저자는 어떤 승인이 없습니다.

앱타 머는 작업 증권 1. 준비 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 100 μm의 최종 농도에 도달, 물 (참조 18에서 5-Cy5에-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, 순서) 올리고 뉴클레오티드를 녹인다. </li><li> 버퍼를 결합 200 nm의에 올리고 뉴클레오티드 주식을 희석하여 앱 타머 작업 솔루션을 준비합니다 (20 mM 트리스, 산도 7.6, 300 mM의 NaCl을 5 밀리미터의 MgCl 2, 0.01 % 트윈 20). </li><li> 90 ℃에서 2 분 동안 혼합 배양 한 샘플을 즉시 얼음에 식혀 실온에서 시료를 사용한다. </li></ol> 리간드 희석 시리즈 2. 준비 <ol><li> ) SAM (각 리간드 (아데노신 트리 포스페이트 (ATP), 아데노신 디 포스페이트 (ADP), 아데노신 모노 포스페이트 (AMP), 아데닌, 구아노 신 트리 포스페이트 (GTP), 시토신 트리 포스페이트 (CTP), 아데노신 트리 포스페이트 (dATP 존재) 및 S-아데노 실 메티오닌 10 mM의 스톡 각)는 16 단계 직렬 diluti 준비에 200 ㎕를 마이크로 반응 튜브. 참고 : 집계를 제거하는 데 도움이 될 수 14,000 XG에서 5 분 리간드 주식의 원심 분리. 낮은 볼륨, 낮은 결합 반응 튜브는 튜브 벽 분자의 흡착을 방지하는 것이 좋습니다. </li><li> 추정 친화력보다 적어도 50 배의 최대 농도로 시작하여 각 희석 단계에서 50 % 리간드 농도를 감소시킨다. 참고 : 제어 소프트웨어로 구현 농도 측정기 도구는 데이터 바인딩을 시뮬레이션하고 희석 시리즈에 적합한 농도 범위를 찾는 데 도움이됩니다. </li><li> 16 마이크로 반응 튜브에 2 앱 타머 바인딩 버퍼의 10 μl를 추가 튜브 1의 리간드 재고 (10 mM)을 20 μl를 입력합니다. </li><li> 이전 10 관 2 관 (1)의 μl의 최대 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 적절하게 혼합한다. 다음 튜브에 10 μL를 전송하고 나머지 관이 희석을 반복합니다. </li><li> 마지막 튜브에서 10 μl를 초과 폐기하십시오. 어떤 B를 피하십시오uffer 희석 효과. 튜브 1 및 튜브 2-16의 버퍼가 동일해야합니다. </li></ol> 최종 반응 믹스 3. 준비 <ol><li> 피펫 팅의 오차를 최소화하도록 각각의 결합 20 μL의 부피와 반응 (앱 타머 작업 용액 + 각 리간드 희석액 10 ㎕를 10 μL)을 준비한다. 만 4 μL의 볼륨은 모세관 LL Fi에 SUF 과학 효율적인이다. </li><li> 각 리간드 희석의 10 μL에 200 nm의 앱 타머 작업 용액 10 μl를 추가로 pipetting에 의해 여러 번 아래로 적절하게 혼합한다. </li><li> 샘플에 모세관을 담가 모세관 기준으로 샘플 LL 실온 인터넷에서 5 분간 샘플을 인큐베이션. 긴 배양 시간은 약간의 상호 작용에 대한 필요가있을 수있다; 그러나, 5 분은 대부분 적합합니다. NOT 광학 측정이 수행 될 중간 부분에 만 측에 모세 혈관을 터치합니다. </li><li> 일 상 모세 혈관을 배치전자 모세관 트레이와 MST 장치를 시작합니다. </li></ol> 4. MST 장치 시작 참고 :이 장치는 두 개의 사전 설치된 소프트웨어 패키지, 생성 된 데이터의 해석을위한 소프트웨어 &#39;&#39; &#39;&#39;분석 제어 실험 조건과의 기술적 설정을위한 소프트웨어 &#39;를 &quot;제공합니다. <ol><li> 산악 표준시 장치에 모세관 트레이를 배치하기 전에 제어 소프트웨어를 시작하고 &#39;드롭 다운 메뉴&#39; &#39;&#39;온도 조절에서 &quot;수동 온도 제어를 가능하게 &#39;선택하여 전체 원하는 온도를 조정합니다. 이 방법으로 25 ° C의 온도를 조정합니다. 참고 : MST 악기 온도 조절 45 ° C에 22에서 할 수있다. </li><li> 예상 수준에 도달하는 온도 기다린 다음 MST 장치에 모세관 트레이를 배치합니다. </li><li> Cy5에 염료은 &quot;빨간색 &#39;&#39;에 LED 채널을 설정하고 FL uorescenc 얻을 수있는 LED 전력을 조정표준 센서와 MST 장치 300 1,000 형광 단위의 전자 신호를 출력한다. 25 % LED 전원이 연구에 사용된다. 참고 : 6,000 18,000 형광 단위 고감도 센서와 MST 권장합니다. </li></ol> 5. 모세관 스캔 <ol><li> &quot;컨트롤&quot;소프트웨어에 대한 모세관의 위치를 ​​선택하고 클릭하여 샘플의 다른 품질의 측면을 확인하는 모세 혈관 검사를 수행합니다 &quot;캡 스캔을 시작&quot; 산악 표준시 측정을 시작하기 전에. </li><li> 형광 향상 / 담금질 및 소프트웨어의 고집 효과 (피크를 U 자형 또는 평평)의 모세관 스캔을 검사합니다. 참고 : 탐지 및 형광 처리 및 접착 효과에 대한 자세한 정보는 토론에서 찾을 수 있습니다. </li></ol> 6. MST 측정 참고 : MST 측정을 시작하기 전에 제외해야합니다 고집 효과, 강화 / 담금질 효과, 또는피펫 오류 및 모세관 스캔이 플라이 uorescence 신호가 SUF 과학 효율적인 있음을 나타냅니다 있는지 확인합니다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오. <ol><li> . &#39;제어&#39;소프트웨어의 각 모세관 위치로 희석 시리즈 리간드 농도 할당 앱타 머는 리간드와 혼합 희석 단계 고려 (1 : 1). </li><li> 모세관 # 1에 대한 리간드의 높은 농도 (5 mm)를 입력 올바른 희석 유형을 선택합니다 (여기서, 1 : 1), 최대 농도를 클릭하고 자동으로 모세 혈관의 나머지 농도 # 2를 할당하는 드래그 기능을 사용 16. 가장 낮은 농도는 152.6 ㎚이다. </li><li> 제어 소프트웨어의 각 부분의 FL uorescent 앱 타머 (여기서, 100 ㎚)의 농도를 입력한다. </li><li> 5 초 동안의 FL uorescence 검출의 기본 설정을 사용하여 30 초 동안 MST를 기록하고, 상기 레이저 t의 비활성화 후 상기 5 초 동안 형광을 기록<html> O 분자의 확산을 다시 모니터링한다. </li><li> 제어 소프트웨어의 각 부분에 20 %의 레이저 파워를 조정한다. 주 : 위해 최상의 신호 대 잡음비를 수신하고 비특이적 효과를 방지하기 위해서는 20 내지 40 %의 레이저 파워가 권장된다. 특정한 경우에있어서, 고출력 레이저는 비 결합 및 결합 분자의 양호한 분리를 얻기 위하여 요구 될 수있다. </li><li> 대상 폴더를 선택한 후 실험을 저장하고 &#39;시작 MST 측정 &quot;버튼을 눌러 MST 측정을 시작합니다. 주 : .ntp 파일을 대상 폴더에 생성됩니다. 이 설정을 사용하여, 하나의 측정은 10 ~ 15 분 동안 지속됩니다. </li><li> EC의 값이 50보다 정확한 판정을 위해 적어도 두 실험 절차를 반복한다. 참고 기술의 재현성을 시험하기 위해서, 동일한 모세관 스캔 할 수 수회 (기술 반복). </li></ol> 7. MST 데이터 분석 NT &quot;&gt; 주 : 분석 소프트웨어는 측정 동안 플라이에서 데이터의 분석을 가능하게 분석 소프트웨어 리간드 농도 37 대 MST 시간 추적 및 정규화 플로리다 uorescence (F 놈)의 변화를 나타내는.. <ol><li> 산악 표준시 분석 소프트웨어 (MO.Affinity 분석)를 시작하고 대상 폴더에서 .ntp 파일을로드합니다. 데이터 선택 메뉴에서 분석 유형으로 &quot;MST&quot;를 선택합니다. 주 : 리간드 의존적 형광 효과의 경우, 초기 형광 분석을 위해 선택 될 수있다. </li><li> 드래그 앤 드롭하거나 각각의 실험 실행 아래의 &quot;+&quot;버튼을 눌러 새로운 분석 각각의 기술 또는 생물학적 실행 (들)을 추가합니다. </li><li> 실험, MST 추적, 모세 혈관 검사, 모세관 모양, 초기 형광, 표백 속도의 특성에 대한 정보를 얻기 위해 각각의 실험 실행 아래 정보 버튼을 누릅니다. 참고 :이 원시 데이터 수 등그래서 분석 이후 단계에서 검사 될 수있다. </li><li> 시각적으로 볼 범프와 스파이크로 응집 및 침전 효과에 대한 MST 추적을 검사합니다. 참고 : 검색 및 통합 효과의 처리에 대한 자세한 내용은 설명을 참조하십시오. </li><li> 시각적으로 평평하게 또는 U 자 모양의 봉우리로 보이는 모세 혈관 검사 및 흡착 효과 모세관 모양 오버레이를 검사합니다. 시각적으로 모세관 검사 및 형광 효과에 대한 초기 형광을 검사합니다. 시각적 효과를 photobleaching에 대한 표백 속도를 검사합니다. </li><li> 용량 반응 모드로 전환하고, 각각의 버튼을 누름에 의해 &quot;전문가&quot;모드 분석 설정을 변경. 산악 표준시 평가 전략으로 &quot;T-점프&quot;를 선택합니다. </li><li> 곡선 Fi를 tting에 대해 &quot;힐&quot;모델을 선택합니다. 바인딩 매개 변수가 자동으로 계산됩니다. 은 &quot;결과를 비교&quot;메뉴 정규화의 각 유형을 선택하여 데이터를 정규화한다. 내보내.XLS 또는 .PDF 등 중 데이터. 참고 : 바인딩 그래프 아래의 표는 계산 된 바인딩 매개 변수를 요약 한 것입니다. </li></ol>

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품질 관리 : 비특이적 부착 / 표면에 시료 물질뿐만 아니라, 응집 효과를 흡착, 선호도 데이터의 품질에 큰 영향을 미친다. 그러나, 몇 최첨단 기술을 모니터링하고 이러한 효과를 방지하기 정확하고 빠른 옵션을 제공합니다. MST 감지하고 기술적 인 설치의 단계적 최적화를 허용, 이러한 문제를 극복하는 데 도움이 통합 된 품질 관리를 제공합니다. 응집 / 침전 효과 (단계 7.7)의 ...

분자 사이의 상호 작용은 자연의 기초가된다. 따라서, 기본 및 응용 연구의 많은 분야에서 과학자들은 서로 다른 종류의 분자 상호 작용의 기본 원리를 이해하려고합니다. 마이크로 열 영동 (MST)는 버퍼의 자유로운 선택으로, 용액에서 분자 상호 작용의 빠르고 정확한 비용 효율성 및 품질 제어 특성을 수행하는 과학자들 수 있습니다. 여러 결합 파트너 1-8으로 이벤트 유효성 검사, 경쟁 분석, 실험을 결합, 도서관 검사를 포함한 분석의 다른 종류를, 기술, 혼자 2016에서 MST를 사용하여 1,000 개 이상의 출판물이 이미 있습니다. 일반적으로, MST는 분자 상호 작용의 어떤 종류의 결합 친화 (mM의 PM), 화학 양론, 열역학, 같은 고전적인 바인딩 매개 변수에 대한 연구를 허용합니다. MST의 큰 장점은 상호 작용 파트너의 크기의 독립적 인 바인딩 이벤트를 공부할 수있는 기능입니다. 심지어 chal같은 작은 분자, 약물, 항생제, 또는 대사 산물로 같은의 작은 핵산 앱 타머 사이의 상호 작용 (NT를 15 ~ 30) 및 목표 정량화 할 수있다. 현재 최첨단 기술은 압 타머 - 대상의 상호 작용이 실험실 강렬하고 매우 복잡한 중 하나입니다 특성화 또는 앱 타머 - 작은 분자가 9,10의 상호 작용을 정량화하는 데 실패합니다. 플라즈몬 공명 (SPR)를 분석 (11, 12) 및 등온 적정 열량계 (ITC) 13 ~ 15, 등용 매 용리 16 평형 Fi를 여과에 17, 18으로 진정으로 라벨없는 열량 접근 방식을 기반 표면에 라인 19, 겔을 프로빙 분석을 이동, stopped- FL 흐름 FL uorescence 분광법 (20, 21), 형광 이방성 (FA) 22, 23, 단일 분자 FL uorescence 영상 24, 25, 및 바이오 층 간섭 (BLI) (26)는 압 타머 - 작은 분자와 부정확 또는 호환되지 않는 중 하나입니다 상호 작용. 기타 principa이러한 방법의 리터 문제는 낮은 민감도, 높은 샘플 소비, 고정, 표면에 대량 전송 제한 및 / 또는 버퍼 제한됩니다. 이러한 기술의 몇 응집 흡착 효과에 대한 통합 제어를 제공합니다. MST 과학자 단백질 30-33로서 앱 타머 및 소분자 27-29 사이의 상호 작용뿐만 아니라 다른 대상을 연구하는 이러한 한계를 극복하기위한 강력한 도구를 나타낸다. 이 기술은 온도 구배를 통해 분자의 움직임에 의존한다. 라고하는이 감독 운동 &quot;열 영동는&quot;분자 (34, 35)의 크기, 비용 및 수화 쉘에 따라 달라집니다. 분자에 대한 리간드의 결합을 직접 변경 thermophoretic 이동성 결과 이들 파라미터 중 적어도 하나를 변경한다. 작은 크기와 리간드가 결합 된 상태로 결합되지 않은에서 크기 변화의 측면에서 상당한 영향을 미칠하지 않을 수 있습니다,하지만 그들은 닥터를 가질 수 있습니다<html> 수화 쉘 및 / 또는 충전 amatic 효과. 결합 파트너와의 상호 작용 후 분자의 thermophoretic 운동의 변화는 기본 바인딩 매개 변수 2,7,34,36,37의 정량화 할 수 있습니다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, MST 장치는 형광 검출과 같은 광학 장치를 이용하여 유리 모세관 내 샘플 상에 초점 적외선 레이저로 구성된다. 레이저 온도 구배 (2-6 ℃의 ΔT)을 설정하면서 tryptophans 6 또는 형광 표지의 상호 작용 파트너의 3,8의 고유의 FL uorescence 통한 단백질의 thermophoretic 움직임 모니터링 할 수있다. 공간 ΔT에서 생성 된 온도 차이는 Soret 의해 정량화 될 수있다 고온의 영역에서 공핍 또는 분자의 축적에 이르게 COEF 효율적인 인터넷 (S T) g &quot;/&gt; C 고온 가열 영역의 농도를 나타내고, C 감기 초기 저온 영역에서의 농도이다. 도 1b는 각자의 시간 척도에 의해 분리 될 수있는 여러 단계들로 구성된 MST 운동 프로파일 (시간 추적)에서 전형적인 MST 실험 결과에 도시 된 바와 같이. 초기 형광 정확한 시작 형광을 정의하고 또는 photoenhancement photobleaching에 대해 확인하기 위해 온도 구배의 부재에서 제 5 초 단위로 측정된다. 온도 점프 (T-점프)하는 형광 변화 thermophoretic 운동 전에 위상을 나타냅니다. 형광이 초기 감소는 양자 수율 uorophore 플로리다의 열 의존적 변화에 따라 달라집니다. 열 영동 상 인해 정상 분포까지 분자의 운동 thermophoretic 형광이 감소 (또는 증가)에 도달 한 다음.레이저가 꺼진 후 그림 (b)에 나타낸 바와 같이 역 TJump와 플로리다 uorescent 분자의 수반 다시 확산 관찰 할 수있다. 기본적인 결합 매개 변수를 액세스하기 위해, 상호 작용 파트너의 상이한 몰비를 분석 및 비교된다. 광학 표시 분자가 일정하게 유지되고, 표지 된 리간드의 양의 증가와 함께 공급되는 반면, 일반적으로 16 개의 다른 비율 번 MST 실험에서 연구되었다. 두 결합 파트너 간의 상호 작용은 열 영동의 변화를 유도하고, 따라서 표준화의 FL uorescence에서는, 다음과 같이 계산된다 F 규범 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F 뜨거운 F 감기는 MST 추적의 드 Fi를 NED 시점에서 플라이 uorescence 강도 평균 나타냅니다. 결합 친화도 (K d 또는 EC 50 값) CURV 의해 계산 될 수있다E 피팅 (도 1C). 전반적으로, MST는 어떤 종류의 분자 상호 작용을 연구하는 강력한 도구입니다. 그리고 25-NT의 짧은 ssDNA를 앱 타머 DH25.42 (7.9 kDa의)이 원고는 작은 분자 아데노신 트리 포스페이트 (0.5 kDa의 ATP) 사이의 도전적인 상호 작용을 특성화하기위한 프로토콜을 제공합니다. 원고의 과정 동안, ATP 분자의 앱 타머의 결합 부위는 ATP의 아데닌 그룹에 아래로 매핑됩니다.

<table><tbody><tr><td>Aptamer binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 0.01% Tween-20</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled ATP aptamer</td><td>IDT, Leuven, Belgium</td><td></td><td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-&lt;br/&gt;ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>G8877</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Monolith NT.115&amp;nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-G008</td><td>Blue/Red Channel&lt;br/&gt; MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 capillaries Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tubes</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

본 연구에서는, MST는 ATP의 DH25.42 DNA 앱 타머 (18)의 결합 부위의 특성을 적용 하였다. ATP 또는 임의로 하나 이상의 형광 38-40 표지 단백질과 소형 분자 ATP를 흉내 낸의 상호 작용의 특성을 다른 연구와 대조적으로, 본 연구에서는 5 &#39;말단에 한 Cy5의 분자와 7.9 kDa의 ssDNA를 앱 타머에 표지 된 버전을 포함 . 다른 ATP 유도체 및 관련 분자는 다양한 위치에서 ATP ?...

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

마이크로 열 영동을 사용하여 ATP에 앱 타머의 결합 부위를 매핑

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K 조회수.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

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Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

Phthalic 산 에스테 르-바인딩 DNA Aptamer 선택, 특성, 및 전기 화학 Aptasensor 응용 프로그램

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

연구

화학

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

생화학

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

항암 압타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위한 유세포분석 기반 세포 표면 단백질 결합 분석

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

암 연구학

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified through an in vitro selection process called Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) to recognize a wide variety of targets, from small molecules to proteins and other macromolecules 2-4. Aptamers have properties that are well suited for in vivo diagnostic and/or therapeutic applications: Besides good specificity and affinity, they are easily synthesized, survive more rigorous processing conditions, they are poorly immunogenic, and their relatively small size can result in facile penetration of tissues.
Aptamers that are identified through the standard SELEX process usually comprise ~80 nucleotides (nt), since they are typically selected from nucleic acid libraries with ~40 nt long randomized regions plus fixed primer sites of ~20 nt on each side. The fixed primer sequences thus can comprise nearly ~50% of the library sequences, and therefore may positively or negatively compromise identification of aptamers in the selection process 3, although bioinformatics approaches suggest that the fixed sequences do not contribute significantly to aptamer structure after selection 5. To address these potential problems, primer sequences have been blocked by complementary oligonucleotides or switched to different sequences midway during the rounds of SELEX 6, or they have been trimmed to 6-9 nt 7, 8. Wen and Gray 9 designed a primer-free genomic SELEX method, in which the primer sequences were completely removed from the library before selection and were then regenerated to allow amplification of the selected genomic fragments. However, to employ the technique, a unique genomic library has to be constructed, which possesses limited diversity, and regeneration after rounds of selection relies on a linear reamplification step. Alternatively, efforts to circumvent problems caused by fixed primer sequences using high efficiency partitioning are met with problems regarding PCR amplification 10.
We have developed a primer-free (PF) selection method that significantly simplifies SELEX procedures and effectively eliminates primer-interference problems 11, 12. The protocols work in a straightforward manner. The central random region of the library is purified without extraneous flanking sequences and is bound to a suitable target (for example to a purified protein or complex mixtures such as cell lines). Then the bound sequences are obtained, reunited with flanking sequences, and re-amplified to generate selected sub-libraries. As an example, here we selected aptamers to S100B, a protein marker for melanoma. Binding assays showed Kd s in the 10-7 - 10-8 M range after a few rounds of selection, and we demonstrate that the aptamers function effectively in a sandwich binding format.

SELEX protocols comprise multiple rounds of selection, each of which require regeneration of bound ligands, which in turn require fixed primer sequences flanking the random library regions. These fixed primer sequences can interfere with the selection process (false positives and negatives). Here we present a primer-free protocol.

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Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

생물학

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

등온 적정 열량계를 사용하여 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성 결정

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Aptamer-Based Target Detection Facilitated by a 3-Stage G-Quadruplex Isothermal Exponential Amplification Reaction

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules with signal-generation capability. For the system described herein, target recognition through an aptameric domain, Stem II of a modified hammerhead ribozyme, activates the self-cleaving ribozyme by stabilizing the initially unstructured construct. The cis-cleaving RNA acts at the junction of Stem III and Stem I, creating two cleavage products. The longer cleavage product primes an isothermal exponential amplification reaction (EXPAR) of the two similar catalytically active G-quadruplexes. Those resulting amplification products catalyze peroxidase reduction, which is coupled to the reduction of a colorimetric substrate with an output that the naked eye can detect. The 3-part system described in the present study improves detection modalities such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) by producing a visually detectable signal for indicating the presence of as low as 0.5 &#181;M theophylline in as little as 15 min.

The present protocol demonstrates the use of a fast, 3-stage, aptamer-based exponential amplification assay to detect targets. Sample preparation, signal amplification, and color development are covered to implement this system to recognize the presence of theophylline over that of caffeine.

3단계 G-Quadruplex 등온 지수 증폭 반응에 의해 촉진되는 Aptamer 기반 표적 검출

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules ...

생체공학

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

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A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

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Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

Source: Mittermaier, A. K., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55959">Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates differential scanning calorimetry &#8212; a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

DNA Aptamer-Thermolabile Ligand 상호 작용을 연구하기 위한 시차 주사 열량계

Source: Mittermaier, A. K., et al. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. ...