Die Autoren haben keine Bestätigungen.

1. Vorbereitung der Aptamer-Funktion Stock <ol><li> Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und lösen das Oligonukleotid (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, Sequenz aus Referenz 18) in Wasser, einer 100-uM Endkonzentration zu erreichen. </li><li> Bereiten Sie die Aptamer - Arbeitslösung durch Verdünnen des Oligonukleotid - Lager auf 200 nM mit Bindungspuffer (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2; 0,01% Tween 20). </li><li> Inkubieren Sie die Mischung für 2 min bei 90 ° C, lassen Sie sofort die Probe auf Eis abkühlen, und die Probe bei Raumtemperatur verwenden. </li></ol> 2. Herstellung der Ligand Verdünnungsreihe <ol><li> Für jeden Liganden (Adenosin-Triphosphat (ATP), Adenosindiphosphat (ADP), Adenosinmonophosphat (AMP), Adenin, Guanosin-Triphosphat (GTP), Cytosin-triphosphat (CTP), Desoxyadenosintriphosphat (dATP) und S-Adenosylmethionin (SAM) ; jeweils) 10 mM Lager, bereiten Sie einen 16-stufigen seriellen dilutiauf in 200 &amp; mgr; l Mikroreaktionsröhrchen. HINWEIS: Die Zentrifugation von Ligand Bestände für 5 min bei 14000 xg helfen können Aggregate zu entfernen. Geringes Volumen, geringe Bindungsreaktionsrohre werden empfohlen Adsorption von Molekülen an den Rohrwänden zu vermeiden. </li><li> Beginnen mit einer maximalen Konzentration von mindestens 50 mal höher ist als die geschätzte Affinität und Verringerung um 50% in jedem Verdünnungsschritt die Ligandenkonzentration. HINWEIS: Die Konzentration finder Werkzeug in die Steuerungssoftware implementiert simuliert Bindungsdaten und hilft bei der richtigen Konzentrationsbereich für die Verdünnungsreihe finden. </li><li> Füllen Sie 20 ul des Liganden Lager (10 mM) in Rohr 1. Fügen Sie 10 ul Aptamer-Bindungspuffer in Mikroreaktionsrohre 2 bis 16. </li><li> Transfer 10 ul Rohr 1 bis Rohr 2 und ordnungsgemäß durch Auf- und Abpipettieren mehrmals mischen. Übertragen Sie 10 &amp; mgr; l in die nächste Röhre und wiederholen Sie diese Verdünnung für die verbleibenden Rohre. </li><li> Entsorgen Sie die 10 ul Überschuss aus dem letzten Rohr. Vermeiden Sie bUffer Verwässerungseffekte. Der Puffer in Rohr 1 und in Röhrchen 2-16 müssen identisch sein. </li></ol> 3. Herstellung der endgültigen Reaktions Mix <ol><li> Bereiten Sie die einzelnen Bindungsreaktionen mit einem Volumen von 20 &amp; mgr; l (10 &amp; mgr; l Arbeitslösung Aptamer + 10 &amp; mgr; l des jeweiligen Liganden Verdünnung) Pipettierfehler zu minimieren. Ein Volumen von nur 4 ul reicht aus ll die Kapillare zu fi nden. </li><li> In 10 ul der 200 nM Aptamer-Arbeitslösung zu 10 &amp; mgr; l jedes Liganden Verdünnung und mischen richtig durch Auf- und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Inkubiere die Proben für 5 min bei Raumtemperatur und fi ll die Proben in Standard-Kapillaren durch die Kapillaren in die Probe eingetaucht wird. Längere Inkubationszeiten können für einige Wechselwirkungen erforderlich sein; jedoch 5 min ist ausreichend für die meisten. Berühren die Kapillaren nur an den Seiten, nicht auf dem mittleren Teil, wo die optische Messung genommen wird. </li><li> Legen Sie die Kapillaren auf the Kapillar-Fach und die MST-Gerät starten. </li></ol> 4. Starten des MST-Gerät HINWEIS: Das Gerät verfügt über zwei vorinstallierte Software-Pakete, die &#39;&#39; control &quot;Software für den technischen Aufbau der experimentellen Bedingungen und der &#39;&#39; Analyse&quot; Software für die Interpretation der erzeugten Daten. <ol><li> Vor der Platzierung der Kapillare Fach in die MST-Gerät, starten Sie die Steuerungssoftware und stellen Sie die gesamte gewünschte Temperatur von &#39;Auswahl von&#39; ermöglichen Steuerung manueller Temperatur &quot;in der &#39;&#39; Temperaturregelung&quot; Drop-Down-Menü. Einstellen der Temperatur auf 25 ° C in dieser Weise. HINWEIS: Die MST Instrumente können von 22 bis 45 ° C temperiert werden. </li><li> Warten, bis die Temperatur das erwartete Niveau zu erreichen, und legen Sie dann die Kapillare Fach in die MST-Gerät. </li><li> Stellen Sie den LED-Kanal &#39;&#39; rot &quot;für Cy5 Farbstoffen und stellen Sie die LED-Leistung ein fl uorescenc zu gewinnene Signal von 300 bis 1000 Fluoreszenzeinheiten an der MST-Gerät mit einem Standard-Sensor. 25% LED-Leistung wird in dieser Studie verwendet. HINWEIS: 6.000 bis 18.000 Fluoreszenzeinheiten für die MST mit einem hochempfindlichen Sensor empfohlen. </li></ol> 5. Kapillar-Scan <ol><li> Führen Sie eine Kapillare Scan verschiedene Qualitätsaspekte der Probe zu überprüfen, indem die Kapillare Position auf der &quot;Control&quot; Software ein und klicken auf &quot;Start Kappe scan&quot; bevor die MST-Messung starten. </li><li> Überprüfen Sie die Kapillar-Scan für Fluoreszenzverstärkung / Lösch- und Klebeeffekte (U-förmige oder abgeflachte Spitzen) in der Software. HINWEIS: Weitere Informationen über die Erkennung und Behandlung von Fluoreszenz und Klebeeffekte können in der Diskussion zu finden. </li></ol> 6. MST Mess HINWEIS: Vor der Messung MST beginnen, stellen Sie sicher, dass Effekte, Verbesserung / Löscheffekte auszuschließen kleben, oderPipettierfehler, und sicherzustellen, dass die Kapillare Scan zeigt, dass die Fluoreszenz- Signal reicht aus. Weitere Details, die Diskussion. <ol><li> Ordnen die Ligandenkonzentrationen aus der Verdünnungsreihe auf die jeweilige Kapillare Position in der &#39;&#39; control &quot;Software Betrachten der Verdünnungsschritt das Aptamer und dem Liganden zu mischen. (1: 1). </li><li> Geben Sie die höchste Konzentration an Ligand (5 mM) für kapillare # 1, wählen Sie die richtige Verdünnung (hier 1: 1), klicken Sie auf die maximale Konzentration, und verwenden Sie die Drag-Funktion, um automatisch die verbleibenden Konzentrationen in Kapillaren zuweisen # 2- 16. Die niedrigste Konzentration ist 152,6 nM. </li><li> Geben Sie die Konzentration des Fluoreszenz- Aptamer (hier 100 nM) in dem jeweiligen Abschnitt der Steuerungssoftware. </li><li> Verwenden Sie die Standardeinstellungen, die die fluoreszenz für 5 Sekunden erkennen, notieren Sie die MST für 30 Sekunden, und notieren Sie die Fluoreszenz für weitere 5 Sekunden nach der Inaktivierung des Lasers t<html> o die Rückdiffusion von Molekülen zu überwachen. </li><li> Stellen Sie die Laserleistung auf 20% in dem jeweiligen Abschnitt der Steuersoftware. ANMERKUNG: Um das beste Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten und zu unspezifischen Effekte zu vermeiden, wird eine Laserleistung von 20-40% empfohlen. In bestimmten Fällen kann eine höhere Laserleistung eine gute Trennung von ungebundenen und gebundenen Moleküle zu erhalten erforderlich. </li><li> Speichern Sie das Experiment nach den Zielordner auswählen und auf die MST Messung starten durch Drücken der &#39;&#39; Start MST Messung &quot;-Taste. HINWEIS: Die .ntp Datei im Zielordner erzeugt wird. Mit diesem Setup dauert eine Messung 10-15 min. </li><li> Wiederholen Sie die experimentellen Verfahren mindestens zweimal für eine genauere Bestimmung des Wertes 50 EC. HINWEIS: Um die technische Reproduzierbarkeit zu testen, können die gleichen Kapillaren mehrmals gescannt werden (technische Wiederholungen). </li></ol> 7. MST Datenanalyse nt &quot;&gt; Hinweis: Die Analyse - Software die Analyse von Daten über die fl y während der Messung ermöglicht die Analyse - Software , die MST Zeit Spuren und Veränderungen in der normierten Fluoreszenz- (F Norm) gegen die Ligandenkonzentration 37 aufgetragen ist .. <ol><li> Starten Sie die MST-Analyse-Software (MO.Affinity Analysis) und laden Sie die .ntp Datei aus dem Zielordner. Wählen Sie &quot;MST&quot; als Analysetyp in der Datenauswahlmenü. HINWEIS: Bei Liganden-abhängige Fluoreszenzeffekte kann die anfängliche Fluoreszenz zur Analyse ausgewählt werden. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden technischen oder biologischen Lauf (s) einer neuen Analyse per Drag-and-Drop oder über die Schaltfläche &quot;+&quot; unterhalb der jeweiligen Versuchslauf drücken. </li><li> Drücken Sie die Informationstaste unterhalb der jeweiligen Versuchslauf zu erhalten Informationen über die Eigenschaften des Experiments MST Spuren, Kapillar-Scan, Kapillar-Form, anfängliche Fluoreszenz und Bleichrate. Hinweis: Diese Rohdaten können also in späteren Schritten der Analyse überprüft werden. </li><li> die MST Spuren für die Aggregation und Fällung Effekte sichtbar, wie Beulen und Spikes einer Sichtprüfung. HINWEIS: Weitere Informationen über die Erkennung und Behandlung von Aggregationseffekten, lesen Sie die Diskussion. </li><li> die kapillare Scan und die kapillare Form Overlay für Adsorptionseffekten, sichtbar als abgeflacht oder U-förmigen Spitzen Sichtprüfung. Eine Sichtprüfung des Kapillar-Scan und die anfängliche Fluoreszenz für Fluoreszenzeffekte. Sichtprüfung für Photobleaching Auswirkungen der Bleichrate. </li><li> Wechseln Sie auf die Dosis-Wirkungs-Modus und ändern Sie die Analyse-Einstellung auf &quot;Experten&quot; -Modus indem Sie die entsprechende Taste drücken. Wählen Sie &quot;T-Jump&quot;, wie die MST Bewertungsstrategie. </li><li> Wählen Sie den &quot;Hügel&quot; Modell für die Kurve Armatur. Die Bindungsparameter werden automatisch berechnet. Normalisieren der Daten durch die jeweilige Art der Normalisierung in der &quot;vergleichen Sie die Ergebnisse&quot; Menü wählen. exportieren Sie dieDaten entweder als .xls oder .pdf. HINWEIS: Die unten stehende Tabelle der Bindungs ​​Diagramm fasst die berechneten Bindungsparameter. </li></ol>

CE und TS sind Mitarbeiter von 2bind GmbH, die biophysikalischen analytische Dienste zur Verfügung stellt. Publikationsgebühren für dieses Video-Artikel sind für die von 2bind GmbH bezahlt.

Qualitätskontrollen: Unspezifische Klebe- / Adsorption von Probenmaterial an Oberflächen sowie Aggregationseffekte, haben einen dramatischen Einfluss auf die Qualität der Affinitätsdaten. Doch nur wenige state-of-the-art Technologien bieten genaue und schnelle Möglichkeiten zu überwachen und diese Effekte zu vermeiden. MST bietet integrierte Qualitätskontrollen, die erkennen und helfen, diese Probleme zu überwinden, so dass für die schrittweise Optimierung der technischen Einrichtung. ...

Wechselwirkung zwischen Molekülen ist die Basis der Natur. Daher Wissenschaftler in vielen Bereichen der Grundlagen- und angewandten Forschung versuchen die grundlegenden Prinzipien der molekularen Wechselwirkungen verschiedener Arten zu verstehen. Micro Thermophorese (MST) können Wissenschaftler die schnelle, präzise und kosteneffiziente und qualitätskontrollierte Charakterisierung von molekularen Wechselwirkungen in Lösung durchzuführen, mit einer freien Wahl von Puffern. Es gibt bereits mehr als 1.000 Publikationen MST mit, ab 2016 allein, beschreibt verschiedene Arten von Analysen, einschließlich Bibliothek Vorführungen, Ereignis Validierungen Bindung, kompetitive Assays, und Experimente mit mehreren Bindungspartnern 1-8. Im Allgemeinen erlaubt MST die Untersuchung der klassischen Bindungsparameter wie Bindungsaffinität (pM bis Mm), Stöchiometrie und Thermodynamik, der jede Art von molekularen Wechselwirkungen. Ein großer Vorteil der MST ist die Fähigkeit, Bindungsereignisse unabhängig von der Größe der Interaktionspartner zu studieren. Auch Heraus-fordernd Wechselwirkungen zwischen kleinen Nukleinsäure-Aptamere (15-30 nt) und Ziele wie kleine Moleküle, Medikamente, Antibiotika oder Metaboliten quantifiziert werden können. Aktuelle state-of-the-art Technologien Aptamer-Target - Wechselwirkungen sind entweder im Labor intensiv und sehr komplex zu charakterisieren oder scheitern Aptamer-kleines Molekül 9,10 Wechselwirkungen zu quantifizieren. Oberflächenplasmonresonanz (SPR) -basierte Assays 11,12 und wirklich markierungsfreie kalorimetrischen Ansätze wie Isothermen Titrations - Kalorimetrie (ITC) 13-15, isokratische Elution 16, Gleichgewicht Infiltrations 17,18, in-line Sondieren 19, Gel- Shift - Assays, Stopped fl ow Fluoreszenz- Spektroskopie 20,21, Fluoreszenzanisotropiemessungen (FA) 22,23, Einzelmolekül - Fluoreszenz - Bildgebung 24,25 und Bio-Schicht - Interferometrie (BLI) 26 sind ebenfalls entweder ungenau oder nicht kompatibel mit Aptamer-kleines Molekül Wechselwirkungen. Andere principal Probleme dieser Verfahren sind eine geringe Empfindlichkeit, hohe Probenverbrauch, Immobilisation, Massentransportbeschränkungen auf Oberflächen und / oder Puffer Einschränkungen. Nur wenige dieser Technologien bieten integrierte Kontrollen für die Aggregation und Adsorption Effekte. MST stellt ein leistungsfähiges Werkzeug für Wissenschaftler , diese Einschränkung zu überwinden , um die Wechselwirkungen zwischen Aptamere und kleine Moleküle , 27-29, sowie andere Ziele, wie Proteine 30-33 zu studieren. Die Technologie beruht auf der Bewegung von Molekülen durch Temperaturgradienten. Diese gerichtete Bewegung, die so genannte &quot;Thermophorese,&quot; hängt von der Größe, der Ladung und Hydrathülle des Moleküls 34,35. Die Bindung eines Liganden an das Molekül direkt an mindestens einen dieser Parameter zu verändern, in einer veränderten thermophoretische Mobilität führt. Liganden mit kleinen Größen haben nicht erhebliche Auswirkungen in Bezug auf die Größenänderung von der ungebundenen zum gebundenen Zustand, aber sie können dr haben<html> amatic Auswirkungen auf die Hydrathülle und / oder Ladung. Die Veränderungen in der thermophoretische Bewegung der Moleküle nach der Wechselwirkung mit dem Bindungspartner ermöglicht die Quantifizierung der Grundbindungsparameter 2,7,34,36,37. Wie in 1A dargestellt ist , besteht der MST Vorrichtung eines Infrarotlasers auf die Probe innerhalb der Glaskapillaren fokussiert die gleiche Optik wie für die Fluoreszenzdetektion. Die thermophoretischer Bewegung von Proteinen über die Eigenfluoreszenz von Tryptophane 6 oder eines fluoreszierend 3,8 Interaktionspartner markiert überwacht werden kann , während der Laser einen Temperaturgradienten (AT von 2-6 ° C) herstellt. Die sich ergebende Temperaturdifferenz im Raum, &amp; Delta; T, führt zur Verarmung oder Anreicherung von Molekülen im Bereich der erhöhten Temperatur, die durch die Soret quantifiziert werden kann Koeffizienten (S T): g &quot;/&gt; c hot stellt die Konzentration in dem erwärmten Bereich, und c kalt ist die Konzentration in dem anfänglichen Kaltbereich. Wie in 1B gezeigt , um eine typische MST Versuchsergebnisse in einer MST Bewegungsprofil (Zeitverlauf), die aus verschiedenen Phasen, die durch ihre jeweiligen Zeitrahmen getrennt werden können. Die anfängliche Fluoreszenz wird in den ersten 5 s in Abwesenheit des Temperaturgradienten gemessen, um die genaue Start Fluoreszenz zu definieren und für Photobleaching oder photoenhancement zu überprüfen. Der Temperatursprung (T-Jump) repräsentiert die Phase, in der die Fluoreszenzänderungen vor thermophoretischer Bewegung. Diese anfängliche Abnahme der Fluoreszenz hängt von wärmeabhängige Veränderungen von fl uorophore Quantenausbeute. Die Thermophorese Phase folgt, in der die Fluoreszenz abnimmt (oder zunimmt) aufgrund der thermophoretische Bewegung der Moleküle, bis die Stationärzustandsverteilung erreicht wird.Die umgekehrte TJump und die gleichzeitige Rückdiffusion der fluoreszierenden Moleküle können wie in 1B angegeben beobachtet werden , nachdem der Laser ausgeschaltet ist. Um grundlegende Bindungsparameter, verschiedene Molverhältnisse der Interaktionspartner für den Zugriff werden analysiert und verglichen. Typischerweise werden 16 unterschiedliche Verhältnisse in einem MST Experiment untersucht, wohingegen der optische sichtbaren Molekül konstant gehalten wird und mit zunehmender Menge des unmarkierten Liganden zugeführt wird. Die Wechselwirkung zwischen den beiden Bindungspartner induziert Veränderungen in der Thermophorese, und somit in der normalisierten Fluoreszenz, F Norm, die wie folgt berechnet wird: <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F heiß und F kalt stellen Intensitäten fluoreszenz bei de fi nierten Zeitpunkte der MST Spuren gemittelt. Bindungsaffinitäten (K d oder EC 50 -Werte) können durch curv berechnet werdene Fitting (1C). Insgesamt ist MST ein leistungsfähiges Werkzeug molekularen Wechselwirkungen jeglicher Art zu studieren. Dieses Manuskript bietet ein Protokoll das herausfordernde Interaktion zwischen dem kleinen Molekül Adenosintriphosphat (ATP; 0,5 kDa) zu charakterisieren und die 25-nt kurze ssDNA Aptamer DH25.42 (7,9 kDa). Im Laufe des Manuskripts wird die Bindungsstelle des Aptamers an das ATP-Molekül an die Adenin-Gruppe des ATP kartiert unten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Aptamer binding buffer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescently labeled ATP aptamer</td>
			<td>IDT, Leuven, Belgium</td>
			<td ></td>
			<td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-ATTGCGGAGGAAGG-3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2383</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ADP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2754</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AMP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A2252</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adenine</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A8626</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SAM</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>A7007</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dATP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >11934511001</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td>C1506</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany&#160;</td>
			<td >G8877</td>
			<td>10 mM stock solutions stored at - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115&#160;</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-G008</td>
			<td>Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith NT.115 capillaries Standard</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td >MO-K002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf PCR tubes</td>
			<td >Eppendorf, Germany</td>
			<td >30124537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MO.affinity analysis v2.1.1</td>
			<td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaleidagraph 4.5.2</td>
			<td >Synergy Software</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

In dieser Studie wurde MST die Bindungsstelle des DNA - Aptamer DH25.42 18 an ATP zu charakterisieren aufgetragen. Im Gegensatz zu anderen Studien , die die Wechselwirkung von ATP oder ATP-nachahmt kleine Moleküle mit Proteinen zufällig markiert mit einem oder mehreren Fluorophoren 38-40 charakterisierenden umfasst diese Studie eine markierte Version des 7,9 kDa ssDNA Aptamer mit einem Cy5 - Molekül am 5&#39;Ende . Verschiedenen ATP-Derivate und verwandte Molekü...

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Kartierung der Bindungsstelle eines Aptamer auf ATP Mit Micro Thermophorese

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K Aufrufe.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Serie: Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Forschung

Biochemie

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of reactive oxygen species, and more. These fluctuations can lead to a widespread protein unfolding, aggregation, and cell death. Therefore, cells have evolved a dynamic and stress-specific network of molecular chaperones, which maintain a "healthy" proteome during stress conditions. ATP-independent chaperones constitute one major class of molecular chaperones, which serve as first-line defense molecules, protecting against protein aggregation in a stress-dependent manner. One feature these chaperones have in common is their ability to utilize structural plasticity for their stress-specific activation, recognition, and release of the misfolded client. 
In this paper, we focus on the functional and structural analysis of one such intrinsically disordered chaperone, the bacterial redox-regulated Hsp33, which protects proteins against aggregation during oxidative stress. Here, we present a toolbox of diverse techniques for studying redox-regulated chaperone activity, as well as for mapping conformational changes of the chaperone, underlying its activity. Specifically, we describe a workflow which includes the preparation of fully reduced and fully oxidized proteins, followed by an analysis of the chaperone anti-aggregation activity in vitro using light-scattering, focusing on the degree of the anti-aggregation activity and its kinetics. To overcome frequent outliers accumulated during aggregation assays, we describe the usage of Kfits, a novel graphical tool which allows easy processing of kinetic measurements. This tool can be easily applied to other types of kinetic measurements for removing outliers and fitting kinetic parameters. To correlate the function with the protein structure, we describe the setup and workflow of a structural mass spectrometry technique, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, that allows the mapping of conformational changes on the chaperone and substrate during different stages of Hsp33 activity. The same methodology can be applied to other protein-protein and protein-ligand interactions.

One of the most challenging stress conditions that organisms encounter during their lifetime involves the accumulation of oxidants. During oxidative stress, cells heavily rely on molecular chaperones. Here, we present methods used to investigate the redox-regulated anti-aggregation activity, as well as to monitor structural changes governing the chaperone function using HDX-MS.

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...