Os autores não têm confirmações.

1. Preparação de Trabalho Aptamer a Bolsa <ol><li> Seguir as instruções do fabricante e dissolve-se o oligonucleótido (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, a sequência de referência 18) em água, alcançando uma concentração final de 100 uM. </li><li> Preparar a solução de aptâmero de trabalho por diluição da oligonucleótido a 200 nm com tampão de ligação (Tris 20 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; MgCl2 5 mM; 0,01% Tween 20). </li><li> Incubar a mistura durante 2 min a 90 ° C, deixar a amostra arrefecer imediatamente para baixo sobre o gelo, e usar a amostra à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparação da série de diluição Ligand <ol><li> Para cada ligando (trifosfato de adenosina (ATP), difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de adenosina (AMP), adenina, guanosina trifosfato (GTP), trifosfato de citosina (CTP), desoxiadenosina-trifosfato (dATP), e s-adenosilmetionina (SAM) ; estoque 10 mM cada), preparar uma diluti série de 16 passosem em 200 ul tubos micro reação. NOTA: A centrifugação de ações ligando por 5 min a 14.000 xg pode ajudar a remover agregados. Baixo volume, tubos de reacção de ligação baixas são recomendadas para evitar a adsorção de moléculas com as paredes do tubo. </li><li> Comece com uma concentração máxima de, pelo menos, 50 vezes mais elevada do que a afinidade estimada e reduzir a concentração do ligando em 50% em cada passo de diluição. NOTA: A ferramenta concentração localizador implementado no software de controle simula dados de ligação e ajuda a encontrar o intervalo de concentração correta para a série de diluição. </li><li> Encher 20 ul de estoque o ligando (10 mM) no tubo 1. Adicionar 10 uL de tampão de ligação em tubos de reacção aptâmero micro 2-16. </li><li> Transferência de 10 ml de tubo 1 para o tubo 2 e misturar bem, pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transferir 10 mL para o próximo tubo e repetir esta diluição para os tubos restantes. </li><li> Descartar o excesso de 10 ul a partir do último tubo. Evitar qualquer befeitos de diluição pode ser prejudicado. O tampão no tubo 1 e em tubos de 2-16 deve ser idêntica. </li></ol> 3. Preparação da Mistura final Reacção <ol><li> Preparar as reacções de ligação individuais com um volume de 20 ul (10 ul de solução de trabalho do aptâmero + 10 ul de diluição do respectivo ligando) para minimizar erros de pipetagem. Um volume de apenas 4 l é su fi ciente para encher o capilar. </li><li> Adicionar 10 ul da solução de trabalho de 200 nM de aptâmero de 10 ul de cada diluição de ligando e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Incubar as amostras durante 5 minutos a temperatura ambiente e encher as amostras padrão em capilares por meio de imersão dos capilares para a amostra. tempos de incubação mais longos podem ser necessários para algumas interacções; no entanto, 5 minutos é adequado para a maioria. Toque os capilares apenas sobre os lados, não na parte do meio, em que a medição óptica irá ser feita. </li><li> Coloque os capilares Onto thbandeja capilar e e iniciar o dispositivo MST. </li></ol> 4. Iniciar o dispositivo MST NOTA: O aparelho oferece dois pacotes de software pré-instalado, o &#39;&#39; &quot;software para a configuração técnica das condições experimentais e de controle &#39;&#39; análise de&quot; software para a interpretação dos dados produzidos. <ol><li> Antes de colocar a bandeja do capilar para o dispositivo MST, inicie o software de controle e ajustar a temperatura desejada geral, selecionando &#39;&#39; permitem controle de temperatura manual &quot;no &#39;&#39; controle de temperatura&quot; menu suspenso. Ajustar a temperatura para 25 ° C no presente modo. NOTA: Os instrumentos MST pode ser 22 a 45 ° C de temperatura controlada. </li><li> Aguarde até que a temperatura para atingir o nível esperado e, em seguida, colocar a bandeja do capilar para o dispositivo MST. </li><li> Ajuste o canal de LED para &#39;&#39; vermelho &quot;para corantes Cy5 e ajustar a potência de LED para ganhar uma fl uorescence sinal de 300 a 1000 unidades de fluorescência a do dispositivo com um sensor de MST padrão. 25% de energia LED é utilizado neste estudo. NOTA: 6.000 a 18.000 unidades de fluorescência são recomendados para o MST com um sensor de alta sensibilidade. </li></ol> 5. Capilar de digitalização <ol><li> Realize uma verificação capilar para verificar aspectos diferentes de qualidade da amostra, escolhendo a posição capilar no software &quot;Control&quot; e clicar em &quot;Start Scan cap&quot; antes de iniciar a medição MST. </li><li> Inspecione a varredura capilar para fluorescência realce / têmpera e efeitos degola (em forma de U ou achatadas picos) no software. NOTA: Mais detalhes sobre a detecção e tratamento de fluorescência e efeitos degola pode ser encontrada na discussão. </li></ol> 6. Medição MST NOTA: Antes de iniciar a medição MST, certifique-se de excluir degola efeitos, realce / efeitos de têmpera, ouerros de pipetagem, e garantir que a digitalização capilar indica que o sinal de fluorescência é su fi ciente. Para mais detalhes, veja a discussão. <ol><li> Atribuir os concentrações de ligando a partir da série de diluição para a respectiva posição capilar no software &quot;&quot; controle &quot;Considere o passo de diluição da mistura do aptâmero e o ligando. (1: 1). </li><li> Digite a maior concentração de ligando (5 mM) para capilar # 1, selecione o tipo de diluição correta (aqui, 1: 1), clique sobre a concentração máxima e use a função arrastar para atribuir automaticamente as concentrações restantes capilares # 2- 16. A concentração mais baixa é de 152,6 nm. </li><li> Introduza a concentração de aptâmero uorescente FL (aqui, 100 nM) na respectiva secção do software de controlo. </li><li> Use as configurações padrão, que detectam a fluorescência durante 5 segundos, registrar o MST durante 30 segundos, e registrar a fluorescência por mais 5 segundos após a inativação do laser t<html> o monitorar a difusão volta das moléculas. </li><li> Ajustar a potência do laser para 20% na respectiva secção do software de controlo. NOTA: A fim de receber a melhor relação sinal-ruído e para evitar os efeitos não específicos, uma potência de laser de 20-40% é recomendada. Em casos específicos, a potência do laser maior pode ser necessária para obter uma boa separação de moléculas não ligadas e ligados. </li><li> Salve o experimento depois de selecionar a pasta de destino e iniciar a medição do MST, premindo o botão &#39;&#39; de medição Iniciar MST &quot;. NOTA: O arquivo .ntp será gerado na pasta de destino. Usando esta configuração, uma medida dura 10-15 min. </li><li> Repetir o procedimento experimental pelo menos duas vezes para uma determinação mais precisa do valor de CE 50. NOTA: Para testar a reprodutibilidade técnica, os mesmos capilares podem ser digitalizados várias vezes (repete técnicas). </li></ol> 7. Análise de Dados MST nt &quot;&gt; NOTA: O software de análise permite a análise de dados sobre a fl y durante a medição O software de análise de traça os traços de tempo MST e mudanças no normalizada fluorescência (norma F) versus a concentração do ligando 37.. <ol><li> Inicie o software de análise de MST (Análise MO.Affinity) e carregar o arquivo .ntp da pasta de destino. Selecione &quot;MST&quot; como o tipo de análise no menu de seleção de dados. Nota: Em caso de efeitos de fluorescência dependente do ligando, a fluorescência inicial pode ser escolhida para análise. </li><li> Adicionar o respectivo prazo (s) técnica ou biológica com uma nova análise por arrastar-e-soltar ou pressionando o botão &quot;+&quot; abaixo do respectivo prazo experimental. </li><li> Pressione o botão informações abaixo do respectivo prazo experimental para obter informações sobre as propriedades do experimento, os traços do MST, varredura capilar, forma capilar, fluorescência inicial e taxa de branqueamento. Nota: Estes dados brutos podem alpor isso ser inspecionados em etapas posteriores da análise. </li><li> Inspecione visualmente os vestígios do MST para efeitos de agregação e precipitação, visível como colisões e picos. NOTA: Para mais informações sobre a detecção e tratamento dos efeitos de agregação, leia a discussão. </li><li> inspecionar visualmente a varredura capilar e a sobreposição de forma capilar para efeitos de adsorção, visível como picos achatadas ou em forma de U. inspecionar visualmente a varredura capilar e a fluorescência inicial para efeitos de fluorescência. inspecionar visualmente a taxa de branqueamento para efeitos fotodegradação. </li><li> Alternar para o modo de dose-resposta e altere a configuração de análise para o modo &quot;expert&quot; pressionando o respectivo botão. Selecione &quot;T-Jump&quot;, como a estratégia de avaliação MST. </li><li> Selecione o modelo de &quot;Hill&quot; para a curva fi tting. Os parâmetros de ligação será automaticamente calculado. Normalizar os dados, escolhendo o respectivo tipo de normalização no menu &quot;comparar os resultados&quot;. exportar odados tanto como um .xls ou .pdf. NOTA: A tabela abaixo do gráfico de ligação resume os parâmetros obrigatórios calculados. </li></ol>

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controles de qualidade: Inespecífica colagem / adsorção do material da amostra para as superfícies, bem como os efeitos de agregação, ter uma influência dramática na qualidade dos dados de afinidade. No entanto, apenas algumas tecnologias state-of-the-art oferecem opções precisas e rápidas para monitorar e evitar esses efeitos. MST oferece controlos de qualidade integrados que detectam e ajudar a ultrapassar estes problemas, permitindo a optimização gradual da configuração técni...

A interacção entre as moléculas é a base da natureza. Assim, os cientistas em diversas áreas de pesquisa básica e aplicada tentar entender os princípios fundamentais de interacções moleculares de diferentes tipos. MicroScale termoforese (MST) permite aos cientistas realizar a caracterização rápida, precisa e de custo eficiente e de qualidade controlada de interações moleculares em solução, com uma livre escolha de buffers. Já existem mais de 1.000 publicações utilizando MST, a partir de 2016 sozinho, descrevendo diferentes tipos de análises, incluindo rastreios de bibliotecas, a ligação validações de eventos, ensaios de competição, e experimentos com múltiplos parceiros de ligação 1-8. Em geral, o MST permite o estudo dos parâmetros de ligação clássicos, tais como a afinidade de ligação (pM para mM), estequiometria, e termodinâmica, de qualquer tipo de interacção molecular. Uma grande vantagem de MST é a possibilidade de estudar eventos de ligação independentes do tamanho dos parceiros de interacção. mesmo chalinteracções entre lenging aptâmeros de ácidos nucleicos pequenos (15-30 nt) e alvos, tais como pequenas moléculas, drogas, antibióticos, ou metabolitos podem ser quantificados. Atuais tecnologias state-of-the-art para caracterizar as interações aptâmero-alvo são ou lab-intenso e altamente complexa ou não quantificar aptâmero-pequena molécula interações 9,10. Superfície Plasmon Resonance (SPR) à base de ensaios de 11,12 e abordagens calorimétricos verdadeiramente livre de rótulo, como Calorimetria isotérmica de titulação (ITC) 13-15, eluição isocrática 16, o equilíbrio infiltração 17,18, em linha sondagem 19, distribuição do gel mudar ensaios, stopped- fluxo de fluorescência espectroscopia 20,21, anisotropia de fluorescência (FA) 22,23, uma única molécula de fluorescência de imagem 24,25, e Bio-camada de interferometria (BLI) 26 também são ou imprecisa ou incompatível com a molécula do aptâmero-small interacções. Outros principal questões de estes métodos são de baixa sensibilidade, o consumo elevado de amostras, imobilização, as limitações de transporte de massa em superfícies, e / ou restrições de buffer. Apenas algumas destas tecnologias oferecem controles integrados para efeitos de agregação e de adsorção. MST representa uma ferramenta poderosa para os cientistas para superar esta limitação para estudar as interacções entre os aptâmeros e pequenas moléculas 27-29, bem como outros objectivos, tais como proteínas de 30-33. A tecnologia baseia-se no movimento de moléculas através de gradientes de temperatura. Este movimento dirigido, chamado &quot;termoforese,&quot; depende do tamanho, carga, e camada de hidratação da molécula 34,35. A ligação de um ligando para a molécula irá alterar directamente, pelo menos, um destes parâmetros, o que resulta em uma mobilidade alterada thermophoretic. Ligantes com tamanhos pequenos podem não ter um impacto considerável em termos de mudança de tamanho do não ligado ao estado ligado, mas eles podem ter dr<html> efeitos AMATIC sobre a camada de hidratação e / ou carga. As mudanças no movimento das moléculas após thermophoretic interacções com o parceiro de ligação permite a quantificação dos parâmetros de ligação de base 2,7,34,36,37. Tal como representado na Figura 1A, o dispositivo consiste MST de um laser infravermelho focalizada sobre a amostra, dentro dos capilares de vidro utilizando a mesma óptica como para a detecção de fluorescência. O movimento thermophoretic de proteínas através da fluorescência intrínseca dos resíduos de triptofano 6 ou de um parceiro de interacção 3,8 marcado por fluorescência podem ser monitorizadas enquanto o laser estabelece um gradiente de temperatura (AT de 2-6 ° C). A diferença de temperatura, resultando em espaço, AT, conduz à depleção ou da acumulação de moléculas na zona de temperatura elevada, que pode ser quantificado pelo coeficiente Soret (S T): g &quot;/&gt; c representa quente a concentração na região aquecida, e c frio é a concentração na região fria inicial. Como mostrado na Figura 1B, uma típica MST os resultados da experiência em um perfil de movimento MST (traço do tempo), que consiste em diferentes fases, que podem ser separadas pelos respectivos prazos. A fluorescência é medida inicial nos primeiros 5 s na ausência do gradiente de temperatura para definir a fluorescência a partir preciso e para verificar a fotobranqueamento ou photoenhancement. O salto de temperatura (T-Jump) representa a fase em que a fluorescência mudanças antes do movimento thermophoretic. Essa redução inicial na fluorescência depende de mudanças dependentes do calor de fl uorophore rendimento quântico. A fase termoforese segue, em que as reduções de fluorescência (ou aumento), devido ao movimento das moléculas de thermophoretic até que a distribuição em estado estacionário é atingido.O TJump reversa e concomitante difusão de moléculas de volta uorescent fl pode ser observado como indicado na figura 1B após o laser é desligado. De modo a aceder aos parâmetros de ligação de base, diferentes razões molares dos parceiros de interacção são analisados ​​e comparados. Tipicamente, 16 diferentes proporções são estudadas numa experiência MST, enquanto que a molécula visível óptico é mantido constante e é fornecido com uma quantidade crescente de ligando não marcado. A interacção entre os dois parceiros de ligação induz alterações na termoforese, e, assim, na fluorescência normalizada, F norma, que é calculada como se segue: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F quente e fria F representam em média intensidades fluorescência na de fi nidas pontos no tempo dos traços do MST. As afinidades de ligação (Kd ou valores de EC50) pode ser calculada por Curve encaixe (Figura 1C). No geral, o MST é uma ferramenta poderosa para estudar interações moleculares de qualquer tipo. Este manuscrito oferece um protocolo para caracterizar a interação desafio entre a pequena molécula de trifosfato de adenosina (ATP; 0,5 kDa) e do 25-nt curta ssDNA aptâmero DH25.42 (7,9 kDa). Ao longo do manuscrito, o local de ligação do aptâmero na molécula de ATP é mapeado para baixo para o grupo de adenina do ATP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Aptamer binding buffer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescently labeled ATP aptamer</td>
			<td>IDT, Leuven, Belgium</td>
			<td ></td>
			<td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-ATTGCGGAGGAAGG-3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2383</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ADP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2754</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AMP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2252</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A8626</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SAM</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A7007</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >11934511001</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>C1506</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >G8877</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115&#160;</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-G008</td>
			<td>Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115 capillaries Standard</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-K002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf PCR tubes</td>
			<td >Eppendorf, Germany</td>
			<td >30124537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MO.affinity analysis v2.1.1</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaleidagraph 4.5.2</td>
			<td >Synergy Software</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

Neste estudo, o MST foi aplicado para caracterizar o local de ligação do aptâmero ADN DH25.42 18 em ATP. Em contraste com outros estudos que caracterizam a interacção de ATP ou ATP-imitando as moléculas pequenas com as proteínas marcadas aleatoriamente com um ou mais fluoróforos 38-40, este estudo inclui uma versão marcada do aptâmero 7,9 kDa ADNcs com uma molécula de Cy5 na extremidade 5&#39; . Diferentes derivados de ATP e de moléculas relacionadas, to...

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K visualizações.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

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Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Quantificação dos Quinase bacteriana Histidina Autofosforilação utilizando um ensaio de ligação de nitrocelulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Bioquímica

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

Determinação de alta-afinidade de anticorpo-antigénio Cinética de ligação utilizando quatro plataformas Biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...