2 차 구개 영상에 관한 초기 대화에 M. Douglas Benson에게 감사드립니다. 공 촛점 현미경 검사에서 이미징 조건을 조정하는 데 도움을 준 David Castaneda-Castellanos (Leica)와 Chris Rieken (Zeiss)도 인정합니다. 우리는 Lynsey Hamilton (Bitplane)에게 Imaris 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지 분석을위한 유용한 제안을 해주었습니다. 이 작품은 NIH / NIDCR R01 DE025887에 의해 재정 지원을 받았다.

모든 동물 실험은 San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee의 University of California의 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 1. 라이브 영상 미디어 준비 <ol><li> 액체 배양 배지의 제조 <ol><li> 20 % FBS (fetal bovine serum), 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙토 마이신, 200 μg / mL L- 아스 코르 빈산, 15 mM HEPES를 더베 페코 수정 이글 배지 (DMEM) / F12 미디어. 참고 : 라이브 이미징 미디어는 이미지 작성 직전에 새로 제작되었습니다. 이 매체에는 페놀 레드가 포함되어있어 오랜 시간 동안 라이브 이미지를 촬영할 때 광독성을 유발할 수 있습니다. 페놀 레드가없는 용지를 대체하면 장기 이미징을 향상시킬 수 있습니다. </li></ol></li><li> 저 융점 아가 로스 용액의 제조 <ol><li> 저 융점 아가 로스 350 mg을 오토 클레이 빙 된 증류수 10 mL에 녹여 3.5 % 저장 용액으로 만든다. </li><li> 아가로 오스 용액을 잘 섞고 70 ° C에서 항온 배양 한 후 아가로 오스를 완전히 녹입니다. </li><li> 라이브 이미징 미디어에 추가하기 전에 37 ° C 수조에서 아가로 오스 솔루션을 식히십시오. </li><li> 최종 농도 (0.6 %)를 만들기 위해 액체 라이브 이미지 미디어 5 ML에 아가로 오스 주식 솔루션 1 ML을 추가합니다. </li><li> 조기 응고를 방지하기 위해 37 ° C 수조에서 아가로 오스로 미디어를 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 라이브 영상을위한 Palate Explant 문화의 준비 <ol><li> 최근 부착 된 E14.5 보조 구개 선반의 해부 참고 : 우리의 경험에서 이미징 융합은 약간 접착 된 구개 선반으로 시작해야합니다. 이 순응은 영상화 중에 융합이 일어나지 못하게하는 체외 이식 운동을 방지합니다. <ol><li> 1x 인산 버퍼 식염수 (PBS)에 E14.5 무대 배아를 해부하고 녹색 형광 단백질 (GFP) - 표현을 선택 (에서K14-cre; ROSA26-mTmG flox ) 또는 (적색 형광 단백질) 형광 램프가 장착 된 해부 현미경을 사용하여 ( Lifeact-mRFPruby ) 양성 배아를 발현하는 RFP. 아가로 오스가없는 예열 된 라이브 이미징 배양 배지로 조직을 옮깁니다. </li><li> 배아 머리를 잘라 두 괜찮아요 5 번 집게 ( 그림 1A - C )를 사용하여 상단 뇌 영역을 제거합니다. 5 번 집게를 사용하여 배아를 잡고 다른 5 번 집게는 구개 선반 밖에서 여분의 조직을 잘라냅니다. 참고 : 미세 가위는 하나의 5 번 집게 대신에 배아 머리 (첫 번째 단계)를자를 수 있습니다. 그러나 2 번 5 번 미세 포셉은 정밀 절단을보다 잘 제어 할 수 있습니다. </li><li> 그림 1D 와 1E 와 같이 구개 선반에 손상을주지 않고 신중하게 하악을 제거하십시오. 구개를 손상시킬 가능성을 줄이려면 하악의 절개를 통해 혀를 지키십시오. f혀를 조심스럽게 제거한 후. </li><li> 하악과 혀를 제거한 후, 2 차 구개의 구강 쪽을 형광 현미경으로 검사하여 MES에서 강력한 리포터 신호를 확인합니다 ( 그림 1 M ). </li><li> 하악과 혀를 제거한 후 후뇌와 뇌간을 포함한 후부를 해부합니다 ( 그림 1F ). </li><li> 부착 된 구개 선반이있는 상악을 모두 제거하십시오 ( 그림 1 G ). </li><li> 1 차 및 2 차 구개를 손상시키지 않고 앞쪽에 윗턱 조직을 자릅니다 ( 그림 1 H 및 I ). </li><li> MES를 노출 explant의 비강 측면에 비강 격막을 제거합니다. 참고 : 이러한 해부 단계는 두 개의 2 차 구개 선반 사이의 접촉을 방해하지 않도록 세심한주의가 필요합니다. 비강 중격의 제거는다른 영역에서 백그라운드 신호를 줄이고 수직 조직 운동을 감소시켜 안정적인 이미징을 가능하게합니다 ( 그림 1 J-L ). </li><li> 구개 선반을 절개 후, 중간 선 리포터 신호를 다시 조사하여 조직 사이의 상피 층에 손상이 없는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 라이브 이미지 미디어로 문화 요리에서 입천장 explants 설정 <ol><li> 라이브 이미지 미디어를 35mm 유리 바닥 접시에 넣으십시오. </li><li> 거꾸로 공 촛점 현미경 ( 그림 1 N )과 이미징을 위해 가능한 유리 바닥에 가까운 해부 구개 선반 구강 측면을 내려 놓으십시오. </li><li> 빠른 속도로 온도를 낮추어 아가로 오스 응고를 촉진 시키거나 4 ° C에서 배양 접시를 넣으려면 배양 접시 근처의 전도성 표면에 드라이 아이스 펠렛을 놓습니다. 파라핀 삽입에 사용되는 것과 같은 차가운 판도이 단계에서 사용할 수 있습니다.tage. 참고 : 드라이 아이스를 사용할 경우 아가로 오스 배지를주의 깊게 모니터링하여 얼지 않는 매체를 방지해야합니다. </li></ol></li></ol> 3. 구개 제거술의 공 촛점 저속 영상 <ol><li> 이미징 및 데이터 수집 <ol><li> 아가로 오스가 반고체화된 후 37 ° C 배양 챔버가 장착 된 거꾸로 공 초점 현미경에 문화 요리를 탑재. 백색광 공 촛점 현미경과 셀 관찰자 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하십시오. NOTE : 우리는 CO 2 가스가없는 15 mM HEPES를 함유하는 수정 된 배지를 사용했다. </li><li> 문화 접시와 코팅 사이에 석유 젤리를 넣어 주사기를 사용하여 미디어 ( 그림 1 N )의 증발을 방지합니다. 참고 : 밤 (O / N) 배양 후 배양 접시 덮개 상단에 약간의 응축이 생기지 만 배지의 양은 바뀌지 않으므로 석유 젤리가 배지가 증발하는 것을 방지합니다. </li><li> 저배율 대물 렌즈 (10 배)로 관심 부위를 찾고 저속 라이브 영상을 위해 고배율 대물 렌즈 (3 배 디지털 줌 또는 40 배 대물 렌즈)를 사용하십시오. 참고 : 해부 된 2 차 구개 선반은 평평하지 않습니다. 2 차 미각은 구부러진 구조이기 때문에 동일한 평면에서 전체 MES를 이미지화하는 것을 어렵게 만듭니다. 저배율 (10x) 영상은 전체 구개 영상을 허용 할 수 있지만 40x 대물 렌즈는 더 깊은 영상 자세를 제공하여 더 깊은 Z 위치의 상세한 세포 움직임을 검사합니다. 가운데 구개 영역에서 곡률이 높습니다. 앞뒤 구개는 중간 구개에 비해 상대적으로 평평합니다. 가장 큰 곡률의 영역을 피하기 위해 종종 2 차 구개의 중간 전방을 향해 이미지를 만듭니다. </li><li> 적절한 레이저 여기 (GFP의 경우 488 nm 및 RFP의 경우 532/561 nm)를 사용하여 16-24 h 동안 5 μm의 각 단계로 여러 Z 스택을 스캔합니다 ( 그림 2 ). 참고 : 잠재적 인 광독성을 줄이려면 최소한의 레이저 출력과 노출 시간을 사용하십시오. 이것은 특히 멀티 컬러 이미징의 경우에 중요합니다. membraneTomato (mT)에는 552 nm 레이저 파워의 22 %, membraneGFP (mG)에는 495 nm 레이저 파워의 30 %, membraneRFP는 561 nm 레이저 파워의 25 %를 사용하십시오. 평균 노출 시간은 550ms입니다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포 추적 및 정량 분석을 수행하십시오. </li></ol></li></ol> 4. 데이터 이미지 분석 참고 : 여기, Imaris가 사용되었습니다. ImageJ 또는 Volocity 소프트웨어 패키지를 사용하여 유사한 데이터 분석을 수행 할 수도 있습니다. <ol><li> 이미지 시퀀스에서 3 차원 (3D) 서페이스를 렌더링합니다. 참고 :이 섹션에서는 멤브레인 GFP 신호로 생성 된 동영상에서 서페이스를 생성 할 수 있습니다. <ol><li> 편집 | 디스플레이 조정을 표시 하고 히스토그램 슬라이더를 사용하여 멤브레인 신호가 투명하게되도록 신호 강도를 조정합니다영화의 길이를 밖으로 (그림 3 A). </li><li> 이미지를 사용하여 표백 한 신호를 수정하십시오. 가공 | 감쇠 보정 . Intensity Front 및 Intensity Back 값을 조정하여 멤브레인 신호가 영화 전체 길이에 걸쳐 선명하게 표시되도록합니다. 이 값을 설정할 때 약간의 시행 착오가 필요할 수 있습니다. 참고 : Intensity Back (Deeper Z 위치) 값은 제한된 레이저 침투로 인해 Intensity Front (표면 Z 위치) 값보다 작습니다. 따라서이 값을 변경하여 Z 시리즈에서 신호 강도를 표준화 할 수도 있습니다. 표백 보정을 달성하기 위해 두 값을 모두 조정할 수 있습니다. 감쇠 보정도 발광 감쇄 보정 (19)라고한다. </li><li> 멤브레인 신호에서 서페이스를 생성하려면 Surpass | 표면 , 소스 채널 및 임계 값 유형 (절대 강도)을 선택하고 알고리즘 설정에서강의하다 관심 영역 만 분할 마지막으로 전체 이미지를 처리 한 다음 앞으로 화살표를 클릭합니다. 생성 된 표면이 형광 신호를 반영하는지 확인하면서 앞으로 화살표를 계속 누르고 (기본 설정을 사용하거나 표면적 세부 수준 및 임계 값 방법을 시행 착오로 지정). 관심 영역을 지정하려면 X, Y, Z 위치를 자르기하여 렌더링 할 영역과 시간을 선택하십시오. 참고 : 선택 최종적으로 전체 이미지 를 조정하여 조정 및 임계 값이 전체 영화에 적용됩니다. </li><li> 앞으로 화살표 버튼을 다시 클릭하여 서페이스를 생성합니다. 멤브레인 신호에 해당하는 Filters 의 히스토그램을 변경하여 임계 값을 조정하십시오. </li><li> 서페이스가 생성 된 후 서페이스 / 설정에서 서페이스를 선택하여 서페이스 신호를 시각화하고 double forw를 밀고 서페이스 생성 프로세스를 마칩니다.ARD 화살표 버튼 (도 3 B). </li><li> 표면으로 이동 | 편집 을 클릭하고 마스크 속성 에서 모두 마스크를 클릭하여 마스크 된 채널 이미지를 생성합니다. </li><li> 확인을 클릭하면 마스크 채널 창이 자동으로 열립니다. GFP 채널을 선택하고 서페이스 외부의 보셀을 최대 신호 강도 값 ( 편집 | 디스플레이 조정에 있음 )으로 설정하고 표면 안의 보셀을 최소 GFP 강도 값 ( 편집 | 디스플레이 조정 ) 마스크 설정 에서 멤브레인 신호의 마스크를 생성합니다. </li><li> 멤브레인 신호의 마스크가 볼륨 보기에 표시되므로 이미지 처리 | 대비 변경 | 반전 ( 그림 3 C ). </li></ol></li><li> 거꾸로 된 표면 이미지에서 스폿 감지. 참고 :이 섹션에서는 각 셀의 가운데가고유 한 지점으로 표시되고 시공간을 추적합니다. <ol><li> 능가 장면 선택 | 명소 | 만들기 ; 알고리즘 설정 에서 관심 영역 만 세그먼트로 구분하고 전체 이미지 처리를 마침내 하고 시간 경과에 따라 추적 점을 선택하십시오 . </li><li> 앞으로 화살표를 클릭하고 관심 지역을 지정하십시오; 지역 및 시간을 선택하여 관광 명소를 추적하십시오. 앞으로 화살표를 계속 누르고 소스 채널로 마스킹 된 채널을 선택하고 스폿의 추정 된 XY 지름을 결정합니다. </li><li> 앞으로 화살표 버튼을 클릭하면 필터 창이 자동으로 열립니다. 히스토그램의 값을 변경하여 각 셀의 중앙에 단일 스폿을 생성함으로써 스폿 감지 임계 값을 조정하십시오 ( 그림 3 D ). </li><li> 앞으로 화살표 버튼을 다시 클릭하면 알고리즘 창이 열리 며, 자동 회귀 모션 추적 모델 20을 선택하고 최대 추적 di를 지정하십시오.자세 및 짧은 간격으로 불연속이되는 트랙을 연결하는 데 필요한 최대 간격 크기입니다. </li><li> 앞으로 화살표 버튼을 다시 클릭하면 필터 창이 열리므로 모든 셀이 추적되도록 히스토그램을 조정하여 트랙 지속 시간 임계 값을 설정하십시오. 이중 앞으로 화살표 버튼을 클릭하면 스폿 감지가 완료됩니다. </li><li> 조직 표류를 수정하려면 Spot | Track Editor 를 선택하고 Correct Drift를 선택 하십시오 . 알고리즘 창이 자동으로 열립니다. Translational drift, 전체 결과 포함 및 오브젝트 위치 정정을 선택하십시오 . </li></ol></li><li> 정량 분석을위한 유리한 플롯 생성. 참고 :이 프로그램의 분산 형 (Scatterplot)은 여러 객체로 구성된 다차원 (X, Y, Z, 색상 및 크기) 그래프를 생성하는 도구입니다. 이 플롯은 시간이 지남에 따라 많은 셀 이동의 경향을 보는 데 유용합니다. <ol><li> 셀 추적 데이터의 2D 또는 3D 플롯 만들기Vantage-New Vantage 플롯 메뉴를 추가 합니다 ( 그림 3 E 및 3F ). </li><li> 볼륨 또는 스폿 선택 및 생성 / 카테고리 및 플롯 유형 선택 </li><li> 다른 Vantage 그래프를 생성하려면 Plot Values 를 조정하십시오. </li><li> 스냅 샷 기능을 사용하여 그래프를 내 보냅니다 . 참고 : 통계 데이터는 Plot Numbers Area |를 클릭하여 추가 정량 분석을위한 스프레드 시트로 내보낼 수도 있습니다. 저장하십시오 . </li></ol></li></ol>

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3D 장기 explant 문화와 조직 morphogenesis의 라이브 이미징 고정 조직 섹션의 기존 얼룩 분석에 표시 할 수없는 세포 프로세스에 관한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다. 생쥐의 배아 이차 배뇨의 생체 외편 배양 배지를 사용하여 우리는 상피 융합과 세포 압출을 포함하는 구개 융합의 새로운 메커니즘을 제안하기 위해 몇 가지 흥미로운 세포 행동을 관찰했다. 이러한 유?...

조직 융합은 여러 장기의 발달에 중요한 단계입니다. 갈라진 입술과 입천장, 척추이 분증과 심장 기형과 같은 주요 인간의 선천적 결손은 조직 융합의 결함으로 생길 수 있습니다 1 . 마우스 2 차 구개 융합은 개발 2 , 3 , 4 에서 조직 융합을 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 확인하기 위해 광범위하게 연구되었습니다. 마우스에서 2 차 구개 발달은 E11.5에서 시작하여 양측 상악골의 각 단계에서 2 차 구개 선반이 형성됩니다. 구개 선반의 초기 성장은 대략 E14.0까지 혀를 따라 수직적으로 발생하며, 이때 구개 선반은 혀 위에서 수평으로 상승합니다. medially-directed growth는 정중선 epitheli를 형성하면서, 두 개의 구개 선반의 apposing epithelia 사이의 물리적 접촉을 가져온다E14.5에서 MES (al seam). 중간 엽 합병과 E15.5에 의한 완전히 융합 된 2 차 구개의 발생을 허용하기 위해 중간 구개 선반 사이에서 중간 MES를 제거해야합니다 3 . 공유 상피 MES 세포층이 2 개의 분리 된 구개 선반 사이에 형성되고,이어서 중간 엽의 confluency를 달성하기 위해 제거되는 방법은 구개 발달에서 중심적인 문제였다. 마우스 histological 및 전자 현미경 (EM) 연구, explant 문화 연구 및 기능 마우스 유전학 실험을 바탕으로, 몇 가지 기본적인 세포 행동이 과정에 연루되었습니다. 각 선반 구개의 내측 가장자리 상피에서 MEE Filopodia 형 돌기는 공유 단일 MES 6,7 이러한 상피 세포의 인터이어서 초기 접촉 (5, 6)을 용이하게한다. 결과 공유 MES 제거세 가지 비 독점적 인 메커니즘으로 진행하도록 제안되었습니다. 조직 학적 관찰과 중요한 염료로 추적 체외 계보를 사용하는 초기 연구는 MES는 MES 세포의 중간 엽 전환 (EMT)로 상피에 의해 제거 될 수 있습니다 8, 9,하지만 최근, 상피 세포의 유전 적 혈통 추적이에 대한 불확실성을 제기했다고 표시 palatal shelf mesenchyme 10 , 11 , 12 에 대한 상피 세포의 장기적인 기여. 현저한 수의 세포 사멸 세포와 적절한 미각 융합을 거치지 못하는 일부 돌연변이 체에서의 세포 수 감소는 세포 사멸이 MES 용해 2 , 3 의 주요 동인이 될 수 있다는 생각으로 이어진다. 마지막으로, 점진적 시점에서 상피 표지 및 정적 관찰을 포함하는 연구에 기초하여, MES 세포구강 및 전후 치수 11 , 13 에서 이동하는 것이 제안되었지만, 이러한 동적 세포 행동은 초기에 생 구개 조직에서 관찰 할 수 없기 때문에 미확인이었다. 최근 우리는 구강 구강 선별의 공 촛점 라이브 영상과 형광 라벨링의 마우스 유전자 방법을 결합한 새로운 라이브 이미징 방법론을 개발함으로써 이러한 행동을 직접 관찰 할 수있었습니다. 첫째, 구개 융합 동안 구개 상피 세포의 동적 세포 행동을 시각화하기 위해, 우리는 Keratin14-CRE 마우스 14, 15 ROSA26 - mTmG flox 마우스를 교차하여 상피 별 기자 마우스를 생성합니다. 결과 배아의 구개 explant 문화의 공 촛점 라이브 이미징 일부 이전에 제안 된 세포 행동을 확인하고 융합 과정 6 에서 새로운 이벤트를 확인 </sup&gt;. 상피 세포 막 돌출부는 초기 세포 - 세포 접촉에 이어 세포 삽입 및 구강 세포 변위에 의한 상피 수렴이 뒤 따른다. 특히, 우리는 또한 세포 압출, 상피 항상성에 중요한 역할을하는 것으로보고 프로세스를 발견, 마우스 차 구개 융합 (6), (16)를 운전하는 주요 메커니즘이었다. 이 이미징 방법은 다른 기자 회선과 함께 사용할 수 있습니다. 우리는 융합 과정에서 액틴 세포 골격 역학을 검사하기 위해 Lifeact-mRFPruby 형질 전환 마우스 17 , 18 을 사용했습니다. 다른 기자는 또한 구개 융합의 다른 특정 측면을 관찰하는 데 사용할 수 있으며이 방법은 이미징 요구 및 현미경 가용성에 따라 공 촛점 현미경 검사 또는 회전 디스크 공 촛점 현미경 검사에 맞게 조정할 수 있습니다. 생체 영상은 발달 생물학에서 핵심적인 접근 방법이되고 있습니다. 이상적 상대cularly, craniofacial morphogenesis는 복잡하고 얼굴에 영향을 미치는 인간의 선천적 결함은 일반적입니다. 이 공 촛점 라이브 이미징 방법은 인간의 craniofacial 이상의 기원뿐만 아니라 근본적인 기본 발달 메커니즘의 향상된 이해를 활성화하는 데 도움이됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

2 차 구개 선반이 융합되어 2 차 구개를 형성하는 것은 포유 동물의 발달 과정에서 중요한 과정이며, 그 파열로 인해 인간의 공통 선천성 기형 인 2 차 구개가 생길 수 있습니다. 이차 미각 융합은 광범위하게 연구되어이 과정을 중재 할 수있는 몇 가지 제안 된 세포 메커니즘을 유도한다. 그러나, 이러한 연구는 개발 도중 또는 고정 된 시점에서 분석 된 고정 된 체외 이식편 배양에서 진보적 인 시점에서 고정 배아 조직에서 주로 수행되었다. 정적 분석은 미각 융합과 같은 동적 인 형태 발생 과정의 분석과 어떤 유형의 동적 세포 행동이 구개 융합을 중재 하는지를 불완전하게 이해하는 데에는 한계가있다. 여기 우리는 마우스 배아에서 생체 내 2 차 구개 융합의 라이브 이미징 프로토콜을 설명합니다. 구개 융합의 세포 행동을 조사하기 위해 상피 특이 적 Keratin14 -cre를 사용하여 ROS의 구개 상피 세포를 표지 하였다A26-mTmG flox 기자 배아. 섬유질 악틴을 시각화하기 위해 Lifeact-mRFPruby 리포터 마우스를 사용했습니다. 이차 구개 융합의 라이브 영상은 배아 일 (E) 14.5 단계 배아의 최근 부착 2 차 구개 선반을 해부하고 거꾸로 공 촛점 현미경으로 이미징을 활성화하기 위해 유리 바닥 접시에 아가로 오스 함유 미디어에서 배양하여 수행되었습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 2 차 구개 융합 동안 다양한 새로운 세포 행동을 발견했습니다. 공간과 시간에 어떻게 구별되는 세포 행동이 조정되는지에 대한 감사는 이러한 동적 형태 형성 과정에 대한 우리의 이해에 크게 기여한다. 이 프로토콜은 돌연변이 마우스 라인, 또는 두 번째 구개 융합이 제어되는 방법에 대한 이해를 진전시키기 위해 약리학 적 억제제로 치료 한 배양 물에 적용 할 수 있습니다.

구개 제거 (explant) 배양의 라이브 영상으로 미각 융합을 매개하는 여러 세포 과정이 밝혀졌습니다 6 . 두 개의 상피 세포 사이의 초기 접촉은 막 돌출부에 의해 이루어진다 ( 그림 2 B-2E ). 두 개의 상피 세포가 만났을 때 상피 수렴을 통해 통합 된 단일 세포층 MES를 만들기 위해 인터 셀 레이션 (intercalation)을 거친 다중 세?...

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Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

여기, 우리는 공 촛점 현미경을 사용하여 마우스 보조 입천장 융합의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 형광 기자 마우스 라인과 기계적 통찰력을위한 경로 억제제와 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 발달 시스템의 라이브 이미징에 적용 할 수 있습니다.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

live-imaging-of-mouse-secondary-palate-fusion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K 조회수.  University of California San Francisco.  여기, 우리는 공 촛점 현미경을 사용하여 마우스 보조 입천장 융합의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 형광 기자 마우스 라인과 기계적 통찰력을위한 경로 억제제와 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 발달 시스템의 라이브 이미징에 적용 할 수 있습니다. 

비디오: Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

연구

발생학

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

라이브 영상에 대한 성숙한 근섬유의 체외 분화

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

애기 장대 꽃 개발의 공 촛점 이미징 라이브

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

초파리 배아에서 근육 수축의 라이브 이미징 및 분석

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Micro-CT 화상 진찰을 위한 성인 및 초기 산후 마우스 폐의 혈관 주조

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...