Los autores no tienen reconocimientos.

1. Preparación del aptámero de Trabajo de la <ol><li> Siga las instrucciones del fabricante y se disuelve el oligonucleótido (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la secuencia de referencia 18) en agua, alcanzando una concentración final de 100 mM. </li><li> Preparar la solución de aptámero de trabajo diluyendo la solución madre oligonucleótido a 200 nm con tampón de unión (Tris 20 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; MgCl2 5 mM, Tween 20 al 0,01%). </li><li> Incubar la mezcla durante 2 min a 90 ° C, permita que la muestra se enfríe inmediatamente en hielo, y el uso de la muestra a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparación de la serie de diluciones de ligandos <ol><li> Para cada ligando (adenosina trifosfato (ATP), difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de adenosina (AMP), adenina, guanosina trifosfato (GTP), trifosfato de citosina (CTP), desoxiadenosina trifosfato (dATP), y S-adenosil metionina (SAM) ; 10 mM cada uno), preparar una diluti serie de 16 pasosen en 200 l tubos de reacción Micro. NOTA: La centrifugación de las poblaciones de ligando durante 5 min a 14.000 xg puede ayudar a eliminar los agregados. Bajo volumen, se recomienda a los tubos de reacción de unión bajas para evitar la adsorción de moléculas a las paredes del tubo. </li><li> Comienza con una concentración máxima de al menos 50 veces mayor que la afinidad estimada y reducir la concentración de ligando en un 50% en cada etapa de dilución. NOTA: La herramienta de búsqueda de concentración llevada a cabo en el software de control simula los datos de unión y ayuda a encontrar el rango de concentración adecuado para la serie de dilución. </li><li> Llenar 20 l de ligando de stock (10 mM) en el tubo 1. Añadir 10 l de tampón de unión de aptámeros en tubos de reacción micro 2-16. </li><li> Transferencia de 10 l de tubo 1 al tubo 2 y mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces. Transferir 10 l al siguiente tubo y repetir esta dilución para los tubos restantes. </li><li> Descartar el exceso de 10 l del último tubo. B evitar cualquierUffer efectos de dilución. El tampón en el tubo 1 y en los tubos de 2-16 debe ser idéntica. </li></ol> 3. Preparación de la mezcla final de reacción <ol><li> Preparar las reacciones de unión individuales con un volumen de 20 l (10 l de solución de trabajo de aptámero + 10 l de la dilución ligando respectivo) para minimizar los errores de pipeteado. Un volumen de sólo 4 l es su fi ciente para llenar el capilar. </li><li> Añadir 10 l de la solución de trabajo 200 nM de aptámero a 10 l de cada dilución ligando y mezclar adecuadamente pipeteando arriba y abajo varias veces. </li><li> Se incuban las muestras durante 5 min a temperatura ambiente y fi ll las muestras en tubos capilares estándar por inmersión de los capilares en la muestra. tiempos de incubación más largos pueden ser necesarios para algunas interacciones; sin embargo, 5 min es adecuada para la mayoría. Toca los capilares sólo en los lados, no en la parte media, donde se toma la medición óptica. </li><li> Colocar los capilares a la sabandeja de correo capilar e iniciar el dispositivo MST. </li></ol> 4. Puesta en marcha del dispositivo MST NOTA: El dispositivo ofrece dos paquetes de software pre-instalado, el &quot;software para la configuración técnica de las condiciones experimentales y el control &#39;&#39; análisis&quot; &#39;software para la interpretación de los datos producidos. <ol><li> Antes de colocar la bandeja capilar en el dispositivo MST, inicie el software de control y ajuste la temperatura global deseada seleccionando &#39;&#39; permitir el control manual de temperatura &quot;en el &#39;&#39; control de la temperatura&quot; menú desplegable. Ajustar la temperatura a 25 ° C de esta manera. NOTA: Los instrumentos MST pueden ser de temperatura controlada 22 a 45 ° C. </li><li> Espere a que la temperatura alcance el nivel esperado y luego colocar la bandeja capilar en el dispositivo MST. </li><li> Ajuste el canal de LED para &#39;&#39; roja &quot;para los colorantes Cy5 y ajustar la potencia de LED para obtener una fl uorescence señal de 300 a 1000 unidades de fluorescencia en el dispositivo MST con un sensor estándar. de energía del LED 25% se utiliza en este estudio. NOTA: Se recomienda a entre 6.000 y 18.000 unidades de fluorescencia para el MST con un sensor de alta sensibilidad. </li></ol> 5. capilar Scan <ol><li> Realizar un análisis capilar para comprobar aspectos diferentes de calidad de la muestra por la elección de la posición capilar sobre el software de &quot;control&quot; y hacer clic en &quot;iniciar la exploración de tope&quot; antes de iniciar la medición MST. </li><li> Inspeccionar el análisis capilar para la mejora de la fluorescencia / temple y efectos que se pegan (en forma de U o aplanado picos) en el software. NOTA: Más detalles sobre la detección y manejo de fluorescencia y se pegan efectos se pueden encontrar en la discusión. </li></ol> 6. Medición MST NOTA: Antes de iniciar la medición MST, asegúrese de excluir a pegarse efectos, el realce / efectos de temple, olos errores de pipeteo, y asegurar que la exploración capilar indica que la señal de fluorescencia es su fi ciente. Para más detalles, véase la discusión. <ol><li> Asignar las concentraciones de ligando de la serie de diluciones a la posición respectiva en el capilar software &#39;&#39; de control de &quot;Considere la etapa de dilución de la mezcla del aptámero y el ligando. (1: 1). </li><li> Introduce la mayor concentración de ligando (5 mM) durante capilar # 1, seleccione el tipo de dilución correcta (en este caso, 1: 1), haga clic en la concentración máxima, y ​​utilizar la función de arrastrar para asignar automáticamente las concentraciones restantes en los capilares # 2- dieciséis. La concentración más baja es de 152,6 nm. </li><li> Introduzca la concentración del aptámero fluorescente fl (aquí, 100 nM) en la sección respectiva del software de control. </li><li> Utilice la configuración predeterminada, que detectan la fluorescencia durante 5 segundos, el MST grabar durante 30 segundos, y registrar la fluorescencia de 5 segundos más después de la inactivación del láser t<html> o controlar la difusión posterior de las moléculas. </li><li> Ajustar la potencia del láser a 20% en la sección respectiva del software de control. NOTA: Para poder recibir la mejor relación señal-ruido y para evitar efectos no específicos, se recomienda una potencia de láser de 20-40%. En casos específicos, una mayor potencia del láser puede ser necesaria para obtener una buena separación de las moléculas no unidas y unidos. </li><li> Guarde el experimento después de seleccionar la carpeta de destino y comenzar la medición MST pulsando el botón &#39;&#39; Iniciar la medición MST &quot;. NOTA: El archivo .ntp se generará en la carpeta de destino. Con esta instalación, una medición tiene una duración de 10-15 minutos. </li><li> Repetir el procedimiento experimental al menos dos veces para una determinación más precisa del valor CE 50. NOTA: Con el fin de probar la reproducibilidad técnica, los mismos capilares se pueden escanear varias veces (repeticiones técnicas). </li></ol> 7. Análisis de datos MST nt &quot;&gt; NOTA: El software de análisis permite el análisis de los datos de la mosca durante la medición El software de análisis de traza las huellas del tiempo del MST y los cambios en la normalizado de fluorescencia (norma F) frente a la concentración de ligando 37.. <ol><li> Iniciar el software de análisis de MST (Análisis MO.Affinity) y cargar el archivo .ntp de la carpeta de destino. Seleccione &quot;MST&quot; como el tipo de análisis en el menú de selección de datos. NOTA: En caso de efectos de fluorescencia dependientes de ligando, la fluorescencia inicial se puede elegir para su análisis. </li><li> Añadir la respectiva carrera (s) técnica o biológica a un nuevo análisis de arrastrar y soltar o presionando el botón &quot;+&quot; por debajo de la respectiva prueba experimental. </li><li> Presione el botón de información por debajo de la respectiva prueba experimental para obtener información sobre las propiedades del experimento, los rastros del MST, escaneo capilar, forma capilar, fluorescencia inicial y la tasa de blanqueo. Nota: Estos datos en bruto puede colpor lo que ser inspeccionados en las etapas posteriores del análisis. </li><li> una inspección visual de los restos del MST para la agregación y precipitación efectos visibles, como golpes y picos. NOTA: Para obtener más información sobre la detección y manejo de los efectos de agregación, leer la discusión. </li><li> Inspeccione visualmente el análisis capilar y la superposición de forma capilar para efectos de adsorción, visible como picos aplanados o en forma de U. Inspeccione visualmente el análisis capilar y la fluorescencia inicial para efectos de fluorescencia. una inspección visual de la tasa de blanqueo para efectos photobleaching. </li><li> Cambiar al modo dosis-respuesta y cambiar la configuración de análisis para el modo &quot;experto&quot; pulsando el botón correspondiente. Seleccionar &quot;T-Jump&quot;, como la estrategia de evaluación del MST. </li><li> Seleccione el modelo de &quot;Colina&quot; para la curva fi tting. se calculará automáticamente los parámetros de unión. Normalizar los datos mediante la elección del tipo respectivo de la normalización en el menú de &quot;comparación de resultados&quot;. exportar eldatos, ya sea como un archivo .xls o .pdf. NOTA: La tabla debajo del gráfico de unión se resumen los parámetros de unión calculados. </li></ol>

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Los controles de calidad: adherencia inespecífica / adsorción de material de muestra a las superficies, así como los efectos de agregación, tiene una influencia dramática en la calidad de los datos de afinidad. Sin embargo, sólo unas pocas tecnologías de última generación ofrecen opciones precisos y rápidos para controlar y evitar estos efectos. MST ofrece controles de calidad integrados que detectan y ayudan a superar estos problemas, lo que permite la optimización paso a paso de la...

La interacción entre las moléculas es la base de la naturaleza. Por lo tanto, los científicos en muchos campos de la investigación básica y aplicada tratan de comprender los principios fundamentales de las interacciones moleculares de diferentes tipos. MicroScale termoforesis (MST) permite a los científicos para llevar a cabo la caracterización rápida, precisa y rentable, y con control de calidad de las interacciones moleculares en solución, con una libre elección de tampones. Ya hay más de 1.000 publicaciones utilizando MST, a partir de 2016 solo, que describe diferentes tipos de análisis, incluyendo proyecciones de la biblioteca, validaciones de eventos, ensayos de competición, y los experimentos de unión con múltiples parejas de unión 1-8. En general, MST permite el estudio de los parámetros de unión clásicos, tales como la afinidad de unión (pM ​​a mM), estequiometría, y la termodinámica, de cualquier tipo de interacción molecular. Una gran ventaja de MST es la capacidad para estudiar eventos de unión independientes del tamaño de las parejas de interacción. incluso chalinteracciones lenging entre pequeños aptámeros de ácido nucleico (15-30 nt) y objetivos tales como moléculas pequeñas, fármacos, antibióticos, o metabolitos pueden ser cuantificados. Las tecnologías actuales del estado de la técnica para caracterizar las interacciones aptámero-objetivo son ya sea en laboratorio intensa y de gran complejidad o no se cuantifica aptámero-molécula pequeña Interacciones de 9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) a base de ensayos colorimétricos 11,12 y enfoques verdaderamente libre de marca, tales como calorimetría de titulación isotérmica (ITC) 13-15, elución isocrática 16, el equilibrio filtración 17,18, el sondeo en línea 19, de gel cambiar ensayos, stopped- flujo espectroscopía de fluorescencia 20,21, anisotropía de fluorescencia (FA) 22,23, de una sola molécula de fluorescencia de imagen 24,25, y Bio-capa de interferometría (BLI) 26 también son bien imprecisa o incompatible con la molécula del aptámero microcítico interacciones. otros principal problemas de estos métodos son de baja sensibilidad, alto consumo de ejemplo, la inmovilización, las limitaciones de transporte de masa en las superficies, y / o restricciones de amortiguamiento. Sólo unas pocas de estas tecnologías proporcionan controles integrados para la agregación y adsorción efectos. MST representa una poderosa herramienta para los científicos para superar esta limitación para estudiar las interacciones entre los aptámeros y moléculas pequeñas 27-29, así como otros objetivos, tales como proteínas 30-33. La tecnología se basa en el movimiento de moléculas a través de gradientes de temperatura. Este movimiento dirigido, llamado &quot;termoforesis,&quot; depende del tamaño, la carga, y la capa de hidratación de la molécula 34,35. La unión de un ligando a la molécula alterará directamente al menos uno de estos parámetros, lo que resulta en una movilidad termoforético cambiado. Ligandos con tamaños pequeños pueden no tener un impacto considerable en términos de cambio de tamaño de la independiente al estado ligado, pero pueden tener dr<html> Amatic efectos sobre la capa de hidratación y / o carga. Los cambios en el movimiento termoforético de moléculas después de la interacción con la pareja de unión permite la cuantificación de los parámetros de unión básicas 2,7,34,36,37. Como se muestra en la Figura 1A, el dispositivo MST consta de un láser infrarrojo enfocado sobre la muestra dentro de los capilares de vidrio utilizando la misma óptica como para la detección de fluorescencia. El movimiento termoforético de las proteínas a través de la fluorescencia intrínseca de triptófanos 6 o de un 3,8 pareja de interacción marcado con fluorescencia se puede monitorizar mientras el láser se establece un gradiente de temperatura (? T de 2-6 ° C). La diferencia de temperatura resultante en el espacio,? T, conduce al agotamiento o la acumulación de moléculas en el área de temperatura elevada, que se puede cuantificar por el Soret coeficiente (S T): g &quot;/&gt; c caliente representa la concentración en la región calentada, y c es la concentración de frío en la región en frío inicial. Como se muestra en la Figura 1B, un típico experimento MST produce un perfil de movimiento MST (traza el tiempo), que consta de diferentes fases, que pueden separarse por sus respectivas escalas de tiempo. La fluorescencia inicial se mide en los primeros 5 s en ausencia del gradiente de temperatura para definir la fluorescencia a partir preciso y para comprobar si hay photobleaching o photoenhancement. El salto de temperatura (T-Jump) representa la fase en la que los cambios de fluorescencia antes del movimiento termoforético. Esta disminución inicial de la fluorescencia depende de cambios dependientes de calor de fluoróforo rendimiento cuántico. La fase termoforesis sigue, en el que se alcanza la disminución de fluorescencia (o aumenta) debido al movimiento de las moléculas termoforético hasta la distribución en el estado estacionario.El TJump inversa y retrodifusión concomitante de moléculas fluorescentes fl se pueden observar como se indica en la figura 1B después de que el láser está apagado. Con el fin de acceder a los parámetros básicos de unión, diferentes relaciones molares de los compañeros de interacción son analizados y comparados. Típicamente, 16 relaciones diferentes se estudian en un experimento MST, mientras que la molécula visible óptico se mantiene constante y se suministra con una cantidad creciente de ligando no marcado. La interacción entre las dos parejas de unión induce cambios en la termoforesis, y así en la fluorescencia normalizada, F norma, que se calcula de la siguiente manera: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F caliente y fría F representan un promedio de intensidades de fluorescencia en puntos de tiempo de fi nido de las huellas del MST. Las afinidades de unión (Kd o valores de EC50) se pueden calcular por curve apropiado (Figura 1C). En general, el MST es una poderosa herramienta para estudiar las interacciones moleculares de ningún tipo. Este manuscrito ofrece un protocolo para caracterizar la interacción entre el reto pequeña molécula de trifosfato de adenosina (ATP; 0,5 kDa) y el 25-nt corto ssDNA aptámero DH25.42 (7,9 kDa). En el transcurso del manuscrito, el sitio de unión del aptámero en la molécula de ATP se mapea hasta el grupo adenina del ATP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Aptamer binding buffer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescently labeled ATP aptamer</td>
			<td>IDT, Leuven, Belgium</td>
			<td ></td>
			<td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-ATTGCGGAGGAAGG-3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2383</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ADP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2754</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AMP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2252</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A8626</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SAM</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A7007</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >11934511001</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>C1506</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >G8877</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115&#160;</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-G008</td>
			<td>Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115 capillaries Standard</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-K002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf PCR tubes</td>
			<td >Eppendorf, Germany</td>
			<td >30124537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MO.affinity analysis v2.1.1</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaleidagraph 4.5.2</td>
			<td >Synergy Software</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

En este estudio, se aplicó MST para caracterizar el sitio de unión del aptámero de ADN DH25.42 18 en ATP. En contraste con otros estudios que caracterizan la interacción de ATP o ATP que imitan moléculas pequeñas con proteínas marcadas aleatoriamente con uno o más fluoróforos 38-40, este estudio incluye una versión etiquetada del aptámero 7,9 kDa ssDNA con una molécula de Cy5 en el extremo 5 &#39; . Diferentes derivados de ATP y moléculas relacionadas, ...

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K vistas.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

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Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Investigación

Bioquímica

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

Determinación de alta afinidad anticuerpo-antígeno Cinética de unión usando cuatro plataformas Biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Microgravimetry disipativo para estudiar la dinámica de unión de la fosfolípido vinculante proteínas anexina A2 a bicapas de lípidos respaldados por el sólido utilizando un resonador de cuarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Medición de las interacciones de las proteínas globulares y filamentosas por espectroscopia de resonancia magnética Nuclear (RMN) y microescala Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Evaluación de interacciones proteínas-proteínas utilizando una técnica de digestión en la membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...