Los autores no tienen reconocimientos.

1. Preparación del aptámero de Trabajo de la <ol><li> Siga las instrucciones del fabricante y se disuelve el oligonucleótido (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la secuencia de referencia 18) en agua, alcanzando una concentración final de 100 mM. </li><li> Preparar la solución de aptámero de trabajo diluyendo la solución madre oligonucleótido a 200 nm con tampón de unión (Tris 20 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; MgCl2 5 mM, Tween 20 al 0,01%). </li><li> Incubar la mezcla durante 2 min a 90 ° C, permita que la muestra se enfríe inmediatamente en hielo, y el uso de la muestra a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparación de la serie de diluciones de ligandos <ol><li> Para cada ligando (adenosina trifosfato (ATP), difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de adenosina (AMP), adenina, guanosina trifosfato (GTP), trifosfato de citosina (CTP), desoxiadenosina trifosfato (dATP), y S-adenosil metionina (SAM) ; 10 mM cada uno), preparar una diluti serie de 16 pasosen en 200 l tubos de reacción Micro. NOTA: La centrifugación de las poblaciones de ligando durante 5 min a 14.000 xg puede ayudar a eliminar los agregados. Bajo volumen, se recomienda a los tubos de reacción de unión bajas para evitar la adsorción de moléculas a las paredes del tubo. </li><li> Comienza con una concentración máxima de al menos 50 veces mayor que la afinidad estimada y reducir la concentración de ligando en un 50% en cada etapa de dilución. NOTA: La herramienta de búsqueda de concentración llevada a cabo en el software de control simula los datos de unión y ayuda a encontrar el rango de concentración adecuado para la serie de dilución. </li><li> Llenar 20 l de ligando de stock (10 mM) en el tubo 1. Añadir 10 l de tampón de unión de aptámeros en tubos de reacción micro 2-16. </li><li> Transferencia de 10 l de tubo 1 al tubo 2 y mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces. Transferir 10 l al siguiente tubo y repetir esta dilución para los tubos restantes. </li><li> Descartar el exceso de 10 l del último tubo. B evitar cualquierUffer efectos de dilución. El tampón en el tubo 1 y en los tubos de 2-16 debe ser idéntica. </li></ol> 3. Preparación de la mezcla final de reacción <ol><li> Preparar las reacciones de unión individuales con un volumen de 20 l (10 l de solución de trabajo de aptámero + 10 l de la dilución ligando respectivo) para minimizar los errores de pipeteado. Un volumen de sólo 4 l es su fi ciente para llenar el capilar. </li><li> Añadir 10 l de la solución de trabajo 200 nM de aptámero a 10 l de cada dilución ligando y mezclar adecuadamente pipeteando arriba y abajo varias veces. </li><li> Se incuban las muestras durante 5 min a temperatura ambiente y fi ll las muestras en tubos capilares estándar por inmersión de los capilares en la muestra. tiempos de incubación más largos pueden ser necesarios para algunas interacciones; sin embargo, 5 min es adecuada para la mayoría. Toca los capilares sólo en los lados, no en la parte media, donde se toma la medición óptica. </li><li> Colocar los capilares a la sabandeja de correo capilar e iniciar el dispositivo MST. </li></ol> 4. Puesta en marcha del dispositivo MST NOTA: El dispositivo ofrece dos paquetes de software pre-instalado, el &quot;software para la configuración técnica de las condiciones experimentales y el control &#39;&#39; análisis&quot; &#39;software para la interpretación de los datos producidos. <ol><li> Antes de colocar la bandeja capilar en el dispositivo MST, inicie el software de control y ajuste la temperatura global deseada seleccionando &#39;&#39; permitir el control manual de temperatura &quot;en el &#39;&#39; control de la temperatura&quot; menú desplegable. Ajustar la temperatura a 25 ° C de esta manera. NOTA: Los instrumentos MST pueden ser de temperatura controlada 22 a 45 ° C. </li><li> Espere a que la temperatura alcance el nivel esperado y luego colocar la bandeja capilar en el dispositivo MST. </li><li> Ajuste el canal de LED para &#39;&#39; roja &quot;para los colorantes Cy5 y ajustar la potencia de LED para obtener una fl uorescence señal de 300 a 1000 unidades de fluorescencia en el dispositivo MST con un sensor estándar. de energía del LED 25% se utiliza en este estudio. NOTA: Se recomienda a entre 6.000 y 18.000 unidades de fluorescencia para el MST con un sensor de alta sensibilidad. </li></ol> 5. capilar Scan <ol><li> Realizar un análisis capilar para comprobar aspectos diferentes de calidad de la muestra por la elección de la posición capilar sobre el software de &quot;control&quot; y hacer clic en &quot;iniciar la exploración de tope&quot; antes de iniciar la medición MST. </li><li> Inspeccionar el análisis capilar para la mejora de la fluorescencia / temple y efectos que se pegan (en forma de U o aplanado picos) en el software. NOTA: Más detalles sobre la detección y manejo de fluorescencia y se pegan efectos se pueden encontrar en la discusión. </li></ol> 6. Medición MST NOTA: Antes de iniciar la medición MST, asegúrese de excluir a pegarse efectos, el realce / efectos de temple, olos errores de pipeteo, y asegurar que la exploración capilar indica que la señal de fluorescencia es su fi ciente. Para más detalles, véase la discusión. <ol><li> Asignar las concentraciones de ligando de la serie de diluciones a la posición respectiva en el capilar software &#39;&#39; de control de &quot;Considere la etapa de dilución de la mezcla del aptámero y el ligando. (1: 1). </li><li> Introduce la mayor concentración de ligando (5 mM) durante capilar # 1, seleccione el tipo de dilución correcta (en este caso, 1: 1), haga clic en la concentración máxima, y ​​utilizar la función de arrastrar para asignar automáticamente las concentraciones restantes en los capilares # 2- dieciséis. La concentración más baja es de 152,6 nm. </li><li> Introduzca la concentración del aptámero fluorescente fl (aquí, 100 nM) en la sección respectiva del software de control. </li><li> Utilice la configuración predeterminada, que detectan la fluorescencia durante 5 segundos, el MST grabar durante 30 segundos, y registrar la fluorescencia de 5 segundos más después de la inactivación del láser t<html> o controlar la difusión posterior de las moléculas. </li><li> Ajustar la potencia del láser a 20% en la sección respectiva del software de control. NOTA: Para poder recibir la mejor relación señal-ruido y para evitar efectos no específicos, se recomienda una potencia de láser de 20-40%. En casos específicos, una mayor potencia del láser puede ser necesaria para obtener una buena separación de las moléculas no unidas y unidos. </li><li> Guarde el experimento después de seleccionar la carpeta de destino y comenzar la medición MST pulsando el botón &#39;&#39; Iniciar la medición MST &quot;. NOTA: El archivo .ntp se generará en la carpeta de destino. Con esta instalación, una medición tiene una duración de 10-15 minutos. </li><li> Repetir el procedimiento experimental al menos dos veces para una determinación más precisa del valor CE 50. NOTA: Con el fin de probar la reproducibilidad técnica, los mismos capilares se pueden escanear varias veces (repeticiones técnicas). </li></ol> 7. Análisis de datos MST nt &quot;&gt; NOTA: El software de análisis permite el análisis de los datos de la mosca durante la medición El software de análisis de traza las huellas del tiempo del MST y los cambios en la normalizado de fluorescencia (norma F) frente a la concentración de ligando 37.. <ol><li> Iniciar el software de análisis de MST (Análisis MO.Affinity) y cargar el archivo .ntp de la carpeta de destino. Seleccione &quot;MST&quot; como el tipo de análisis en el menú de selección de datos. NOTA: En caso de efectos de fluorescencia dependientes de ligando, la fluorescencia inicial se puede elegir para su análisis. </li><li> Añadir la respectiva carrera (s) técnica o biológica a un nuevo análisis de arrastrar y soltar o presionando el botón &quot;+&quot; por debajo de la respectiva prueba experimental. </li><li> Presione el botón de información por debajo de la respectiva prueba experimental para obtener información sobre las propiedades del experimento, los rastros del MST, escaneo capilar, forma capilar, fluorescencia inicial y la tasa de blanqueo. Nota: Estos datos en bruto puede colpor lo que ser inspeccionados en las etapas posteriores del análisis. </li><li> una inspección visual de los restos del MST para la agregación y precipitación efectos visibles, como golpes y picos. NOTA: Para obtener más información sobre la detección y manejo de los efectos de agregación, leer la discusión. </li><li> Inspeccione visualmente el análisis capilar y la superposición de forma capilar para efectos de adsorción, visible como picos aplanados o en forma de U. Inspeccione visualmente el análisis capilar y la fluorescencia inicial para efectos de fluorescencia. una inspección visual de la tasa de blanqueo para efectos photobleaching. </li><li> Cambiar al modo dosis-respuesta y cambiar la configuración de análisis para el modo &quot;experto&quot; pulsando el botón correspondiente. Seleccionar &quot;T-Jump&quot;, como la estrategia de evaluación del MST. </li><li> Seleccione el modelo de &quot;Colina&quot; para la curva fi tting. se calculará automáticamente los parámetros de unión. Normalizar los datos mediante la elección del tipo respectivo de la normalización en el menú de &quot;comparación de resultados&quot;. exportar eldatos, ya sea como un archivo .xls o .pdf. NOTA: La tabla debajo del gráfico de unión se resumen los parámetros de unión calculados. </li></ol>

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Los controles de calidad: adherencia inespecífica / adsorción de material de muestra a las superficies, así como los efectos de agregación, tiene una influencia dramática en la calidad de los datos de afinidad. Sin embargo, sólo unas pocas tecnologías de última generación ofrecen opciones precisos y rápidos para controlar y evitar estos efectos. MST ofrece controles de calidad integrados que detectan y ayudan a superar estos problemas, lo que permite la optimización paso a paso de la...

La interacción entre las moléculas es la base de la naturaleza. Por lo tanto, los científicos en muchos campos de la investigación básica y aplicada tratan de comprender los principios fundamentales de las interacciones moleculares de diferentes tipos. MicroScale termoforesis (MST) permite a los científicos para llevar a cabo la caracterización rápida, precisa y rentable, y con control de calidad de las interacciones moleculares en solución, con una libre elección de tampones. Ya hay más de 1.000 publicaciones utilizando MST, a partir de 2016 solo, que describe diferentes tipos de análisis, incluyendo proyecciones de la biblioteca, validaciones de eventos, ensayos de competición, y los experimentos de unión con múltiples parejas de unión 1-8. En general, MST permite el estudio de los parámetros de unión clásicos, tales como la afinidad de unión (pM ​​a mM), estequiometría, y la termodinámica, de cualquier tipo de interacción molecular. Una gran ventaja de MST es la capacidad para estudiar eventos de unión independientes del tamaño de las parejas de interacción. incluso chalinteracciones lenging entre pequeños aptámeros de ácido nucleico (15-30 nt) y objetivos tales como moléculas pequeñas, fármacos, antibióticos, o metabolitos pueden ser cuantificados. Las tecnologías actuales del estado de la técnica para caracterizar las interacciones aptámero-objetivo son ya sea en laboratorio intensa y de gran complejidad o no se cuantifica aptámero-molécula pequeña Interacciones de 9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) a base de ensayos colorimétricos 11,12 y enfoques verdaderamente libre de marca, tales como calorimetría de titulación isotérmica (ITC) 13-15, elución isocrática 16, el equilibrio filtración 17,18, el sondeo en línea 19, de gel cambiar ensayos, stopped- flujo espectroscopía de fluorescencia 20,21, anisotropía de fluorescencia (FA) 22,23, de una sola molécula de fluorescencia de imagen 24,25, y Bio-capa de interferometría (BLI) 26 también son bien imprecisa o incompatible con la molécula del aptámero microcítico interacciones. otros principal problemas de estos métodos son de baja sensibilidad, alto consumo de ejemplo, la inmovilización, las limitaciones de transporte de masa en las superficies, y / o restricciones de amortiguamiento. Sólo unas pocas de estas tecnologías proporcionan controles integrados para la agregación y adsorción efectos. MST representa una poderosa herramienta para los científicos para superar esta limitación para estudiar las interacciones entre los aptámeros y moléculas pequeñas 27-29, así como otros objetivos, tales como proteínas 30-33. La tecnología se basa en el movimiento de moléculas a través de gradientes de temperatura. Este movimiento dirigido, llamado &quot;termoforesis,&quot; depende del tamaño, la carga, y la capa de hidratación de la molécula 34,35. La unión de un ligando a la molécula alterará directamente al menos uno de estos parámetros, lo que resulta en una movilidad termoforético cambiado. Ligandos con tamaños pequeños pueden no tener un impacto considerable en términos de cambio de tamaño de la independiente al estado ligado, pero pueden tener dr<html> Amatic efectos sobre la capa de hidratación y / o carga. Los cambios en el movimiento termoforético de moléculas después de la interacción con la pareja de unión permite la cuantificación de los parámetros de unión básicas 2,7,34,36,37. Como se muestra en la Figura 1A, el dispositivo MST consta de un láser infrarrojo enfocado sobre la muestra dentro de los capilares de vidrio utilizando la misma óptica como para la detección de fluorescencia. El movimiento termoforético de las proteínas a través de la fluorescencia intrínseca de triptófanos 6 o de un 3,8 pareja de interacción marcado con fluorescencia se puede monitorizar mientras el láser se establece un gradiente de temperatura (? T de 2-6 ° C). La diferencia de temperatura resultante en el espacio,? T, conduce al agotamiento o la acumulación de moléculas en el área de temperatura elevada, que se puede cuantificar por el Soret coeficiente (S T): g &quot;/&gt; c caliente representa la concentración en la región calentada, y c es la concentración de frío en la región en frío inicial. Como se muestra en la Figura 1B, un típico experimento MST produce un perfil de movimiento MST (traza el tiempo), que consta de diferentes fases, que pueden separarse por sus respectivas escalas de tiempo. La fluorescencia inicial se mide en los primeros 5 s en ausencia del gradiente de temperatura para definir la fluorescencia a partir preciso y para comprobar si hay photobleaching o photoenhancement. El salto de temperatura (T-Jump) representa la fase en la que los cambios de fluorescencia antes del movimiento termoforético. Esta disminución inicial de la fluorescencia depende de cambios dependientes de calor de fluoróforo rendimiento cuántico. La fase termoforesis sigue, en el que se alcanza la disminución de fluorescencia (o aumenta) debido al movimiento de las moléculas termoforético hasta la distribución en el estado estacionario.El TJump inversa y retrodifusión concomitante de moléculas fluorescentes fl se pueden observar como se indica en la figura 1B después de que el láser está apagado. Con el fin de acceder a los parámetros básicos de unión, diferentes relaciones molares de los compañeros de interacción son analizados y comparados. Típicamente, 16 relaciones diferentes se estudian en un experimento MST, mientras que la molécula visible óptico se mantiene constante y se suministra con una cantidad creciente de ligando no marcado. La interacción entre las dos parejas de unión induce cambios en la termoforesis, y así en la fluorescencia normalizada, F norma, que se calcula de la siguiente manera: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F caliente y fría F representan un promedio de intensidades de fluorescencia en puntos de tiempo de fi nido de las huellas del MST. Las afinidades de unión (Kd o valores de EC50) se pueden calcular por curve apropiado (Figura 1C). En general, el MST es una poderosa herramienta para estudiar las interacciones moleculares de ningún tipo. Este manuscrito ofrece un protocolo para caracterizar la interacción entre el reto pequeña molécula de trifosfato de adenosina (ATP; 0,5 kDa) y el 25-nt corto ssDNA aptámero DH25.42 (7,9 kDa). En el transcurso del manuscrito, el sitio de unión del aptámero en la molécula de ATP se mapea hasta el grupo adenina del ATP.

<table><tbody><tr><td>Aptamer binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 0.01% Tween-20</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled ATP aptamer</td><td>IDT, Leuven, Belgium</td><td></td><td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-&lt;br/&gt;ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>G8877</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Monolith NT.115&amp;nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-G008</td><td>Blue/Red Channel&lt;br/&gt; MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 capillaries Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tubes</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

En este estudio, se aplicó MST para caracterizar el sitio de unión del aptámero de ADN DH25.42 18 en ATP. En contraste con otros estudios que caracterizan la interacción de ATP o ATP que imitan moléculas pequeñas con proteínas marcadas aleatoriamente con uno o más fluoróforos 38-40, este estudio incluye una versión etiquetada del aptámero 7,9 kDa ssDNA con una molécula de Cy5 en el extremo 5 &#39; . Diferentes derivados de ATP y moléculas relacionadas, ...

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

mapping-binding-site-an-aptamer-on-atp-using-microscale

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K vistas.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Video: Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

Selección de aptámeros ADN enlace de éster ácido ftálico, caracterización y aplicación a un Aptasensor electroquímico

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Investigación

Química

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Uso de la termoforesis a microescala para medir las interacciones proteína-lípido

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Bioquímica

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Medición de la unión de nucleótidos a proteínas de membrana intactas y funcionales en tiempo real

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

Un ensayo de unión a proteínas de superficie celular basado en citometría de flujo para evaluar la selectividad y la especificidad de un aptámero anticanceroso

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Investigación sobre el cáncer

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified through an in vitro selection process called Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) to recognize a wide variety of targets, from small molecules to proteins and other macromolecules 2-4. Aptamers have properties that are well suited for in vivo diagnostic and/or therapeutic applications: Besides good specificity and affinity, they are easily synthesized, survive more rigorous processing conditions, they are poorly immunogenic, and their relatively small size can result in facile penetration of tissues.
Aptamers that are identified through the standard SELEX process usually comprise ~80 nucleotides (nt), since they are typically selected from nucleic acid libraries with ~40 nt long randomized regions plus fixed primer sites of ~20 nt on each side. The fixed primer sequences thus can comprise nearly ~50% of the library sequences, and therefore may positively or negatively compromise identification of aptamers in the selection process 3, although bioinformatics approaches suggest that the fixed sequences do not contribute significantly to aptamer structure after selection 5. To address these potential problems, primer sequences have been blocked by complementary oligonucleotides or switched to different sequences midway during the rounds of SELEX 6, or they have been trimmed to 6-9 nt 7, 8. Wen and Gray 9 designed a primer-free genomic SELEX method, in which the primer sequences were completely removed from the library before selection and were then regenerated to allow amplification of the selected genomic fragments. However, to employ the technique, a unique genomic library has to be constructed, which possesses limited diversity, and regeneration after rounds of selection relies on a linear reamplification step. Alternatively, efforts to circumvent problems caused by fixed primer sequences using high efficiency partitioning are met with problems regarding PCR amplification 10.
We have developed a primer-free (PF) selection method that significantly simplifies SELEX procedures and effectively eliminates primer-interference problems 11, 12. The protocols work in a straightforward manner. The central random region of the library is purified without extraneous flanking sequences and is bound to a suitable target (for example to a purified protein or complex mixtures such as cell lines). Then the bound sequences are obtained, reunited with flanking sequences, and re-amplified to generate selected sub-libraries. As an example, here we selected aptamers to S100B, a protein marker for melanoma. Binding assays showed Kd s in the 10-7 - 10-8 M range after a few rounds of selection, and we demonstrate that the aptamers function effectively in a sandwich binding format.

SELEX protocols comprise multiple rounds of selection, each of which require regeneration of bound ligands, which in turn require fixed primer sequences flanking the random library regions. These fixed primer sequences can interfere with the selection process (false positives and negatives). Here we present a primer-free protocol.

Primer Libre Selección aptámero utilizar una biblioteca de ADN al azar

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Biología

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Determinación de la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Aptamer-Based Target Detection Facilitated by a 3-Stage G-Quadruplex Isothermal Exponential Amplification Reaction

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules with signal-generation capability. For the system described herein, target recognition through an aptameric domain, Stem II of a modified hammerhead ribozyme, activates the self-cleaving ribozyme by stabilizing the initially unstructured construct. The cis-cleaving RNA acts at the junction of Stem III and Stem I, creating two cleavage products. The longer cleavage product primes an isothermal exponential amplification reaction (EXPAR) of the two similar catalytically active G-quadruplexes. Those resulting amplification products catalyze peroxidase reduction, which is coupled to the reduction of a colorimetric substrate with an output that the naked eye can detect. The 3-part system described in the present study improves detection modalities such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) by producing a visually detectable signal for indicating the presence of as low as 0.5 &#181;M theophylline in as little as 15 min.

The present protocol demonstrates the use of a fast, 3-stage, aptamer-based exponential amplification assay to detect targets. Sample preparation, signal amplification, and color development are covered to implement this system to recognize the presence of theophylline over that of caffeine.

Detección de objetivos basada en aptámeros facilitada por una reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 etapas

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules ...

Bioingeniería

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Un método para la selección de aptámeros Estructura de conmutación Aplicado a una de nanopartículas de oro ensayo colorimétrico

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

Source: Mittermaier, A. K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55959">Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates differential scanning calorimetry &#8212; a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

Calorimetría diferencial de barrido para estudiar la interacción entre el aptámero y el ligando termolábil del ADN

Source: Mittermaier, A. K., et al. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. ...