Questa ricerca è stata sostenuta dal Dipartimento per i Premi Veterans Affairs Award di sviluppo professionale 1IK2BX001701, il premio CTSA UL1TR000445 dal Centro Nazionale per l&#39;Avanzamento delle Scienze Traslazionali, il National Science Foundation Award Numbers 1547757 e 1400969 e NIH concede GM05551. Il suo contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente una visione ufficiale del Centro Nazionale per l&#39;Avanzamento delle Scienze Traslazionali o degli Istituti Nazionali di Salute.

1. Espressione di S100A12 <ol><li> Trasformare le competenti BL21 DE3 con un plasmide pGEMEX-S100a12 utilizzando un protocollo di scossa termica standard 18 . Aggiungere 1 a 5 μL di plasmide a 50 μL di batteri in un tubo di microcentrifuga sul ghiaccio. Incubare per 20 min. </li><li> Scoppio di calore le cellule a 42 ° C per 30 s. </li><li> Incubare le celle sul ghiaccio per 2 min. </li><li> Aggiungere 500 μL di supporti SOC alle cellule. Incubare a 37 ° C con agitazione a 250 giri / min su un agitatore orbitale per 1 h. </li><li> Piastra 150 μL della reazione di trasformazione sul supporto LB-agar (integrato con 100 μg / mL ampicillina). Incubare per 12-16 h a 37 ° C. </li><li> Scegli una colonia. Inoculare 2 mL di LB (integrato con 100 μg / mL ampicillina). </li><li> Incubare per 4-6 h a 37 ° C su un agitatore orbitale (300 rpm). L&#39;OD 600 dovrebbe leggere tra 1-3 unità di assorbanza. </li><li> Aggiungere 500 μl di coltura d&#39;avviamento a 50 ml di autoinduzione ZYM-5052Cazione media 26 integrata con 100 μg / mL di ampicillina. Per una migliore aerazione e massima espressione, utilizzare un pallone Erlenmeyer confuso da 250 mL. Agitare (300 giri / min) per 24 h, a 37 ° C. </li><li> Trasferire la sospensione batterica in un tubo di centrifuga. Pellet le cellule per centrifugazione (4.000 xg, 10 min) a 4 ° C. </li><li> Decantare il supporto, il campione di registro e memorizzare la pasta cellulare a -80 ° C. Il campione è stabile per anni. </li></ol> 2. Purificazione di S100A12 utilizzando la cromatografia a bassa pressione <ol><li> Riposizionare le cellule in 30 mL di 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Sonicare la sospensione sul ghiaccio per lire le cellule. Usare ~ 20 W uscita, 5 s su e 5 s fuori ciclo per 5 min. </li><li> Trasferire la soluzione ai tubi centrifughi ad alta velocità. Chiarire il lisato cellulare per centrifugazione, 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante e trasferire in un bicchiere da 100 ml di polipropilene pulito. Raffreddare la soluzione posando il bicchiere sul ghiaccio. Aggiungete un agitatoreR e aggiungere lentamente 11,20 g di solfato di ammonio. Lasciare agire la soluzione su ghiaccio per altri 1 h. Questo creerà una soluzione al 60% di solfato di ammonio e precipita la maggior parte delle proteine ​​endogene di E. coli . S100A12 resterà solubile. </li><li> Centrifugare la soluzione a 4 ° C, 20.000 xg per 20 minuti per far pelliccare la proteina precipitata. </li><li> Decantare il surnatante e trasferire in tubo di dialisi (MWCO 3.500 kDa). Dializzare contro 1 L di 20 mM Tris, pH 8,0 a 4 ° C. Cambiare due volte il buffer di dialisi. Permettono 4 ore tra le modifiche. </li><li> Cianografia cromatica anionica <ol><li> Eseguire la cromatografia su un sistema a bassa pressione. La portata tipica è di 1 mL / min. </li><li> Equilibrare una colonna di Sepharose da 5 ml con 10 mi di 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Caricare la ~ 40 mL di soluzione S100A12 utilizzando la pompa di campionamento (raccogliere il flusso attraverso). </li><li> Lavare la colonna con 10 ml di 20 mM Tris, pH 8. </li><li> Sviluppare la colonna con una gradiente 0-30% (BuFfer B è 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) su 19 volumi di colonna (CV, 95 mL). Raccogliere 5 ml di frazioni. </li><li> Prendere un&#39; aliquota di 10 μl di ciascuna frazione e analizzare utilizzando MES SDS PAGE con la colorazione di Coomassie. Eseguire il gel con tensione costante (20 V / cm) per 30 min. </li><li> Frazioni di pool contenenti S100A12. S100A12 funziona a ~ 10 kDa proteina su un gel di denaturazione. </li><li> Frazioni concentrate a 5 mL utilizzando un dispositivo di ultrasuono (MWCO 10 kDa). Centrifugare a 3.000 xg per ~ 8 min. Prendi la frazione superiore. </li></ol></li><li> Cromatografia di esclusione di dimensioni <ol><li> Equilibrare la colonna S75 con 1 CV (120 mL) di 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl. </li><li> Iniettare &lt;5 mL di frazioni concentrate S100A12 (dalla cromatografia di scambio ionico). </li><li> Sviluppare la colonna con una portata di 1 mL / m su 120 mL. Raccogliere 5 ml di frazioni. </li><li> Prendere un&#39; aliquota di 10 μl di ciascuna frazione e analizzare usando SDS PAGE con la colorazione di Coomassie. Convalida l&#39;identità di proteine ​​utilizzandoWestern blot o spettrometria di massa (massa molecolare calcolata di subunità monomerica 10.575.0 Da, misurata 10575.4 Da). </li></ol></li><li> Frazioni di pool <ol><li> Misurare l&#39;assorbanza della proteina A 280 utilizzando uno spettrofotometro. Utilizzare il buffer SEC come un vuoto. Il coefficiente di estinzione calcolato per l&#39;omodimero S100A12 è di 5960 M -1 cm -1 . NOTA: Le rese tipiche sono 35-45 mg di S100A12 per 50 ml di coltura. </li><li> Aliquot S100A12 in 1,5 mL di microcentrifuga (1 mg / tubo), congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Analisi di attività antimicrobiche <ol><li> Streak H. pylori ceppo G27 su piatti triplici di agar di soia integrati con 5% di sangue di pecora (piastre agarico di sangue). Crescere 2-3 giorni a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica. </li><li> Inoculare H. pylori nel brodo Brucella integrato con 1x colesterolo. Cultura oltreScuotendo la notte (250 rpm) a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica. </li><li> Diluire H. pylori 1:10 in brodo Brucella al 50%, 50% tampone di calprotectina più 1x colesterolo e coltura in mezzo solo o integrato con 100 μM cloruro di zinco più 0, 100 o 1.000 μg / mL di S100A12 purificato. La cultura si scuota durante la notte (250 rpm) a 37 ° C in aria ambiente integrata con il 5% di anidride carbonica. </li><li> Il giorno successivo, eseguire le diluizioni e la piastra seriali sulle piastre di agar sangue. Lasciare colonie batteriche a crescere per 2-3 giorni a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica. Enumerare le unità formanti colonia per calcolare la crescita batterica in presenza o in assenza di S100A12 e / o di zinco esogeno. </li></ol>

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	<li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A8+and+S100A9:+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity,+traditional+risk+factors,+and+cardiovascular+disease.">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+(DAMP)+receptors+in+vitro+and+in+vivo.">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).</li><li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves.">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li><li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines:+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells.">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li><li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins:+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes.">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li><li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling.">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li><li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+proteins+in+cancer.">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li><li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Ca2+/Zn2++signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine.">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li><li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-associated+S100+proteins:+new+mechanisms+that+regulate+function.">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li><li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+immunity+beyond+iron:+a+role+for+manganese+and+zinc.">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li><li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+Immunity:+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface.">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li><li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages.">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).</li><li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis.">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+structural+states+of+S100A12:+A+key+to+its+functional+diversity.">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence.">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li><li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+in+health+and+disease.">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li><li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+genotypes,+host+factors,+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease.">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li><li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma.">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li><li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastric+precancerous+cascade.">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li><li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+cancer:+epidemiology+and+risk+factors.">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li><li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response.">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration.">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli.">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li><li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins.">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li><li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses.">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li><li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense,+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus.">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li><li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut.">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li><li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens.">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation.">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li><li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media.">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li><li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+calgranulin+proteins+S100A8,+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children.">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li><li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils.">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Viene presentato un protocollo efficiente sia per l&#39;espressione che per la purificazione dell&#39;uomo S100A12. Il sistema di espressione E. coli è lo strumento più comune per la produzione di proteine ​​ricombinanti, in particolare quando sono necessari quantitativi di mg per studi biochimici e biofisici. Un valorizzazione chiave della procedura qui descritta è l&#39;uso di mezzi autoinduttivi 26 che aumentano la resa della proteina purificata di un fattore di quasi trenta ri...

Le proteine ​​S100 sono una classe della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio con una varietà di funzioni 1 . Essi vengono espressi in maniera specifica per tessuti e cellule e regolano un ampio spettro di funzioni cellulari 2 , 3 . Uniche alle proteine ​​legate al calcio, le proteine ​​S100 presentano sia funzioni intracellulari che extracellulari 4 , 5 . All&#39;interno della cellula, il legame Ca 2+ induce un cambiamento conformazionale che espone una superficie idrofobica che specifica targeting partner legati alla proteina 6 . Questo meccanismo intracellulare regola processi importanti come la proliferazione cellulare, la differenziazione e il metabolismo energetico. Nell&#39;ambiente extracellulare, le proteine ​​S100 presentano due funzioni 7 . In uno, agiscono come proteine ​​del modello molecolare associate a danni (DAMP) e iniziano un pro-inflammRisposta immunitaria atorica attraverso l&#39;interazione con i recettori di riconoscimento del pattern 8 , 9 . Inoltre, diversi membri dei metalli di transizione sequenziali delle proteine ​​S100, una funzione che serve a morire di fame gli agenti patogeni microbiali in un processo chiamato immunità nutrizionale 10 , 11 . S100A12 (noto anche come calgranulina C e EN-RAGE) è altamente espresso in macrofagi e neutrofili ed è stato identificato come potenziale biomarker per le malattie infiammatorie 12 , 13 . Oltre a legare il calcio nei suoi siti EF-Hand, S100A12 presenta due siti di rilascio di metallo di transizione ad alta affinità situati alle estremità opposte dell&#39;interfaccia dimerica 14 , 15 . Ogni sito di legame è costituito da tre residui di istidina e un residuo di acido aspartico e può chelare zinco o rameSup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . Recentemente, abbiamo riportato che la fame di zinco dipendente da S100A12 è importante per la regolazione della crescita di Helicobacter pylori e l&#39;attività dei fattori di virulenza pro-infiammatoria 18 . H. pylori infetta lo stomaco di circa la metà della popolazione umana del mondo; Rendendo probabilmente uno dei patogeni batterici più riusciti 19 . L&#39;infezione con H. pylori può portare a risultati significativi della malattia gastrica, tra cui gastrite, ulcera peptica e duodenale, linfoma associato a linfoma associata alla mucosa (MALT) e adenocarcinoma gastrico invasivo (tumore dello stomaco). Il cancro allo stomaco è la causa principale della morte associata a cancro non cardiaca nel mondo e il più grande fattore di rischio associato per il cancro allo stomaco è l&#39;infezione da H. pylori . H. pylori persiste nella nicchia gastrica nonostante un robuSt rispondendo alla risposta immunitaria al patogeno sottolineando la necessità di una migliore comprensione dei meccanismi immunitari di controllo di questa infezione batterica 20 , 21 , 22 , 23 . L&#39; infiammazione associata a H. pylori è caratterizzata da una profonda infiltrazione di cellule polimorfonucleari, o neutrofili, che depositano un repertorio di proteine ​​antimicrobiche, tra cui S100A12, nel sito dell&#39;infezione 18 , 24 , 25 . Nel tentativo di comprendere il complesso dialogo tra host e agenti patogeni, abbiamo cercato di perfezionare la tecnica per purificare S100A12 e utilizzarlo per studiare l&#39;effetto antimicrobico che esercita su questo patogeno medico rilevante. Il protocollo sottostante descrive una tecnica migliorata per la purificazione del S100A12 nel suo stato biologicamente attivo; Capace di legare metalli nutrienti ad alta affiniChe li ha allontanati dai microrganismi invasori. Inoltre, i metodi sottostanti evidenziano l&#39;utilità di questa proteina come reagente critico per studiare il meccanismo in base alle quali le innate molecole antimicrobiche restringono la crescita di patogeni batterici. Le proteine ​​della famiglia S100A hanno guadagnato l&#39;apprezzamento come un importante gruppo di molecole innate del sistema immunitario che partecipano al segnalamento immunitario e alla difesa dell&#39;ospite 27 . Il più ben studiato di questi è la calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . La calprotectina è una proteina associata a neutrofili che forma un eterodimero delle sottounità S100A8 e S100A9 che lega i metalli di transizione all&#39;interfaccia dimerica 31 . La calprotectina ha dimostrato di possedere due siti di legame metallico: il sito 1 può legare Zn 2+ , Mn 2+ o Fe 2+ e il sito 2 può<html> Lega Zn 2+ 31 , 32 . Numerose relazioni hanno dimostrato che la calprotectina ha attività antimicrobiche contro diversi agenti patogeni tra cui Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli e H. pylori e che gli effetti inibitori sono dovuti all&#39;attività di chelazione metallica della calprotectina 25,28 , 29 . Il lavoro precedente ha dimostrato che la calprotectina esercita numerose attività su H. pylori, tra cui alterare la struttura lipidica A nella membrana esterna, reprimendo il sistema di secrezione cag -Type IV (che è un fattore importante della virulenza di proinfiammazione all&#39;interno di H. pylori ), inducendo la formazione del biofilm e reprimendo La crescita e la vitalità di H. pylori in modo dose-dipendenteClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . Inoltre, i test genetici e biochimici hanno rivelato l&#39;attività antibatterica della calprotectina contro H. pylori è stata in gran parte derivata dalla sua capacità di legare lo zinco nutrizionale 25 . H. pylori richiede lo zinco, come è stato determinato dalla ricerca precedente che ha utilizzato un mezzo chimicamente definito per accertare i requisiti micronutrienti per questo patogeno per crescere e proliferare 34 . Inoltre, la calprotectina era altamente abbondante nei tessuti H. pylori- infettati e associata a infiltrati neutrofili, indicando che l&#39;ospite può impiegare calprotectina come strategia antimicrobica durante l&#39;infezione e successiva infiammazione 25 , 35 . Recenti evidenze da tecniche di screening proteomiche impareggiabili suggeriscono che in condizioni in cui le specie reattive di ossigeno sono abbondanti, calprotecLa stagna subisce modificazioni post-traslazionali che alterano il sito di legame ad esa-istidina, inibendo così l&#39;attività legante del metallo della proteina 36 . Come tale, abbiamo ipotizzato che altre proteine ​​della famiglia S100A tra l&#39;ampio repertorio di queste molecole potrebbero potenzialmente agire come chelatori metallici ausiliari. Abbiamo selezionato S100A12 per ulteriori studi perché non è stato identificato nello schermo di cui sopra per la modifica post-traslatoria, ha la capacità di legare lo zinco ed è altamente abbondante nei tessuti umani derivanti da individui infetti da H. pylori . Il nostro lavoro indica che S100A12 può inibire la crescita e la vitalità di H. pylori in maniera dose-dipendente nel ceppo G27 di H. pylori e che l&#39;attività antimicrobica di questa proteina può essere invertita con l&#39;aggiunta di zinco in eccesso di nutrienti. Questo lavoro completa il nostro precedente lavoro che indica l&#39;attività antimicrobica S100A12 contro PMSS1 e 7.13 ceppi di H. pylori , dimostrando la sua vasta attività antibatterica contro numerosi isolati clinici e ceppi adattati al laboratorio di H. pylori 18 . Insieme, questi risultati confermano l&#39;importanza di S100A12 come meccanismo di controllo della crescita batterica e della proliferazione attraverso l&#39;immunità nutrizionale. Studi futuri di questa importante interazione batterica possono includere lo sfruttamento dell&#39;attività di S100A12 per ridurre il carico batterico nei tessuti dell&#39;host, o determinare il contributo di questa proteina alla segnalazione immunitaria nel contesto dell&#39;infezione da H. pylori .

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	<tbody>
		<tr>
			<td>S100A12 Expression</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL 21 (DE3) competent cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C25271</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoinduction medium components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>M65240-100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23100-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P41200-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20424-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S25150-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G22020-1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32040-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2643</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection agent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A40040-5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100A12 Purification</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start Chromatography System</td>
			<td>GE</td>
			<td>29-220-94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-5156-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-1166-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H. pylori Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Lab Supply Company</td>
			<td>BBL221261</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (250X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12531018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12

Le proteine ​​di Calgranulina sono importanti mediatori dell&#39;immunità innata e sono membri della classe S100 della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio. Alcune proteine ​​S100 hanno la capacità di legare i metalli di transizione con elevata affinità e di bloccarli in modo efficace dagli invasori di patogeni microbici in un processo chiamato &quot;immunitario nutrizionale&quot;. S100A12 (EN-RAGE) lega sia lo zinco che il rame ed è altamente abbondante nelle cellule immunitarie innate come macrofagi e neutrofili. Riconosciamo un metodo raffinato per l&#39;espressione, l&#39;arricchimento e la purificazione di S100A12 nella sua attiva configurazione metallica. L&#39;utilizzo di questa proteina in analisi della crescita batterica e della vitalità rivela che S100A12 ha un&#39;attività antimicrobica contro il patogeno batterico , Helicobacter pylori . L&#39;attività antimicrobica è basata sull&#39;attività di legame di zinco di S100A12, cheelato lo zinco nutritivo, affamando così H. pylori che richiede zinco per la crescita e proliferation.

S100A12 espressione e purificazione Una depurazione a tre fasi ha prodotto ~ 40 mg di S100A12 ricombinante da 50 ml di coltura batterica. Il primo passo era una precipitazione di solfato di ammonio di proteine ​​endogene di E. coli . Questa fase è stata seguita da una cromatografia di anion-exchange ( figura 1A ). La proteina è tracciata da una SDS-PAGE macchiata con Coomassie Bril...

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Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Qui, presentiamo un metodo per esprimere e purificare S100A12 (calgranulina C). Descriviamo un protocollo per misurare la sua attività antimicrobica contro il patogeno umano H. pylori .

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

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