edilir. </li><li> Tahmini yakınlığından daha yüksek, en az 50 kez maksimum konsantrasyonu ile başlar ve her seyreltme basamağında% 50 lıgand konsantrasyonunu azaltır. NOT: Kontrol yazılım uygulanan konsantrasyon bulma aracı bağlama verileri taklit ve seyreltme serileri için doğru konsantrasyon aralığı bulma yardımcı olur. </li><li> 16 mikro tepkime tüpleri içine 2 aptamer bağlanma tamponu 10 ul ekle borunun 1 ligand stok (10 mM) 20 ul doldurun. </li><li> Transferi 10 tüp 2 tüp 1 ul ve yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı düzgün karıştırın. Bir sonraki tüp 10 uL aktarın ve kalan tüpler için bu seyreltme tekrarlayın. </li><li> Son tüpten 10 ul fazlalığı atın. Herhangi b önlemekUffer dilüsyon etkisi. tüp 1 ve tüpler 2-16 tampon aynı olmalıdır. </li></ol> Nihai reaksiyon karışımı 3. hazırlanması <ol><li> Pipetleme hatalarını en aza indirmek için, bireysel bağlama 20 | il hacminde reaksiyonları (aptamer hazır çözelti + ilgili ligand seyreltme 10 ul, 10 ul) hazırlayın. Sadece 4 ul bir hacim kılcal ll fi oluşturulmasına yeterli olduğunu. </li><li> Her bir bağ seyreltme 10 ul 200 nM aptamer çalışma çözeltisinin 10 ul ilave edin ve pipetleme ve birkaç kez aşağı doğru karıştırılır. </li><li> numune içine kılcal damarların batırarak standart kılcal damarların içine numunelerin ll oda sıcaklığında ve fi 5 dakika boyunca örnekleri inkübe. Daha uzun inkübasyon süreleri, bazı etkileşimler için gerekli olabilir; Bununla birlikte, 5 dakika için en uygundur. DEĞİL optik ölçüm alınacak orta kısmında, üzerinde, sadece tarafta kılcal dokunun. </li><li> th üzerine kılcal yerleştirine kılcal tepsisi ve MST cihazı başlatmak. </li></ol> 4. MST Cihazı Başlangıç NOT: Cihaz iki önceden yüklenmiş yazılım paketlerini, üretilen verilerin yorumlanması için yazılımın &#39; &quot;&#39; analiz kontrolü deneysel koşullar ve teknik kurulumu için yazılım &#39;&quot; sağlar. <ol><li> MST cihazın içine kılcal tepsisini yerleştirmeden önce, kontrol yazılımını başlatmak ve &#39;açılır menüden&#39; &quot; &#39;sıcaklık kontrolü de&quot; el sıcaklık kontrolü sağlamak&#39; seçerek genel istenilen sıcaklığa ayarlayın. Bu şekilde, 25 ° C&#39;ye kadar sıcaklık ayarlayın. Not: MST araçlar ısı kontrollü, 45 ° C 22 arasında olabilir. </li><li> Beklenen seviyeye ulaşmak için sıcaklık bekleyin ve ardından MST cihazın içine kılcal tepsiye yerleştirin. </li><li> Cy5 boyalar için &quot;kırmızı &#39;LED kanalı ayarlamak ve bir fl uorescenc kazanmak için LED güç ayarlamakStandart sensör MST cihaz 300 ila 1000 floresans birimleri e sinyali. % 25 LED güç bu çalışmada kullanılmıştır. NOT: 6,000 18,000 floresan üniteleri yüksek hassasiyetli sensörü ile MST için tavsiye edilir. </li></ol> 5. Kılcal Tarama <ol><li> &quot;Kontrol&quot; yazılım üzerinde kılcal konumunu seçme ve tıklayarak numunenin farklı kalite yönlerini kontrol etmek için bir kılcal taraması yürütmek &quot;kap tarama başlatmak&quot; MST ölçümü başlamadan önce. </li><li> floresan geliştirme / söndürme ve yazılım sokma etkileri (zirveleri U-şeklinde veya düzleştirilmiş) için kılcal taraması kontrol edin. Not: algılama ve floresan işlenmesi ve yapışma etkileri hakkında daha fazla ayrıntı tartışma bulunabilir. </li></ol> 6. MST Ölçümü NOT: MST ölçümü başlamadan önce, dışlamak emin olun yapışmasını etkileri, geliştirme / söndürme etkisi, ya dapipetleme hataları ve kılcal tarama fl uorescence sinyali oluşturulmasına yeterli olduğunu gösterir emin olun. Daha fazla bilgi için, tartışma bakın. <ol><li> . &#39;&#39; Kontrolü &quot;yazılım ilgili kılcal konumuna sulandırma dizileri &#39;nden ligand konsantrasyonları atama aptamer liganda karıştırma seyreltme adım olarak (1: 1). </li><li> Kılcal # 1 için ligand yüksek konsantrasyon (5 mM) doğru olarak girin seyreltme türünü seçin (burada, 1: 1), maksimum konsantrasyon tıklayın ve otomatik kılcal kalan konsantrasyonlarını # 2- atamak için sürükle işlevini kullanın 16. düşük konsantrasyon 152.6 nM&#39;dir. </li><li> kontrol yazılımı ilgili bölümündeki fl uorescent aptamer (burada, 100 nM) konsantrasyonunu girin. </li><li> 5 sn fl uorescence tespit varsayılan ayarları kullanın 30 sn MST kayıt ve lazer t inaktivasyonu sonra başka bir 5 saniye floresan kayıt<html> o moleküllerin geri emilimini izlemek. </li><li> kontrol yazılımı ilgili bölümündeki% 20 lazer gücünü ayarlayın. NOT: sipariş en iyi sinyal-gürültü oranını almak ve belirsiz etkileri önlemek için ise,% 20-40 bir lazer güç tavsiye edilir. Belirli durumlarda, daha yüksek bir lazer gücü bağlanmamış ve bağlanmış moleküller, iyi bir ayırma için gerekli olabilir. </li><li> Hedef klasörü seçtikten sonra deney kaydedin ve &#39;Başlat MST ölçümü &quot;düğmesine basarak MST ölçümü başlatmak. NOT: .ntp dosyası hedef klasörde oluşturulur. Bu kurulumu kullanarak, bir ölçüm 10-15 dakika sürer. </li><li> EC50 değeri daha doğru bir şekilde belirlenmesi için en az iki kez deney prosedürü tekrarlayın. Not: Teknik tekrarlanabilirliğini test etmek amacıyla, aynı kılcal taranabilir birkaç kez (Teknik tekrarlar). </li></ol> 7. MST Veri Analizi nt &quot;&gt; Not: analiz yazılımı ölçüm sırasında fl y ilişkin verilerin analizini sağlayan analiz yazılımı ligand konsantrasyonu 37 karşı MST zaman izleri ve normalize fl uorescence (F norm) değişiklikleri çizer.. <ol><li> MST analiz yazılımı (MO.Affinity Analizi) başlatın ve hedef klasörden .ntp dosyasını yüklemek. veri seçme menüsünde analiz türü olarak &quot;MST&quot; i seçin. Not: liganda bağımlı floresans etkileri durumunda, başlangıç ​​floresans analizi için seçilebilir. </li><li> sürükle-bırak yöntemiyle veya ilgili deneysel çalışma altındaki &quot;+&quot; düğmesine basarak yeni bir analize ilgili teknik veya biyolojik run (ler) ekleyin. </li><li> Deneyin, MST izleri, kılcal tarama, kılcal şekli, ilk floresan ve ağartma oranı özellikleri hakkında bilgi edinmek için ilgili deneysel çalışma Aşağıdaki bilgiler düğmesine basın. NOT: Bu ham veriler can albu yüzden analizin daha sonraki adımlarda kontrol edilmelidir. </li><li> Görme görünür darbelere ve ani olarak toplama ve yağış etkilerinden MST izleri, kontrol edin. NOT: algılama ve toplama etkilerinin aktarılması konusunda daha fazla bilgi için, tartışma okudum. </li><li> Görme düzleştirilmiş ya da U-şekilli zirveleri olarak görünür kılcal tarama ve adsorpsiyon etkileri kılcal şekil bindirme, kontrol edin. Görme kılcal tarama ve floresan efektleri için ilk floresan inceleyin. Görme etkileri photobleaching için ağartma oranını kontrol edin. </li><li> doz-yanıt moduna geçin ve ilgili düğmeye basarak kadar &quot;uzman&quot; mod analizi ayarını değiştirin. MST değerlendirme stratejisi olarak &quot;T-Jump&quot; seçeneğini seçin. </li><li> eğri fi tting için &quot;Tepe&quot; modelini seçin. bağlayıcı parametreleri otomatik olarak hesaplanacaktır. &quot;Sonuçları karşılaştırmak&quot; menüsünden normalleşme ilgili türünü seçerek veri normalleştirmek. ihracatBir .xls veya .pdf gibi ya veri. NOT: bağlayıcı grafiğin Aşağıdaki tabloda hesaplanan bağlanma parametreleri özetlemektedir. </li></ol>

CE ve TS biyofiziksel analitik hizmet vermektedir 2bind GmbH çalışanlarıdır. Bu video-makale için yayın ücreti 2bind GmbH tarafından karşılanır.

Kalite kontrolleri: Spesifik olmayan yapışma / yüzeylere örnek malzeme, hem de çekiş etkileri adsorpsiyon, afinite verinin kalitesi üzerinde önemli bir etkisi vardır. Ancak, sadece bir kaç state-of-the-art teknolojileri izlemek ve bu etkilerden kaçınmak için doğru ve hızlı seçenekler sunuyoruz. MST algılar ve teknik kurulum adım adım optimizasyonu sağlayan, bu sorunların üstesinden gelmek için yardımcı entegre kalite kontrolleri sunmaktadır. toplama / yağış etkiler...

moleküller arasındaki etkileşim doğasının temelidir. Bu nedenle, temel ve uygulamalı araştırma birçok alanda bilim farklı moleküler etkileşimlerin temel ilkelerini anlamaya çalışın. Mikro Termoforesis (MST) tamponların bir özgür seçim ile, çözelti içinde moleküler etkileşimlerin hızlı, hassas, düşük maliyetli ve kalite kontrollü karakterizasyonu gerçekleştirmek için bilim adamları sağlar. Birden fazla bağlanma ortakları 1-8 ile olay doğrulamaları, rekabet deneyleri ve deneyleri bağlayıcı, kütüphane taramaları da dahil olmak üzere analizler farklı türde anlatan, yalnız 2016 den, MST kullanarak 1000&#39;den fazla yayın zaten vardır. Genel olarak, MST, moleküler etkileşimin herhangi bir bağlanma afinitesi (mM&#39;ye pM), stokiyometri ve termodinamik, klasik bağlanma parametreleri, çalışmasına izin verir. MST büyük bir avantajı etkileşimi mümkün boyutundan bağımsız bağlayıcı olayları incelemek için yeteneğidir. hatta çal&#39;ıBu küçük moleküller, ilaçlar, antibiyotikler, veya metabolitler olarak zorlu bir yöntem, küçük nükleik asit aptamerler arasındaki etkileşimler (nt 15-30) ve hedefler belirlenebilir. Güncel state-of-the-art teknolojileri aptamer hedef etkileşimleri laboratuvar yoğun ve son derece karmaşık ya vardır karakterize ya da aptamer-küçük molekül 9,10 etkileşimleri ölçmek için başarısız. Plasmon Rezonans (SPR) deneyleri 11,12 ve İzotermal Titrasyon Kalorimetre (ITC) 13-15, izokratik elüsyon 16, denge fi ltration 17,18 olarak gerçekten etiket içermeyen Kalorimetre yaklaşımları, tabanlı Surface, in-line 19 Jel- sondalama deneyleri vardiya, Durduğunuz akış fl uorescence spektroskopisi 20,21, floresan anizotropi (FA) 22,23, tek-molekül fl uorescence görüntüleme 24,25 ve Bio-katmanlı enterforemetre (BLI) 26 de aptamer-küçük molekül ile kesin olmayan veya uyumsuz ya vardır etkileşimleri. diğer principaBu yöntemlerin l sorunları düşük duyarlılık, yüksek numune tüketimi, hareketsizlik, yüzeylerde toplu taşıma sınırlamalar ve / veya tampon kısıtlamaları vardır. Bu teknolojilerin sadece birkaç toplama ve adsorpsiyon efektleri için entegre kontroller sağlar. MST bilim adamları bu tür proteinlerin 30-33 olarak aptamers ve küçük moleküllerin 27-29 arasındaki etkileşimleri, yanı sıra diğer hedefleri incelemek için bu sınırlamayı aşmak için için güçlü bir araç temsil eder. Teknoloji sıcaklık değişimleri ile moleküllerin hareketine dayanır. Olarak adlandırılan bu yönlendirilmiş hareket, &quot;Termoforosis,&quot; molekülün 34,35 büyüklüğüne, ücret ve hidrasyon kabuğu bağlıdır. moleküle bir ligand bağlanmasının doğrudan değiştirildi thermophoretic hareket ile sonuçlanan, aşağıdaki parametrelerden en azından birinin değiştirecektir. Küçük boyutları ile ligandlar bağlı duruma bağlanmamış gelen boyut değişim açısından önemli bir etkiye sahip olmayabilir, ama onlar dr olabilir<html> hidrasyon kabuğu ve / veya şarj amatic etkiler. Bağlama ortağı ile etkileşim sonrası moleküllerin thermophoretic hareketinde değişiklik temel bağlanma parametreleri 2,7,34,36,37 ölçülmesini sağlar. Şekil 1A &#39;de gösterildiği gibi, MST cihazı flüoresan tespiti için aynı optik kullanılarak cam kılcal olan numune üzerine odaklanmış bir kızıl ötesi lazer oluşur. Lazer sıcaklık gradyanı (2-6 ° C DT) kurarken tryptophans 6 ya da flüoresan bir etkileşim, ortak olarak 3,8 arasında içsel fl uorescence ile proteinlerin thermophoretic hareketi izlenebilir. Boşluk, DT, içinde sıcaklık farkı Soret ile belirlenebilir yüksek bir sıcaklıkta alanında azalması veya molekül birikmesine yol açar, Katsayı (St): g &quot;/&gt; C sıcak ısıtılmış bölgede konsantrasyonunu temsil eder, ve C, soğuk ilk olarak soğuk bölge konsantrasyonudur. Şekil 1B, ilgili zaman dilimlerinde ayrılabilir farklı aşamalarında oluşan MST hareket profilinin (zaman iz), tipik bir MST deney sonuçları gösterildiği gibi. başlangıç ​​floresans kesin bir başlangıç ​​floresans tanımlamak ve ışıkla ağartma ya photoenhancement kontrol etmek için sıcaklık gradyanı yokluğunda yer alan birinci 5 saniye cinsinden ölçülür. Sıcaklık Jump (T-Jump) hangi floresan değişiklikleri thermophoretic hareketinden önce safhasını oluşturuyor. floresanstaki bu ilk azalma kuantum verimi uorophore fl ısıya bağlı değişikliklere bağlıdır. Termoforosis aşaması nedeniyle sabit durum dağılım kadar molekül thermophoretic hareketine flüoresans azalır (veya artar) ulaşıldığında edildiği izler.Lazer kapatıldıktan sonra Şekil 1B gösterildiği gibi ters TJump ve BM uorescent moleküllerin beraberinde geri difüzyon gözlenebilir. Temel bağlanma parametreleri erişmek için, etkileşim ortakları farklı molar oranları incelenmiş ve karşılaştırılmıştır. Optik görebilir molekülü sabit tutulur ve etiketlenmemiş ligandın artan bir miktarı ile temin edilir ise tipik olarak, 16 farklı oranlar bir MST deneyde incelenmiştir. İki bağlanma ortakları arasındaki etkileşim Termoforosis değişiklikleri uyarır ve bu nedenle normalize fl uorescence olarak aşağıdaki şekilde hesaplanır F norm: <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F sıcak ve F soğuk MST izleri de fi ned zaman noktalarında fl uorescence yoğunlukları ortalama temsil eder. Bağlanma ilgileri (Kd ve EC50 değerleri) Curv hesaplanabilire uydurma (Şekil 1C). Genel olarak, MST her türlü moleküler etkileşimleri çalışmak için güçlü bir araçtır. ve 25-nt kısa ssDNA aptamer DH25.42 (7.9 kDa); Bu yazının küçük molekül adenozin trifosfat (0.5 kDa ATP) arasındaki zorlu etkileşimi karakterize bir protokol sunar. Yazının boyunca ATP molekülü üzerindeki aptamer bağlanma yeri ATP adenin grubuna aşağı eşleştirilir.

<table><tbody><tr><td>Aptamer binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 0.01% Tween-20</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled ATP aptamer</td><td>IDT, Leuven, Belgium</td><td></td><td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-&lt;br/&gt;ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>G8877</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Monolith NT.115&amp;nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-G008</td><td>Blue/Red Channel&lt;br/&gt; MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 capillaries Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tubes</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

Bu çalışmada, MST ATP DH25.42 DNA aptamer 18 bağlanma sitesi karakterize etmek için uygulanmıştır. ATP veya rasgele bir veya daha fazla fluorophores 38-40 ile etiketlenmiş proteinler ile küçük moleküller ATP&#39;ye taklit etkileşimlerini karakterize eden başka çalışmalardan farklı olarak, bu çalışma 5&#39;ucundaki bir Cy5 molekülü ile 7.9 kDa ssDNA aptamer etiketlenmiş bir versiyonunu içerir . Farklı ATP türevlerinin ve ilgili moleküller...

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis at JoVE.com

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

mapping-binding-site-an-aptamer-on-atp-using-microscale

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K Görüntüleme.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Video: Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

Maddedir asit Ester-bağlama DNA Aptamer seçimi, karakterizasyonu ve elektrokimyasal bir Aptasensor uygulamaya

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Kimya

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Biyokimya

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

Bir Antikanser Aptamerinin Seçiciliğini ve Özgüllüğünü Değerlendirmek için Akış Sitometrisine Dayalı Hücre Yüzeyi Protein Bağlama Testi

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Kanser Araştırmaları

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified through an in vitro selection process called Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) to recognize a wide variety of targets, from small molecules to proteins and other macromolecules 2-4. Aptamers have properties that are well suited for in vivo diagnostic and/or therapeutic applications: Besides good specificity and affinity, they are easily synthesized, survive more rigorous processing conditions, they are poorly immunogenic, and their relatively small size can result in facile penetration of tissues.
Aptamers that are identified through the standard SELEX process usually comprise ~80 nucleotides (nt), since they are typically selected from nucleic acid libraries with ~40 nt long randomized regions plus fixed primer sites of ~20 nt on each side. The fixed primer sequences thus can comprise nearly ~50% of the library sequences, and therefore may positively or negatively compromise identification of aptamers in the selection process 3, although bioinformatics approaches suggest that the fixed sequences do not contribute significantly to aptamer structure after selection 5. To address these potential problems, primer sequences have been blocked by complementary oligonucleotides or switched to different sequences midway during the rounds of SELEX 6, or they have been trimmed to 6-9 nt 7, 8. Wen and Gray 9 designed a primer-free genomic SELEX method, in which the primer sequences were completely removed from the library before selection and were then regenerated to allow amplification of the selected genomic fragments. However, to employ the technique, a unique genomic library has to be constructed, which possesses limited diversity, and regeneration after rounds of selection relies on a linear reamplification step. Alternatively, efforts to circumvent problems caused by fixed primer sequences using high efficiency partitioning are met with problems regarding PCR amplification 10.
We have developed a primer-free (PF) selection method that significantly simplifies SELEX procedures and effectively eliminates primer-interference problems 11, 12. The protocols work in a straightforward manner. The central random region of the library is purified without extraneous flanking sequences and is bound to a suitable target (for example to a purified protein or complex mixtures such as cell lines). Then the bound sequences are obtained, reunited with flanking sequences, and re-amplified to generate selected sub-libraries. As an example, here we selected aptamers to S100B, a protein marker for melanoma. Binding assays showed Kd s in the 10-7 - 10-8 M range after a few rounds of selection, and we demonstrate that the aptamers function effectively in a sandwich binding format.

SELEX protocols comprise multiple rounds of selection, each of which require regeneration of bound ligands, which in turn require fixed primer sequences flanking the random library regions. These fixed primer sequences can interfere with the selection process (false positives and negatives). Here we present a primer-free protocol.

Rastgele bir DNA Kütüphane Kullanımı Primer-Aptamer Seçimi

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Biyoloji

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi Kullanılarak DNA Aptamer ve Tetrasiklinin Termodinamik ve Kinetik İlişkisinin Belirlenmesi

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Aptamer-Based Target Detection Facilitated by a 3-Stage G-Quadruplex Isothermal Exponential Amplification Reaction

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules with signal-generation capability. For the system described herein, target recognition through an aptameric domain, Stem II of a modified hammerhead ribozyme, activates the self-cleaving ribozyme by stabilizing the initially unstructured construct. The cis-cleaving RNA acts at the junction of Stem III and Stem I, creating two cleavage products. The longer cleavage product primes an isothermal exponential amplification reaction (EXPAR) of the two similar catalytically active G-quadruplexes. Those resulting amplification products catalyze peroxidase reduction, which is coupled to the reduction of a colorimetric substrate with an output that the naked eye can detect. The 3-part system described in the present study improves detection modalities such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) by producing a visually detectable signal for indicating the presence of as low as 0.5 &#181;M theophylline in as little as 15 min.

The present protocol demonstrates the use of a fast, 3-stage, aptamer-based exponential amplification assay to detect targets. Sample preparation, signal amplification, and color development are covered to implement this system to recognize the presence of theophylline over that of caffeine.

Aptamer tabanlı hedef tespiti, 3 aşamalı G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu ile kolaylaştırılmıştır

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules ...

Biyomühendislik

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

Source: Mittermaier, A. K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55959">Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates differential scanning calorimetry &#8212; a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

DNA Aptamer-Terponabil Ligand Etkileşimini İncelemek için Diferansiyel Taramalı Kalorimetri

Source: Mittermaier, A. K., et al. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. ...