الكتاب يود أن يشكر أعضاء متعدية الجينوميات المجموعة وكاثرين ي هانسون للتغذية المرتدة والتحسينات التي أدخلت على هذا البروتوكول. نفذ هذا المشروع بمنحه بحثية SAF2015-64500 آر، الذي يشمل "صناديق التنمية الإقليمية الأوروبية" ومنحته وزارة دي ايكونوميا y كومبيتيتيفيداد R.A.

1-التثبيت وتضمينها الراتنج
<ol><li>تخدير الذباب مع ثاني أكسيد الكربون (CO2) أو عن طريق استخدام كتلة جليد في انخفاض درجة حرارة الجسم. استخدام مجهر تشريح (مع انخفاض التكبير لرؤية الطاير كاملة) ومقص لإزالة الساقين والرأس وأجنحة الجزء الطرفي من البطن لتسهيل تغلغل مثبت. المعالجة الدقيقة للذبائح غير مطلوب في هذه الخطوة لتفادي تشوه الصدر. ملاحظة: تبدأ مع الذباب على الأقل 12 في النمط الوراثي لضمان وجود عدد كاف من الأفراد المجهزة بشكل صحيح في نهاية الإجراء.</li>
	<li>نقل الجثث إلى أنبوب 1.5 مل على الجليد (وضع حد أقصى للأفراد 6 في أنبوب) التي تحتوي على ميليلتر 200 من الحل 1. ملاحظة: لا يمكن أن تظل الذبائح في الحل 1 لأكثر من 20 دقيقة.<ol>
<li>لحل 1، خلط المكونات في هذه النسب وحدة التخزين: ¼ 4% بارافورمالدهيد ¼ 8 ٪ glutaraldehyde و ¼ م 0.2 غ،2هبو4 و NaH 0.2 M ¼2ص4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إضافة 200 ميليلتر للحل 2 واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.<ol>
<li>الحل 2: ميكس الحل 1 و أوسو4 بنسبة 1:1 (v/v). تنبيه: أوسو4 بالغة السمية. معالجته في غطاء دخان باتخاذ التدابير المناسبة في مجال السلامة والتخلص منها.</li>
	</ol>
</li>
	<li>قم بإزالة جميع السائل. إضافة 200 ميليلتر للحل 2 واحتضان على الجليد ح 1-2.</li>
	<li>إزالة الحل ويذوي العينات من خلال سلسلة إيثانول متدرج كما يلي: مرة في 30%، 50%، 70%، 90%، ومرتين في الإيثانول المطلقة؛ كل 5 دقائق. أضف 1 مل إيثانول لتغطية العينات. ملاحظة: حالما يتم وضع الأنسجة في الإيثانول 90%، يمكن تنفيذ الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>احتضان كل حضانة العينات مرتين في أكسيد البروبيلين لمدة 10 دقائق. تنبيه: أكسيد البروبيلين السامة، واستخدامها في غطاء دخان.</li>
	<li>تحل محل أكسيد البروبيلين خليط 1:1 (v/v) من أكسيد البروبيلين وراتنج الإيبوكسي واحتضان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. تنبيه: الراتنج بالغة السمية في حالة سائلة. الراتنج متاح كمجموعة من أربعة عناصر (ألف، باء، جيم ودال).<ol>
<li>راتنج الإيبوكسي، إضافة في كوب المتاح ز 54 من الراتنج (A)، ز 44.5 من مقوى 2.5 g مسرع (ج) و 10 غم من الملدنات (ب) (د). الجمع بين جميع المكونات الراتنج في غطاء دخان. تخزين الراتنج في مختبرين في-20 درجة مئوية (لمدة تصل إلى 6 أشهر) أو في-80 درجة مئوية (لعدة سنوات).</li>
		<li>لتجاهل الراتنج، خبز على 70 درجة مئوية ح 24 لأن راتنج الصلبة غير السامة. تجاهل جميع الحلول السابقة في مجموعة المعادن الثقيلة ووفقا للإجراءات الدولية المناسبة، لأن الحلول يمكن أن تحتوي على آثار أوسو4-
</li>
	</ol>
</li>
	<li>محل الخليط السابق مع الراتنج 100%، واحتضان هذه العينات ح 4.</li>
	<li>نقل الجثث إلى قوالب بلاستيكية تحتوي على راتنج جديد (الذبيحة واحد في كل بئر من العفن). استخدام عصا خشبية شحذ أو إبرة لنقل وتوجيه الذبائح في الآبار وترك الراتنج بلمرة بين عشية وضحاها في فرن باستور في 70 درجة مئوية. ملاحظة: لضمان التوجه المناسب للذبائح للتشذيب الخلفي وتمزيقها، الذبائح ينبغي أن يكون الكذب على الجانب الطويل، مع الجزء الأمامي من الذبيحة قريب جداً من حافة البئر.</li>
</ol>2-قص وتقطيع كتل
<ol><li>إزالة كتل الراتنج مبلمرة من القوالب. استخدام شفرات الحلاقة لتقليم بعيداً من الراتنج وشكل شكل المنحرف المحيطة بالذبيحة وإعطاء التوجيه المناسب في مبضع. بدء تقطيع جميع الذبائح بعد خياطة عرضية للحصول على نتائج قابلة للمقارنة. ملاحظة: يجب أن يكون القسم عمودي على محور الصورة دلمس تقليم العينة بشكل صحيح ( الشكل 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> الشكل 3 . مقاطع دورسوفينترال من ثوراسيس الكبار جزءا لا يتجزأ من الراتنج من ضمور Myotonic نموذج الذباب. في (أ)، لم يكن تشذيب العينة الصحيحة حسب القسم في الجزء الأيسر الظهرية الصورة ليست تماما مستعرضاً للعضلات. نتيجة لذلك، يبدو أن حزم العضلات الثلاث على الجانب الأيمن العلوي أكبر من تلك التي في الجانب الأيسر. يؤدي هذا الخطأ في المبالغة في منطقة العضلات. (ب) قسم من كتلة راتنج المشذبة بشكل صحيح. شريط الحجم: 200 ميكرومتر.
<ol><li>قص 1.5 ميكرومتر أبواب سميكة مع أولتراميكروتومي ونقل المقاطع إلى قطرات الماء عبر الشرائح مهيلم.<ol>
<li>الحصول على المقاطع من الجزء ميسوثوراكس لجميع العينات للحصول على نتائج قابلة للمقارنة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ضع الشرائح التي تحتوي على الأقسام المتعلقة بكتلة تدفئة في 70-80 درجة مئوية حتى يتبخر ح2س. عند هذه النقطة، يمكن ملاحظة العينات مع التباين4 أوسو (الشكل 4 أ).</li>
</ol>3-تلوين الأقسام IFM
<ol><li>تغطية المقاطع بما يكفي تولويدين الأزرق لما يقرب من 30 ثانية على كتلة التدفئة.<ol>
<li>لحل تولويدين الأزرق، حل 1% تولويدين الأزرق و 1% من الحفر في ح2o.</li>
	</ol>
</li>
	<li>شطف مع ح2س وترك الشرائح على طبق دافئ يتبخر الماء. كرر تلطيخ مع تولويدين الأزرق إذا كان التباين يجب أن يكون تعزيز (الشكل 4 باء).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> الشكل 4 . مقاطع دورسوفينترال من ثوراسيس الكبار جزءا لا يتجزأ من الراتنج مع تباين مختلفة ستينينجس- كلا الفريقين تظهر صور ذباب نموذج DM1 التي تتغذى على Abp1 كما هو الحال في 2D الشكل. (أ) صورة مقطع مع التباين4 أوسو. (ب) قسم ملطخة تولويدين الأزرق يسمح التصور أفضل من حزم العضلات. شريط الحجم: 200 ميكرومتر.
4-تركيب أبواب IFM
<ol><li>الجاف للشرائح مع كتلة التدفئة حتى يتبخر ح2س.</li>
	<li>وضع قطرات 1 أو 2 من المتوسطة المتصاعدة على الأقسام ووضع ساترة. تنبيه: القيام بهذه الخطوة في غطاء دخان سبب السمية المتوسطة المتصاعدة.</li>
</ol>5-اقتناء الصور وتحديدها كمياً من ناحية العضلات
<ol><li>أن الصور في التكبير المنخفض حتى مجموعة كاملة من العضلات DLM في التركيز. ونحن عادة استخدام 10 X.<ol>
<li>لإجراء تحليل إحصائي اتخاذ صور المسلسل على الأقل 5 في الطيران وتحليل الذباب 5 على الأقل من كل مجموعة تجريبية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حدد الصورة التي تحتوي على عضلات كاملة (الشكل 5A). فحص المحور أو التوجه للقسم وتجاهل العينات مع التوجه غير المناسب، الذي سوف يشوه النتائج (مقارنة الأرقام 3A/3B للتمييز بين شدة والمقاطع الموجهة جيدا، على التوالي).</li>
	<li>استخدام برنامج إيماجيج لتحديد منطقة (بالبكسل) التي تحتوي على فقط دلمس (الشكل 5A/5B). للمقارنة بين مختلف المجموعات التجريبية، سيكون مجال مرجعي لاستخدامها دائماً الطاير مع عضلات أكبر. في كل الصور من الأنماط الجينية المختلفة لمقارنة، حدد منطقة تحتوي على دلمس أبعاد متساوية إلى منطقة مرجعية (الشكل 5 (ب)).</li>
	<li>بيناريزي الصور باستخدام الأمر صورة-ي: عملية/ثنائي/جعل ثنائي وحذف مناطق أو وحدات البكسل التي لا تتوافق مع العضلات للفائدة (الشكل 5).<ol>
<li>في الحالة التي تظهر البقع السوداء أرتيفاكتوال في مناطق أخرى عدا العضلات، حذفها بواسطة الأمر أدوات الرسم وحدد رمز الممحاة.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> الشكل 5 . صورة إجراء تحليل لتحديد منطقة العضلات. (A) الفرع مستعرضة من ضمور Myotonic نوع 1 نموذج يطير الصدر مع مستطيل تحتوي على DLM. (ب) المحدد من المنطقة مع عضلات الطيران غير المباشر فقط والأمعاء (*). (ج) بيناريزيد الصورة. المناطق السوداء تتوافق مع العضلات للفائدة. وقد محيت الأمعاء التقدير الكمي دقيق لمنطقة العضلات. شريط الحجم: 200 ميكرومتر.
<ol start="5"><li>تقدير النسبة المئوية المقابلة لانسجة العضلات (بكسل سوداء) مجموع مع الأمر بكسل: تحليل/القياس وحدد الخيار منطقة الكسر. هذه النسبة المئوية لمساحة يتم تقدير كتلة العضلات DLM كل ذبابة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+Drosophila+Development.">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium.">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li><li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications.">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+Dystrophy+Type+1.">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li><li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model.">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind,+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li><li>Garc&#237;a-L&#243;pez, A., Llamus&#237;, B., Orz&#225;ez, M., P&#233;rez-Pay&#225;, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models.">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li><li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature.">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223 (2014).</li></ol>

وأعلن لا تضارب في المصالح.

وقد ثبت أن melanogaster المورفولوجية هو نموذج مفيد لدراسة الأمراض العصبية العضلية البشرية7،10،11، بما في ذلك "ضمور ميوتونيك"، التي تتميز بمظهر ضمور العضلات. البروتوكول المعروضة هنا أداة مفيدة للتحديد الكمي لضمور العضلات الناجم عن ظهور أو ت?...

الصدر ذبابة الفاكهة يحتوي على فئتين مختلفتين من عضلات الطيران، ومتميزة وظيفيا وفسيولوجيا وتشريحيا. هذه العضلات: التحكم في عضلات الرحلات غير المباشرة (IFM)، التي تتألف من طولية دورسو (DLM) والعضلات دورسو البطني (طبيب بيطري) (الشكل 1)، والرحلة متزامن العضلات1،2. هذه العضلات معا توليد الطاقة الميكانيكية المرتفعة المطلوبة للرحلة. الحجم والتوزيع والتصرف إيفمس rostro والذيلية السماح اتجاه سهل ل تقطيع مستعرضة3 (الشكل 2A). ولهذا السبب، اخترنا هذه العضلات لدراسة ضمور العضلات في melanogaster المورفولوجية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> رقم 1. الرسم التخطيطي للصدر ذبابة الفاكهة عرض عضلات الطيران غير المباشر الترتيب (إيفمس). (يسار) يمثل وجهة نظر أفقي و (يمين) مقطع عرضي من القفص الصدري. إيفمس تتكون من عضلات دورسو-طولية (DLM) (باللون الأحمر) والعضلات دورسو-البطني (طبيب بيطري) (باللون الأخضر).
الحفاظ على بنية الأنسجة والسيطرة على اتجاه محور دورسو البطني من أقسام نسيجية ذات الأهمية الحاسمة لضمان التقييم السليم لمنطقة عضلة مستعرضة. للحفاظ على بنية العضلات قمنا باستخدام خليط تثبيت معدلة من توملينسون et al. 4 . وعلاوة على ذلك، نظراً لعضلات الأنسجة الداخلية، هي مشكلة كتثبيت لا يمكن اختراق الخلائط للأنسجة المستهدفة كتوم من الهيكل الخارجي المورفولوجية. للتحايل على هذه المشكلة، ازلنا يطير الرأس والساقين، وأجنحة وآخر الجزئين من البطن لخلق الثقوب التي يسمح للمخلوط التثبيت لإدخال. كجزء من تثبيت البروتوكول شملنا المعاملة مع أكسيد الاوزميوم (أوسو4)5، الذي يستخدم على نطاق واسع بسبب قدرته على إصلاح الدهون، بما في ذلك الثلاثية. أوسو4 يحافظ على معظم هياكل جيد للغاية، لا سيما على مستوى الخلوية، وفي نفس الوقت يوفر على النقيض من الصورة. بعد التثبيت، تم تضمينها ثوراسيس المورفولوجية في الراتنج لمستعرضه شبه رقيقة تقطيع (1.5 ميكرومتر). لتحسين التباين والأنسجة يمكن أن يكون بالإضافة إلى ذلك ملطخة تولويدين الأزرق. أخذت صور ثوراسيس كاملة في 10 X وكان كمياً منطقة العضلات بيناريزينج الصور (من أبعاد متساوية) والتحديد الكمي للنسبة المئوية المقابلة لانسجة العضلات (بكسل سوداء) من أصل المجموع، مع برنامج إيماجيج بكسل.
التعديلات على مخاليط إعداد وتثبيت الأنسجة، كالزيادة في تركيز حل4 و glutaraldehyde أوسو، وعرض في هذا البروتوكول، يسمح الحفاظ على فريدة من نوعها لانسجة العضلات. يرجع ذلك إلى أن يتجنب البروتوكول بالتدهور وتشوه النسيج، مما يجعل التحليل اللاحق للعينات أكثر موثوقية حتى في ظروف شديدة ضامر المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية العضلية مثل ضمور ميوتونيك (ألماني). في شكله أكثر شيوعاً، ومارك ألماني من النوع 1، جلبت هذه الاضطرابات الوراثية النادرة يكرر CUG الموسع في نصوص الضمور myotonic البروتين كيناز (دمبك). الجيش الملكي النيبالي دمبك متحولة المجاميع البؤر ريبونوكلير النموذج الذي عزل البروتينات ربط الحمض النووي الريبي النووي مثل موسكليبليند (MBNL1-3؛ 6من موسكليبليند (Mbl) في المورفولوجية). أننا إنشاء نموذج المورفولوجية "الضمور ميوتونيك" بالإعراب عن 250 CTG يكرر تحت المروج سلسلة ثقيلة العضلات الميوسين (Mhc-Gal4). نموذج الذباب كانت يطير مع النمط الظاهري نموذجي 'عقدت حتى أجنحة' وخطيرة عضلة ضمور في هذه إيفمس (الشكل 2). وأظهرت الدراسات السابقة التي أجريت في المختبر أن تصميم منطقة العضلات إيفمس طريقة موثوقة قياس آثار المعدلات الكيميائية أو الوراثية المختلفة من ضمور العضلات في هذه الذباب النموذجي7. وكمثال على ذلك، تحقق overexpression isoform Mbl ج في الذباب معربا عن 250 CTG يكرر في العضلات، إنقاذ منطقة العضلات، كما يتم استنفاد Mbl بعزل العامل المسبّب في DM1 المرضية8 (الشكل 2). كما تم إنقاذ منطقة العضلات بعد تغذية نموذج مارك ألماني الذباب مع Abp1، هيكسابيبتيدي مع DM1 مكافحة ثبت النشاط9 (الشكل 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> رقم 2. التحديد الكمي للمقاطع دورسوفينترال من ثوراسيس الكبار جزءا لا يتجزأ من الراتنج. العضلات الرحلات غير المباشرة (أ-د) من melanogaster المورفولوجية الوراثية ذات الصلة المشار إليها. (أ) مراقبة الذباب (yw). (ب) التعبير عن 250 غير الترميز CTG يكرر في العضلات (UAS-CTG(250)x) تسبب انخفاض منطقة العضلات في دلمس بالمقارنة مع مراقبة الذباب. (ج) هذا النمط الظاهري ضمور العضلات قد انقذته overexpression موسكليبليند (MblC) (UAS-CTG (250) × UAS-MblC) و (د) تغذية الذباب النموذجي مع هيكسابيبتيدي Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). في جميع الصور الجانب الظهرية في الأعلى. كانت مدفوعة المتسلسلات العضلات باستخدام أحد المروجين ثقيلة-سلسلة الميوسين (Mhc)-Gal4. (ه) التحديد الكمي للنسبة المئوية لمساحة العضلات بالنسبة للذباب التحكم أكدت أن الخلافات كانت كبيرة. ويبين الرسم البياني وسائل ± S.E.M. * *ف< 0.01 و * ف < 0.05 (الاختبار t Student´s). شريط الحجم: 200 ميكرومتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
الطريقة التي ذكرت هنا سوف تكون موضع اهتمام الباحثين تركز على تنمية العضلات وصيانة، والشيخوخة، وباثولوجيا المرض واختبار المخدرات كما أنها توفر معلومات موثوقة حول كيفية استجابة أنسجة العضلات للعوامل الداخلية والخارجية على حد سواء.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image-J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ6</td>
			<td>Bright field technique.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71970</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision World</td>
			<td>14003</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fluka (Sigma)</td>
			<td>49624</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>0972A</td>
			<td>Extremely toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td>Extremely toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resin (Durcupan)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44611-44614</td>
			<td>Carcinogenic when it is unpolymerized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>251176</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant Medium (DPX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44581</td>
			<td>Dangerous.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Harmful.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>122507</td>
			<td>0.2 M dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>121677</td>
			<td>0.2 M dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>3052</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical cross-sectional muscle area determination of drosophila melanogaster adult indirect flight muscles

العضلات الهزال، المعروف باسم ضمور العضلات وهو النمط الظاهري مشتركة في نماذج المورفولوجية للأمراض العصبية العضلية. وقد استخدمنا عضلات الطيران غير المباشر الذباب، على وجه التحديد عضلات طولية دورسو (DLM)، تجريبية تخضع لقياس النمط الظاهري ضامر الناجمة عن مختلف الأسباب الوراثية (إيفمس). في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تضمين عضلات الصدر يطير لتقطيع شبه رقيقة، وكيفية الحصول على تباين جيد بين العضلات والأنسجة المحيطة، وكيفية معالجة صور المجهر الضوئي لاهتزازات الحصول على بيانات قابلة للقياس الكمي و تحليل. يصف لنا ثلاثة طلبات محددة من خط الأنابيب المنهجية. أولاً، نحن إظهار الكيفية التي يمكن بها تطبيق الأسلوب التحديد الكمي لضمور العضلات في نموذج يطير ضمور ميوتونيك؛ ثانيا، يمكن أن تساعد على قياس منطقة عضلة مستعرضة تحديد الجينات التي تعزز أو منع ضمور العضلات و/أو ضمور العضلات؛ ثالثا، يمكن تطبيق هذا البروتوكول تحديد ما إذا كان مركب مرشح قادراً على تعديل كبير النمط الظاهري ضامر معطى الناجم عن طفرة المسببة للمرضأو بواسطة مشغل بيئية.

لتحديد ما إذا كان overexpression MblC أو إدارة Abp1 أي تأثير في النمط الظاهري الضموري حثل Myotonic نموذج يطير ركزنا على دلمس، التي جزء من إيفمس (الشكل 1). عقدنا العزم أن الذباب النموذجي، الذي أعرب عن 250 يكرر CTG غير الترميز في جميع أنحاء الجهاز العضلي مدفوعا بالمروج الميو?...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles at JoVE.com

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

تحديد منطقة عضلة مستعرضة الضوئية عضلات الطيران غير المباشر الكبار Melanogaster المورفولوجية

ونحن التقرير طريقة لتحديد حجم منطقة العضلات، وطريقة غير مباشرة لتحديد العضلات في البالغين المورفولوجية . علينا أن نظهر عضلات تطبيق منهجية لدينا من خلال تحليل هذه الرحلة غير المباشرة في نموذج المورفولوجية لمرض "الضمور ميوتونيك".

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

8.9K Views.  University of Valencia. ونحن التقرير طريقة لتحديد حجم منطقة العضلات، وطريقة غير مباشرة لتحديد العضلات في البالغين المورفولوجية . علينا أن نظهر عضلات تطبيق منهجية لدينا من خلال تحليل هذه الرحلة غير المباشرة في نموذج المورفولوجية لمرض "الضمور ميوتونيك".

Video: Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

تشريح الجهاز العصبي المركزي اليرقات في Melanogaster ذبابة الفاكهة

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

تتبع الرائحة بصريا وساطة خلال الطيران في ذبابة الفاكهة

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

تشريح Oenocytes من الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

حقن الانسولين واستخراج الدملمف لقياس حساسية الانسولين في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

فيفو السابقين تقييم من تعب، وانقباض في عضلات الهيكل العظمي تناوب متفرقة

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

صيانة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; عدد السكان قفص

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...