ونحن نشكر مانويلا ويتكونات للحصول على العنوان S3 الفيلم. ونحن ممتنون رينهارد Fässler على الدعم السخي. وأيد هذا العمل قبل التطريز الشباب محقق برنامج ()، "مجلس البحوث الأوروبية" ضمن "البرنامج الإطاري السابع" للاتحاد الأوروبي (FP/2007-2013)/310939 منحة منسق الإغاثة الطارئة ()، و "جمعية ماكس بلانك" (S.B.L.،)، "المركز الوطني" ل البحث العلمي (يزار) ()، مبادرة التميز عميد جامعة إيكس-مرسيليا ()، إبلاغ لابيكس () وفي بورنغير انغلهايم Fonds (S.B.L.).

1-مرحلة الخوادر
<ol><li>إعداد صليب مع 20-40 عذراء الإناث والذكور حوالي 20 زجاجة الواحدة ذبابة الأغذية (الشكل 1A). وبدلاً من ذلك، إذا كان سيتم استخدام الأرصدة، فليب كل الأسهم في زجاجات جديدة. للحصول على ما يكفي الخوادر، النظر في إنشاء زجاجتين كل النمط الوراثي.</li>
	<li>احتضان الزجاجات في 25 درجة مئوية (أو 27 درجة مئوية وفقا للتصميم التجريبي) لمدة خمسة إلى ستة أيام (الشكل 1B). ملاحظة: الاحتفاظ بالتقليب الذباب كل يومين أو ثلاثة أيام لتجنب الازدحام وضمان إمدادات مستمرة من الخوادر.</li>
	<li>استخدام فرشاة مبللة لجمع بريبوباي الأبيض من جدران الزجاجات وتحويلها إلى الشرائح الزجاجية (الشكل 1). الوقت التدريج أن الخوادر الوصول إلى المطلوب في السن عند بدء العيش التصوير تحت المجهر. ملاحظة: هذه بريبوباي تبدو وكأنها الخوادر كبار السن من حيث شكلها، إلا أنها لا تزال بيضاء مثل اليرقات. ويعرف بداية مرحلة بريبوبال ح 0 بعد تشكيل بوباريوم (ح 0 الاتحادية).</li>
	<li>إزالة كتل من الأغذية يطير التمسك الخوادر بفرشاة مبللة وتوجيه الجانب البطني الخوادر اتجاه الشريحة الزجاجية باستخدام ستيريوميكروسكوبي (الشكل 1). تجاهل الخوادر التي لا تزال تتحرك (صغيرة جداً) أو التي بدأت بتشغيل البنى (القديم جداً). وهذا يضمن أن جميع الخوادر في نفس الفئة العمرية (0-1 ح الاتحادية).</li>
	<li>قم بتسمية الشرائح مع النمط الوراثي، وتاريخ ووقت جمع. نقل الشرائح الزجاجية لكل واحد صحن بيتري وإضافة نسيج رطب للحيلولة دون الخوادر من الجفاف (الشكل 1E).</li>
	<li>تخزين في الخوادر في حاضنة في 25 درجة مئوية أو 27 درجة مئوية حتى بلوغهم السن المطلوب. تابع مع الخطوات التالية ح 1 قبل التصوير، حيث يكون المطلوب الخوادر السن عند بدء التصوير الحي (الخطوة 3)، على سبيل المثال في 13 ح الإدارة العامة الاتحادية للفيلم هو مبين في الشكل 2 أ-د. ملاحظة: أقرب عمليا الوقت ونقطة البدء بعد الرأس-eversion الخوادر التي تحدث في 8-10 ح الإدارة العامة الاتحادية في 27 درجة مئوية.</li>
</ol>2-إعداد الخوادر للتصوير
<ol><li>ضمان أن الخوادر عصا الآن على الشريحة الزجاجية مثلما أنهم يتمسكون بطبيعة الحال على الجدران من الزجاجات بسبب بقايا الطعام يطير. لا الغراء إضافي مطلوب. إذا الخوادر العصا ليس جيدا بما يكفي بسبب ارتفاع نسبة الرطوبة، افتح طبق بتري لمدة دقائق قليلة السماح لهم الجافة. وبدلاً من ذلك، نقلها إلى الوجهين الشريط على شريحة زجاج، ولكن عادة، هذا ليس ضروريا.</li>
	<li>
فتح نافذة في حالة الخوادر لتصوير عضلات الطيران غير المباشر (الشكل 1 واو؛ انتقل إلى المقطع 2.3 لتصوير عضلات البطن).<ol>
<li>توجيه الخوادر إصرارها على الشريحة الزجاجية مع المواجه الأمامي بعيداً عن الباحث تحت ستيريوميكروسكوبي. ضبط التكبير/التصغير إلى 2 X.</li>
		<li>باستخدام واحدة من نهاية علم الأحياء الصف #5 الملقط، بلطف كزة ثقب في القضية الخوادر الظهرية إلى الجناح حيث ينتهي البطن والصدر يبدأ.</li>
		<li>إلى شريحة مفتوحة في حالة الخوادر، بلطف الانتقال الملقط إلى نهاية الأمامي من القفص الصدري على طول الجناح ولكن تجنب إتلاف الأنسجة الضعيفة الجناح. ملاحظة: إذا تسرب السائل من الخادرة، أنه معطوب؛ تخلص منه والبدء من جديد مع عذراء مختلفة.</li>
		<li>أرفع المقطع القضية الخوادر فوق الصدر مع الملقط وثم قطعت هذا المقطع مع مقص حاد، وغرامة على الجانب الآخر من خط الوسط الظهرية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
فتح نافذة في حالة الخوادر للتصوير لعضلات البطن (الشكل 1)<ol>
<li>توجيه الخوادر إصرارها على الشريحة الزجاجية مع المواجه الأمامي نحو الباحث تحت ستيريوميكروسكوبي. ضبط التكبير/التصغير إلى 2 X.</li>
		<li>باستخدام واحدة من نهاية علم الأحياء الصف #5 الملقط، بلطف كزة ثقب في القضية الخوادر الظهرية إلى الجناح حيث ينتهي الصدر والبطن يبدأ.</li>
		<li>إلى شريحة مفتوحة في حالة الخوادر، تحرك بلطف الملقط نهاية الخلفي من البطن. ملاحظة: إذا تسرب السائل من الخادرة، أنه معطوب؛ تخلص منه والبدء من جديد مع عذراء مختلفة.</li>
		<li>أرفع المقطع القضية الخوادر أعلى البطن بالملقط وثم قطعت هذا المقطع مع مقص حاد، وغرامة على الجانب الآخر من خط الوسط الظهرية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
جبل الخوادر (الشكل 1 ح)<ol>
<li>استخدام فرشاة مبللة لنقل الخوادر ليصل إلى خمسة إلى شريحة بلاستيكية مع أخدود (المناقشة انظر المواصفات، القابل لإعادة الاستخدام، وقائمة بالمواد). إضافة كوفيرسليبس فاصل واحد أو اثنين لكل جانب اعتماداً على عمق الاخدود وسمك الخوادر. وضع قطره صغيرة من الماء تحت كل ساترة مباعدة لجعله عصا للشريحة، وترك بعض المساحة بين الاخدود وكوفيرسليبس فاصل على كل جانب. ملاحظة: كوفيرسليبس فاصل يمكن أيضا تكون مربوطة إلى الشريحة مع سوبر الغراء، مقدما.</li>
		<li>توجيه الخوادر في أن يواجه فتح في القضية الخوادر صعودا باستخدام الفرشاة. ضمان الموضع الدقيق الخوادر في الزاوية الصحيحة لجودة التصوير جيدة. تحسين الزاوية لكل الأنسجة والوقت الإنمائية نقطة. ملاحظة: كمية صغيرة من المياه في الاخدود يجعل الموضع الخوادر أسهل. استنزاف المياه الزائدة مع الفرشاة بعد ذلك لتجنب الغرق.</li>
		<li>اضغط ساترة (18 × 18 ملم) أعلاه الخوادر دون لمسها. ضع قطرات صغيرة (حوالي 0.5 ميليلتر) الحل والغليسيرول 50% أعلاه كل حالة الخوادر تفتح على ساترة استخدام ماصة 20 ميليلتر. ملاحظة: هذا الإجراء يضمن القطرات نفس المسافات الخوادر.</li>
		<li>اقلب ساترة ووضعه فوق الخوادر باليد أو باستخدام الملقط (القياسية #5) بينما يستريح جانب واحد من ساترة على كوفيرسليبس مباعدة جوار الخوادر. المقبل، بلطف إسقاط ساترة على الخوادر. ضمان أن الفتحات القضية الخوادر مغطاة بشكل صحيح والغليسيرول 50% لجودة تصوير جيدة ومنع الخوادر من جفاف.</li>
		<li>إضعاف أكثر من واحدة من نهاية قطعة من شريط لاصق والاستيلاء عليها بالملقط (القياسية #5) في تحقيق هذه الغاية. بلطف ضع الشريط أن يغطي حافة واحدة ساترة العلوي، coverslip(s) فاصل والشريحة البلاستيكية على جانب واحد. لا تضغط أسفل الشريط، حتى الآن. أولاً، يستدير الشريحة وكرر للجانب الآخر.</li>
		<li>استخدام كلا الأصابع مؤشر إلى اضغط أسفل الشريط في نفس الوقت على كلا الجانبين. يضمن هذا الإجراء الخوادر مشردون لا.</li>
		<li>تحقق ما إذا كان الخوادر أيضا على اتصال ساترة. لجودة التصوير الأمثل ينبغي أن تقلص الخوادر بلطف تحت ساترة. ضبط عدد كوفيرسليبس فاصل إذا لزم الأمر.</li>
		<li>تسمية الشريحة بالكتابة على الشريط لزجة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-يعيش التصوير الخوادر
<ol><li>يسمح أسلوب تركيب تصوير الخوادر المجهر المقلوب (الرقم 1I) والمجاهر تستقيم (الرقم 1J). خاصة مناسبة لتصوير حية تقوم بمسح مجاهر [كنفوكل]، والمجاهر اثنين-فوتون، والغزل القرص مجاهر [كنفوكل] بغض النظر عما إذا كانت هي مقلوب أو تستقيم. للأفلام الطويلة الأجل، واستخدام مرحلة التحكم في درجة الحرارة إذا كانت متوفرة.</li>
	<li>باستخدام العين ومصباح الأشعة فوق البنفسجية أو انتقال الضوء، حدد عذراء والتركيز داخل الخادرة.</li>
	<li>باستخدام الكاميرا، إيجاد هيكل المرجوة، وضبط مستوى التكبير/التصغير.</li>
	<li>للأفلام الطويلة الأجل، تعريف كدسة z يشمل هيكل مصلحة جيدا (على سبيل المثال، عضلات الطيران غير المباشر أو مواقعهم مرفق، وخلايا الأربطة أو مزيج المذكورة آنفا) واختر فاصل زمني. النظر في القيام بحساب متوسط لتحسين جودة الصورة. للأفلام القصيرة الأجل وعالية السرعة، اختر z-طائرة واحدة لتحقيق معدل إطارات عالية.</li>
	<li>ضبط السلطة الليزر لإعطاء أفضل إشارة ممكنة ولكن القليل من التشبع. ومع ذلك، يمكن أن تلحق الضرر السلطة ليزر عالية جداً الخادرة على مر الزمن.</li>
	<li>بدء التصوير والعودة من وقت لآخر للتحقق من الفيلم وإعادة ضبط موضع z-المكدس إذا لزم الأمر.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig1.jpg"> رقم 1: سير العمل لتصوير مباشر من morphogenesis وتر العضلات في الخوادر المورفولوجية . انظر البروتوكول للحصول على التفاصيل. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).</li><li>Venken, K. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> eLife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wingless+signaling+induces+nautilus+expression+in+the+ventral+mesoderm+of+the+Drosophila+embryo.">Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).</li><li>Roy, S., Raghavan, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeotic+genes+and+the+regulation+of+myoblast+migration,+fusion,+and+fibre-specific+gene+expression+during+adult+myogenesis+in+Drosophila.">Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila.</a> Development. 124 (17), 3333-3341 (1997).</li><li>Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirements+for+Myocyte+Enhancer+Factor-2+during+adult+myogenesis+in+Drosophila.">Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila.</a> Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).</li><li>Gordon, S., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+calcium+in+the+regulation+of+mechanical+power+in+insect+flight.">Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).</li><li>Jin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Screens+for+In+Vivo+Tinman+Binding+Sites+Identify+Cardiac+Enhancers+with+Diverse+Functional+Architectures.">Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).</li><li>Chen, E. H., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisocial,+an+intracellular+adaptor+protein,+is+required+for+myoblast+fusion+in+Drosophila.">Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila.</a> Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).</li><li>Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Fluorescent+Protein+Tagging+Drosophila+Proteins+at+Their+Native+Genomic+Loci+With+Small+P+Elements.">Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements.</a> Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).</li><li>Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Sch&#246;ck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alp/Enigma+Family+Proteins+Cooperate+in+Z-Disc+Formation+and+Myofibril+Assembly.">Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).</li><li>Klapholz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+for+talin+to+mediate+integrin+function.">Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function.</a> Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).</li><li>Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+protein+Kon-tiki+couples+to+Dgrip+to+mediate+myotube+targeting+in+Drosophila.">The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila.</a> Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).</li><li>Menon, S. D., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+rolling+pebbles:+a+multidomain+protein+required+for+myoblast+fusion+that+recruits+D-Titin+in+response+to+the+myoblast+attractant+Dumbfounded.">Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded.</a> Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).</li><li>Bloor, J. W., Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=zipper+Nonmuscle+myosin-II+functions+downstream+of+PS2+integrin+in+Drosophila+myogenesis+and+is+necessary+for+myofibril+formation.">zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation.</a> Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).</li><li>Millard, T. H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+filopodial+interactions+during+the+zippering+phase+of+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure.</a> Development. 135 (4), 621-626 (2008).</li><li>Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood+brain+barrier+is+maintained+by+GPCR-dependent+dynamic+actin+structures.">The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures.</a> J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Analysis+with+a+Repressible+Cell+Marker+for+Studies+of+Gene+Function+in+Neuronal+Morphogenesis.">Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>F&#246;rster, D., Luschnig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src42A-dependent+polarized+cell+shape+changes+mediate+epithelial+tube+elongation+in+Drosophila.">Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila.</a> Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).</li><li>Weitkunat, M., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+study+Drosophila+muscle+biology.">A guide to study Drosophila muscle biology.</a> Methods. 68 (1), 2-14 (2014).</li><li>Weitkunat, M., Kaya-&#199;opur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+and+force-resistant+attachment+are+essential+for+myofibrillogenesis+in+Drosophila+flight+muscle.">Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle.</a> Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).</li><li>Guirao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unified+quantitative+characterization+of+epithelial+tissue+development.">Unified quantitative characterization of epithelial tissue development.</a> eLife. 4, e08519 (2015).</li><li>Etournay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+and+spontaneous+muscle+twitching+precede+the+formation+of+cross-striated+muscle+in+vivo.">Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo.</a> Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).</li><li>Sellin, J., Albrecht, S., K&#246;lsch, V., Paululat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+heart+differentiation,+visualized+utilizing+heart+enhancer+elements+of+the+Drosophila+melanogaster+bHLH+transcription+factor+Hand.">Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand.</a> Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).</li><li>Lemke, S. B., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+during+muscle+development.">Mechanical forces during muscle development.</a> Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).</li><li>Classen, A. -. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+of+Drosophila+with+the+CRISPR+RNA-guided+Cas9+nuclease.">Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease.</a> Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).</li><li>Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+two-step+CRISPR-+and+RMCE-based+strategy+for+efficient+genome+engineering+in+Drosophila.">A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila.</a> G3. 4 (12), 2409-2418 (2014).</li><li>Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

البروتوكول قدم وصف كيفية صورة morphogenesis وتر العضلات في المعيشة الخوادر المورفولوجية لاستخدام مجموعة متنوعة من البروتينات المعلمة فلوريسسينتلي. يمكن استخدام هذا في فيفو التصوير استراتيجية لدراسة العمليات الإنمائية في بيئتها الطبيعية للكائن الحي كامل.
من الأهمية بمكان لتجربة ناجحة للعثور على نقطة الوقت التنموية الصحيحة لتحليل. على سبيل المثال، بدء عضلات الطيران غير المباشر دورسولونجيتودينال التمسك بأهدافها وتر في إيتش وان سيكس ح APF23 بينما عضلات البطن وضع في وقت لاحق ونعلق على طرفي فقط بين 30 و 40 ح APF26. ونتيجة لذلك، ينبغي أن تستخدم الكتابات المنشورة سابقا إيجاد نقاط الوقت المناسب للتنمية لتحليل، أو إذا لم تدرس الأنسجة أو هيكل للاهتمام بالتفصيل قبل، التنمية الشاملة وقد تتسم أولاً.
لتصاعد الخوادر بنجاح على شرائح بلاستيكية مبنية خصيصا، من المهم أن الأخاديد أبعادا مناسبة: الأخاديد الحاجة إلى 1.0-1.5 مم على نطاق واسع و 0.3-0.4 ملم العميق. ويسمح هذا العمق ضبط المسافة الدقيقة إلى ساترة العلوي مع فاصل كوفيرسليبس حسب الحاجة. ومع ذلك، ساترة فاصل واحد على الأقل ينبغي أن تستخدمها لتجنب استنزاف والغليسيرول 50% بعيداً عن العينة القوى الشعرية. الموضع الصحيح من الخوادر في groove يتطلب بعض الخبرة، وينبغي أن يكون الأمثل أن هيكل للاهتمام أقرب ما يمكن إلى ساترة.
إذا كان عدد كبير من الخوادر المفترض أن يتم تصويرها في الدورة مجهر واحد، ويمكن جميع مثبتة مسبقاً وثم تخزينها في حاضنة حتى التصوير لضمان التوقيت التنموي السليم. ينبغي الخوادر البقاء على قيد الحياة الإجراء بأكمله وأيضا على الأقل محاولة اكلس إذا أبقى على الشريحة بعد تصوير. يمكن استخدام معدل البقاء على قيد الحياة كقراءات للتحقق ما إذا كانت ظروف التصوير تضر الخوادر.
وينبغي اختيار إعدادات التصوير بعناية وفقا لمتطلبات التجريبية. للأفلام القصيرة الأجل، يحتاج معدل إطارات عال مقابل نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية أن تكون متوازنة، بينما يمكن استخدام طاقة الليزر العالية نسبيا دون الأضرار الخوادر كثيرا. ومع ذلك، للأفلام الطويلة الأجل، قوة الليزر إبقاؤها عند مستوى معتدل وينبغي أن لا تصويرها الخوادر باستمرار بل في بعض النقاط الزمنية، على سبيل المثال، كل 20 دقيقة. للتأكد من أن هيكل المصلحة عدم الخروج من مجال الرؤية، قد يكون من الضروري إعادة ضبط الموضع من z-المكدس بين النقاط الزمنية. على حد علمنا، فتح القضية الخوادر في حد ذاتها لا تؤثر على توقيت التنموية. ومع ذلك، ينبغي استخدام مرحلة التحكم في درجة الحرارة لأفلام طويلة الأجل لضمان التوقيت التنموي السليم. مراعاة هذه الاعتبارات، يمكن الحصول على أفلام الزاخر.
يمكن استخدام البروتوكول المقدم لتصور morphogenesis وتر العضلات ليس فقط ولكن أيضا الأنسجة النامية الأخرى، على سبيل المثال، الجناح ظهارة29. فقط ثلاثة تعديلات على هذا البروتوكول المطلوبة: (1) فتح القضية الخوادر أعلاه الجناح بدلاً من الصدر أو البطن، (2) تحديد المواقع الخوادر مع الجناح نحو ساترة الأعلى، و (3) استخدام علامة نيون مختلف البروتينات. مع النهوض كريسبر/Cas9-التكنولوجيا، البروتينات الفلورية كلمات أكثر وأكثر اندوجينوسلي تكون متاحة، وأنها أصبحت أكثر وضوحاً لاستهداف المكاني الذاتية في المورفولوجية30،31 , 32-في المستقبل، وهذا سيتيح توضيح ديناميات العديدة البروتينات، والخلايا والأنسجة كاملة في بيئتهم الفسيولوجية بالتفصيل.

جهاز العضلات وتر، يسمح للحيوانات بما فيها البشر التحرك على أجزاء الجسم. الغاية هي حفظت لبنات البناء الجزيئي للنظام وتر العضلات. ولذلك، يمكن دراسة مفاهيم التنمية وتر العضلات ذات الصلة للبيولوجيا البشرية العضلات، على سبيل المثال morphogenesis عضلة ووتر عضلة مرفق ميوفيبريل التنظيم الذاتي، استخدام melanogaster المورفولوجية كالوصول إليها بسهولة النظام النموذجي. ويضم النظام الخوادر المورفولوجية العديد من المزايا التجريبية. أولاً، في مرحلة الخوادر – عندما يتم تشكيل العضلات الكبار – الكائن الحي لاطئة وبالتالي من السهل الصورة في مجهر على مدى فترة الساعات أو حتى أيام. وثانيا، بإغلاق العديد من العضلات النموذج كافية تحت السطح الخوادر ذلك لأنهم يمكن تصويرها داخل الكائن الحي، سليمة وشفافة جزئيا. وثالثاً، يمكن أن يحقق العضلات في بيئتها الطبيعية، حيث يتم توصيلها إلى تشكيل الهيكل الخارجي عبر خلايا الأربطة والأنسجة التوتر هو بناء. هذا غير ممكن في نظم الاستزراع الخلية العضلات. وأخيراً، يتوفر عدد كبير أدوات الجينية في المورفولوجية. ومن بين هذه هي العديد من علامات المعلمة فلوريسسينتلي التي تسمح لتصنيف أنواع الخلايا المحددة أو هياكل سوبسيلولار للتصوير في فيفو.
ويلخص الجدول 1 أهم العلامات المستخدمة لدراسة morphogenesis وتر العضلات. وتتضمن علامات أوفيريكسبريسيد باستخدام GAL4-UAS-النظام1 ومعلم اندوجينوسلي البروتين علامات2،،من34. ميزة النظام GAL4 UAS هو أن العلامات عموما يعبر عن مستويات عالية، أسفر عن إشارة قوية يمكن تصويرها بسهولة في الجامعة-جبل الخوادر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق خصوصية الأنسجة عن طريق اختيار السائقين GAL4 بعناية. استفادة البروتينات الانصهار أعرب تحت الرقابة الذاتية أن القوى المحركة للبروتينات ذات الصلة يمكن أن تكون درس في فيفو، بينما يمكن استخدامها أيضا كعلامات لأنواع مختلفة من الخلايا أو هياكل سوبسيلولار محددة، على سبيل المثال، ΒPS-إنتغرين-التجارة والنقل لمواقع مرفق العضلات. معا، هذه العلامات توفر مرونة عالية في التصميم التجريبي واختيار بحث المشاكل التي يمكن حلها الآن وفي المستقبل.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">الهيكل المسمى</td>
			<td colspan="2">علامة</td>
			<td colspan="2">التعبير والتعريب</td>
			<td colspan="2">الفئة</td>
			<td colspan="2">عدد الأسهم</td>
			<td colspan="2">التعليق</td>
			<td>Ref.</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="15">العضلات</td>
			<td colspan="2">
Mef2-GAL4</td>
			<td colspan="2">جميع ميوبلاستس وجميع العضلات في جميع مراحل</td>
			<td colspan="2">خط GAL4</td>
			<td colspan="2">BL 27390</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
1151-GAL4</td>
			<td colspan="2">السلائف العضلات الكبار و myotubes المبكر حتى إيتش تو فور ح APF</td>
			<td colspan="2">خط GAL4، فخ محسن</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act79B-GAL4</td>
			<td colspan="2">القفز العضلات عند المفاضلة</td>
			<td colspan="2">خط GAL4</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F-GAL4</td>
			<td colspan="2">عضلات الطيران غير المباشرة بدءاً إيتش وان فور ح APF</td>
			<td colspan="2">خط GAL4</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F-Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">عضلات الطيران غير المباشرة بدءاً إيتش وان فور ح APF</td>
			<td colspan="2">محسن Act88F/المروج القيادة Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Ca2 + مؤشر</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Act88F--بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">عضلات الطيران غير المباشرة بدءاً إيتش وان فور ح APF</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط)</td>
			<td colspan="2">fTRG78 و fTRG10028</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
له-nls-بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">عضلة الكبار السلائف، النووية، حتى ح إيتش تو فور الإدارة العامة الاتحادية في عضلات الطيران غير المباشر</td>
			<td colspan="2">محسن/المروج مع المراسل nls-بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">جزء محسن 1.5 كيلو بايت</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Mhc-تاو-بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">microtubules في قوالب DLM والتفريق بين العضلات</td>
			<td colspan="2">محسن/المروج مع المراسل تاو-بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">BL 53739</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ΒTub60D--بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">ميكروتوبوليس في ميوتوبيس (على سبيل المثال في عضلات الطيران غير المباشر من ح إيتش وان فور لوكالة فرانس برس بشدة في التناقص بعد إيتش فور إيت ح الاتحادية)</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط)</td>
			<td colspan="2">fTRG958</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Mhc-التجارة والنقل (weeP26)</td>
			<td colspan="2">ساركوميريس (خيط سميك) في جميع عضلات الجسم (على سبيل المثال في عضلات الطيران غير المباشر بدءاً من ح إيتش ثري زيرو الاتحادية)</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-فخ</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">استخدام متخالف، تسميات مجموعة فرعية إيسوفورم</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td colspan="2">سلس-بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">ساركوميريس (القرص Z) في جميع عضلات الجسم (على سبيل المثال في عضلات الطيران غير المباشر بدءاً من ح إيتش ثري زيرو الاتحادية)</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">G53، استخدام متخالف</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp66--بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">ض-القرص في جميع عضلات الجسم</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط)</td>
			<td colspan="2">BL 6824</td>
			<td colspan="2">ZCL0663</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp52--بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">ض-القرص في جميع عضلات الجسم</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط)</td>
			<td colspan="2">BL 6838</td>
			<td colspan="2">G00189</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Hts-بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">أكتين ملزمة؛ وأعرب في ظهارة، وميوبلاستس وميوتوبيس</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط)</td>
			<td colspan="2">fTRG585</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Dlg1--بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">تقاطعات الخلايا الظهارية، وميوبلاستس، والأغشية في العضلات في جميع مراحل</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط)</td>
			<td colspan="2">fTRG502</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="5">موقع مرفق العضلات</td>
			<td colspan="2">ΒPS-إنتغرين-بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2" fo:page-break-inside="avoid">مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر)</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء تدق في</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">تالين-التجارة والنقل ومشري</td>
			<td colspan="2">مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر)</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-فخ (تقليد الخط)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">تالين-بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر)</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (ذبابة ترانسجينيومي خط)</td>
			<td colspan="2">fTRG587</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">أمثاله-بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر)</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-فخ (صائدة الذباب خط)</td>
			<td colspan="2">كيوتو 110951 (ZCL3111)</td>
			<td colspan="2">ZCL3111، ZCL3192</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vinc-التجارة والنقل، وطلب تقديم العروض-</td>
			<td colspan="2">مواقع مرفق العضلات (مثلاً، بدءاً إيتش وان إيت ح وكالة فرانس برس في عضلات الطيران غير المباشر)</td>
			<td colspan="2">بروتينات فلورية خضراء-الانصهار (التحوير)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">وتر</td>
			<td colspan="2">
ريال-GAL4</td>
			<td colspan="2">خلايا وتر الصدر، طوال مرحلة الخوادر</td>
			<td colspan="2">خط GAL4، فخ محسن</td>
			<td colspan="2">BL 26663</td>
			<td colspan="2">متماثل المميتة</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td colspan="2">عضلة ووتر</td>
			<td colspan="2">
Duf-GAL4</td>
			<td colspan="2">العضلات وابيثيليا، بداية مبكرة</td>
			<td colspan="2">خط GAL4</td>
			<td colspan="2">BL 66682</td>
			<td colspan="2">كيري-rP298، مؤسس علامة خلية</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="7">UAS-الصحفيين</td>
			<td colspan="2">
UAS-التجارة والنقل--التقييم</td>
			<td colspan="2">ربط أكتين</td>
			<td colspan="2">خط UAS</td>
			<td colspan="2">BL 31776</td>
			<td colspan="2">أكتين ملزمة المجال من موسين تنصهر للتجارة والنقل</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-مشري--التقييم</td>
			<td colspan="2">ربط أكتين</td>
			<td colspan="2">خط UAS</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Gma تنصهر فيها مشري</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- ليفيكت--بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">ربط أكتين</td>
			<td colspan="2">خط UAS</td>
			<td colspan="2">BL 35544</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-ليفيكت-روبي</td>
			<td colspan="2">ربط أكتين</td>
			<td colspan="2">خط UAS</td>
			<td colspan="2">BL 35545</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-بروتينات فلورية خضراء</td>
			<td colspan="2">ربط الغشاء</td>
			<td colspan="2">خط UAS</td>
			<td colspan="2">مختلف الأرصدة، مثلاً: BL 32184</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-مشري</td>
			<td colspan="2">ربط الغشاء</td>
			<td colspan="2">خط UAS</td>
			<td colspan="2">BL 27391 و 27392</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-النخيل-متشيري</td>
			<td colspan="2">ربط الغشاء عن طريق بالميتويليشن</td>
			<td colspan="2">خط UAS</td>
			<td colspan="2">BL 34514</td>
			<td colspan="2">
UAS-برينبوو</td>
			<td>21</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: معلم فلوريسسينتلي علامات البروتين مناسبة لدراسة العضلات وتر morphogenesis في فيفو.
هنا، نحن تصف بالتفصيل كيف يمكن إجراء تصوير morphogenesis وتر العضلات في الخوادر للمعيشة بسهولة ونجاح (الشكل 1). وبدلاً من ذلك، يمكن أن تكون ثابتة الخوادر، تشريح وهي إيمونوستينيد، الذي يسمح باستخدام الأجسام المضادة أيضا تسمية البروتينات التي لا يعيش علامات المتاحة22. في هذه الحالة، نوعية التصوير أعلى بصفة عامة لأن هناك أي تحرك ويمكن وضع الهيكل للاهتمام بالقرب من ساترة. ومع ذلك، تشريح والتثبيت يمكن أن يؤدي إلى أضرار والجزيئية أو يمكن فقط دراسة ديناميات النسيج، على سبيل المثال، العضلات الوخز، في الحي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>product has been replaced by Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fly food in bottles (or vials)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>standard culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paint brush</td>
			<td>da Vinci</td>
			<td>1526Y</td>
			<td>size 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VWR: 631-1303</td>
			<td>76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided tape (optional)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6651263</td>
			<td>12 mm x 6.3 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632102</td>
			<td>94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper tissues</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7695251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps #5 (Dumont, inox, standard)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>0.1 mm x 0.06 mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>0.05 mm x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td>straight tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic slides with a groove (reusable)</td>
			<td>custom-built</td>
			<td>-</td>
			<td>75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107032</td>
			<td>18 x 18 mm, No. 1.5H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49781</td>
			<td>dilute to 50 % in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adhesive tape</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>57370-02</td>
			<td>1.5 mm x 10 m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae

تمكين العضلات جنبا إلى جنب مع الأوتار وهيكل عظمى الحيوانات بما فيها البشر التحرك على أجزاء الجسم. هو يحافظ morphogenesis العضلات درجة عالية من الحيوانات إلى البشر. ولذلك، يمكن استخدام النظام النموذجي المورفولوجية قوية لدراسة مفاهيم التنمية وتر العضلات التي يمكن تطبيقها أيضا على البيولوجيا البشرية العضلات. هنا، نحن تصف بالتفصيل كيف يمكن بسهولة تصويرها morphogenesis النظام وتر العضلات الكبار في المعيشة، تطوير الخوادر المورفولوجية . ومن ثم، يسمح الأسلوب التحقيق البروتينات والخلايا والأنسجة في بيئتهم الفسيولوجية. بالإضافة إلى بروتوكول خطوة بخطوة مع نصائح مفيدة، نحن نقدم استعراضاً شاملا للمعلمة فلوريسسينتلي ماركر البروتينات التي مناسبة لدراسة النظام وتر العضلات. لتسليط الضوء على تطبيقات متعددة للبروتوكول، نعرض المثال أفلام تتراوح بين التصور الأحداث morphogenetic طويلة الأجل – التي تحدث في مقياس الوقت لساعات وأيام – لتصور عمليات الدينامية قصيرة الأجل مثل ارتعاش العضلات التي تقع في نطاق مرة ثانية. أخذت معا، هذا البروتوكول ينبغي أن تمكن القارئ على تصميم وإجراء تجارب العيش-التصوير للتحقيق morphogenesis وتر العضلات في الكائن الحي سليمة.

يمكن أن تكون مختلف الأنسجة المصورة في فيفو في تطوير الخوادر يطير، يجعلها نظام نموذج مثالي لدراسة morphogenesis الأجهزة الكبار. ومن بين هذه هي عضلات الطيران غير المباشر وظهاره الجناح، وعضلات البطن وظهاره الصدر بما في ذلك الخلايا وتر القلب22،،من2324،،من2526 , 27-وهنا، علينا أن نركز على تصوير مباشر من morphogenesis عضلة ووتر. للاطلاع على وصف تفصيلي للرحلات غير المباشرة العضلات والعضلات البطن morphogenesis وأساليب إضافية لدراسة البيولوجيا العضلات في المورفولوجية، نشير للقارئ إلى ويتكونات و Schnorrer 201422.
يعيش التصوير عضلات الطيران غير المباشر
وأعرب لدراسة التنمية الطويلة الأجل في عضلات الطيران غير المباشرة تتكون من العضلات دورسولونجيتودينال (دلمس) والعضلات دورسوفينترال (دفمس)، مويسين كروي معلم المجال أكتين-الربط مع التجارة والنقل (UAS--التجارة والنقل-التقييم) في جميع العضلات باستخدام عامل محسن ميوسيتي 2 (Mef2)--GAL4 برنامج التشغيل (الشكل 2 أ-د، فيلم S1). قبل التصوير، وفتح نافذة في قضية الخوادر أعلاه الصدر كما هو مبين في الشكل 1 واو. في مجهر اثنين-فوتون، اقتنى z-مكدسات كل 20 دقيقة ح 21 بدءاً إيتش وان وان ح بعد تشكيل بوباريوم (11 ح الاتحادية). في هذا الإطار الزمني، دلمس (الأخضر التراكبات في الشكل 2 ألف'-D') الشروع أولاً في مرفق بوتر الخلايا (الشكل 2A) وثم تقسيم حين تنضج المرفقات العضلات (الشكل 2). بعد ذلك، ميوتوبيس تقصير (الشكل 2) حتى تصل أخيرا إلى مرحلة ضغط الحد الأقصى في 30 ح APF (الشكل 2D). أخذت معا، هذا الفيلم يسلط الضوء على التغيرات الهائلة في مورفولوجيا العضلات التي تحدث على مقياس الوقت لساعات.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig2.jpg"> رقم 2: يعيش تصوير للرحلات غير المباشرة morphogenesis عضلة ووتر. (أ-د) الوقت النقاط من فيلم اثنين-فوتون (فيلم S1) باستخدام Mef2-GAL4، UAS-التجارة والنقل--التقييم كعلامة أكتين في عضلات الطيران غير المباشرة تتكون من العضلات دورسولونجيتودينال (دلمس، أبرزت باللون الأخضر في أ '-د') و (العضلات دورسوفينترال دفمس، وأبرزت باللون الأزرق في ألف '-د'). هي أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. (ه-ح) النقاط الزمنية من فيلم اثنين-فوتون (فيلم S2) باستخدام Duf-GAL4، UAS-CD8-بروتينات فلورية خضراء كعلامة لعضلات الطيران غير المباشر وظهاره الصدر بما في ذلك الخلايا وتر. ألواح ه '--ح' إظهار تراكب مع نموذج النظام وتر العضلات في كل نقطة من الزمن، تسليط الضوء على امتدادات طويلة الخلوية التي شكلتها ظهارة وتر (أرجواني) على اتصال بالعضلات (أخضر). أشرطة مقياس من 100 ميكرومتر (يقدر حجم هياكل المصورة). (أنا-L) الوقت النقاط من غزل، اللونين [كنفوكل] فيلم قرص (فيلم S3) مع التركيز على استهلال مرفق وتر العضلات. تتم تسمية الخلايا وتر مع ريال-GAL4، UAS-النخيل-مشري (أرجواني) ودورسولونجيتودينال غير المباشرة طيران العضلات مع Mhc-تاو-التجارة والنقل (أخضر). أشرطة مقياس من 10 ميكرون. الوقت يرد ك hh: mm بعد تشكيل بوباريوم (الاتحادية). علما بأن ليس كل الأفلام تم الحصول عليها في مرحلة التحكم في درجة الحرارة، لذلك، قد تختلف توقيت التنموية. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
لدراسة morphogenesis الأربطة والعضلات وفي الوقت نفسه، أعرب زمنياً غشاء بروتينات فلورية خضراء (UAS-CD8-التجارة والنقل) باستخدام دومبفونديد (Duf)-GAL4 كسائق، التي يعبر عنها كل من خلايا الأربطة والعضلات الرحلات غير المباشرة (الشكل 2E -ح، فيلم S2). ض-كومة اتخذت في مجهر اثنين-فوتون كل 20 دقيقة ابتداء من الساعة 16 ح الإدارة العامة الاتحادية ح 20. في حين ضغط ميوتوبيس (تراكب الخضراء في الشكل 2E'-ح')، الوتر الخلايا نموذج ملحقات الخلوية منذ وقت طويل أن تمديد مع الوقت (تراكب الأرجواني في الشكل 2E'-ح'). أخذت معا، هذا الفيلم يسلط الضوء على التفاعل الوثيق بين وتر والعضلات الخلايا في الجسم الحي.
للتحقيق في عضلة وتر التفاعل بمزيد من التفصيل، أنجز التصوير باللونين، عالية التكبير. الخوادر مع سلسلة ثقيلة الميوسين (Mhc)-تاو-التجارة والنقل في دلمس و UAS-بالميتويلاتيد-مشري (UAS-النخيل-مشري) يقودها الشريطية (sr)-GAL4 في الأوتار تم تصويرها كل 5 دقائق ابتداء من الساعة h 12 الإدارة العامة الاتحادية ح 4.5 على قرص غزل مجهر [كنفوكل] (الشكل 2 طاء-L، فيلم S3). في h 12 الإدارة العامة الاتحادية، ترحيل myotubes نحو تلك الخلايا الهدف وتر مع تشكيل فيلوبوديا طويلة في هذه النصائح (الشكل 2 طاء). وفي وقت لاحق، عضلة ووتر الأنسجة إينتيرديجيتاتي (الرقم 2J، ك) شكل ملحق مستقرة. نضوج المرفق، أقل فيلوبوديا شكل وواجهة وتر عضلة سموثينس (الشكل 2 لتر). وهكذا، يمكن استخدام التصوير باللونين، عالية التكبير للكشف عن ديناميات الخلوية بالتفصيل في الحي.
يعيش التصوير لعضلات البطن
لتصوير حية في عضلات البطن (الشكل 3، فيلم S4)، Mef2-GAL4> UAS-CD8-استخدمت بروتينات فلورية خضراء كعلامة وتم فتح نافذة أعلى البطن في حالة الخوادر ك المبين في الشكل 1. مماثلة للفيلم العضلات الرحلات غير المباشرة ممثلة في الشكل 2 أ-د، تشكيل ونمو عضلات البطن يمكن اتباعها على مدى ساعات عديدة من التنمية (ح 55 في فيلم S4). وخلال هذا الوقت، الصمامات ميوبلاستس بشكل متزايد myotubes (الشكل 3A). نصائح ميوتوبي تهاجر إلى أهدافها بوتر، وبعد إرفاق إلى الخلايا وتر، يتم تشكيل وحدات تقلص العضلات، ساركوميريس، (الشكل 3B-د).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig3.jpg"> الشكل 3: يعيش تصوير للعضلات البطن morphogenesis. (أ-د) الوقت النقاط من فيلم (فيلم S4) باستخدام Mef2-GAL4، UAS-CD8-بروتينات فلورية خضراء كعلامة على اتباع morphogenesis عضلة البطن. ألواح A '-ه' إظهار تراكبات مع نماذج مجموعة العضلات البطن (الأخضر) التي تشكل حيثياته خلال مرحلة الخوادر. أشرطة مقياس من 100 ميكرومتر. الوقت يرد وصفها hh: الإدارة العامة الاتحادية. حصل الفيلم في درجة حرارة الغرفة. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
يعيش التصوير من ارتعاش العضلات
على النقيض من الشكل 2 و الشكل 3، يبين الشكل 4 الديناميات العضلات التي تقع في نطاق مرة ثانية: تسجيل مباشر من تقلصات العضلات. الخوادر للإعراب عن βPS-إنتغرين-بروتينات فلورية خضراء تحت الرقابة الذاتية تم تصويرها بدقة وقت 0.65 s في طائرة z واحدة في مجهر [كنفوكل] (S5 الفيلم). في المثال المعروض في الشكل 4، تم تصويرها مواقع ثلاثة دفمس (الشكل 4 أ) المرفق لمدة 10 دقيقة ابتداء من الساعة 42 ح الإدارة العامة الاتحادية. وخلال هذا الوقت، لوحظت أحداث نشل الخمسة (الشكل 4 باء-F)، تبين أن ساركوميريس الفعل تجميع جيدا بما يكفي لدعم المنسقة تقلصات في هذه النقطة الزمنية في التنمية. ومن ثم، يمكن استخدام التصوير من ارتعاش العضلات كقراءة وظيفية ساركوميروجينيسيس الفعل أثناء الرحلة غير المباشرة العضلات التنمية28، بدلاً من اختبارات الطيران على سبيل المثال، التي يمكن أن يؤديها إلا بعد اكلوسيون.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig4.jpg"> الشكل 4: يعيش التصوير من ارتعاش العضلات. (أ) أول مرة-نقطة من فيلم (فيلم S5) عرض رفة العضلات دورسوفينترال الرحلات غير المباشرة في استخدام APF ح 42 βPS-إنتغرين-بروتينات فلورية خضراء كعلامة. في مجال الرؤية العضلات مواقع المرفق 2 ثانيا طبيب بيطري, طبيب بيطري الثالث 1 و 2 ثالثا طبيب بيطري. (إف ب) لون تراكبات من خمسة أحداث نشل الفردية، كل عرض الإطار قبل نشل (أرجواني) والإطار الأول من الحدث نشل (أخضر). ملاحظة أن نشل ألياف العضلات الفردية بشكل مستقل عن بعضها البعض. سهام إبراز الاقتراح الوخز. حل وقت الفيلم 0.65 أشرطة مقياس س. هي 25 ميكرومتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
يعيش التصوير من البروتينات اندوجينوسلي المعلمة
مماثلة إلى βPS-إنتغرين-التجارة والنقل، ومجموعة كبيرة من البروتينات الانصهار المعرب عنها في المورفولوجية تحت الرقابة الذاتية قد ولدت2،،من34. يمكن استخدام هذه الخطوط الطيران للدراسة على سبيل المثال التعريب سوبسيلولار أو ملامح تعبير البروتينات ذات الاهتمام. جمع مفيد بشكل خاص إذا كانت الأجسام المضادة المحددة غير متوفرة أو ديناميات البروتين بحاجة إلى أن يكون التحقيق في فيفو دون التثبيت. يبين الشكل 5 ثلاثة أمثلة للبروتينات الانصهار أعرب اندوجينوسلي من المكتبة يطير ترانسجينيومي (فترج)، وهو جين تاو لي تاي شاو (Hts)-التجارة والنقل (الشكل 5 ألف، باء)، تالين-التجارة والنقل (الشكل 5، د) و βTubulin60D--التجارة والنقل ( الشكل 5E، و). التعبير عن هذه البروتينات يمكن دراستها في جميع الأنسجة بالتعبير عنها بطبيعة الحال. هنا، نعرض ظهارة الصدر (الشكل 5 أ، ج، ه) وعضلات الطيران غير المباشر أو مواقعهم مرفق (الشكل 5، د، و) كأمثلة.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig5.jpg"> الرقم 5: تصوير مباشر من اندوجينوسلي معلم البروتينات. (أ، ب) الحد الأقصى من الإسقاطات z-مكدسات المتخذة الخوادر للإعراب عن Hts-التجارة والنقل. (ج، د) الحد الأقصى من الإسقاطات z-مكدسات المتخذة الخوادر للإعراب عن تالين-التجارة والنقل. (ه، و) الحد الأقصى من الإسقاطات z-مكدسات المتخذة الخوادر للإعراب عن βTubulin60D-التجارة والنقل. لوحات ألف وجيم وهاء إظهار ظهارة الصدر في ح 18 و 24 و 18 الاتحادية، على التوالي، وألواح ب د وو إظهار عضلات الطيران غير المباشر أو مواقعهم مرفق في 30 ح الإدارة العامة الاتحادية. أشرطة مقياس هي 25 ميكرومتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae at JoVE.com

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

هنا، نحن نقدم وسيلة سهلة الاستخدام، وتنوعاً لإجراء التصوير مباشر للعمليات الإنمائية في morphogenesis العامة ووتر العضلات خاصة في المعيشة الخوادر المورفولوجية .

في فيفو تصوير Morphogenesis وتر العضلات في المورفولوجية الخوادر

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

in-vivo-imaging-of-muscle-tendon-morphogenesis-in-drosophila-pupae

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

11.3K Views.  Max Planck Institute of Biochemistry. هنا، نحن نقدم وسيلة سهلة الاستخدام، وتنوعاً لإجراء التصوير مباشر للعمليات الإنمائية في morphogenesis العامة ووتر العضلات خاصة في المعيشة الخوادر المورفولوجية .

Video: In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

التصوير تستقيم من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; غرف البيض

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

التصوير الكالسيوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; في تنشيط البيض

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

استخدام في فيفو والأنسجة والخلايا Explant نهج لدراسة Morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والولادة

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

قناة Excretory C. ايليجانس كنموذج ل Morphogenesis التجويف داخل الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي في "خلية واحدة": وضع العلامات بالتجارة والنقل-الأنشطار والشاشة التفاعل [رني] والتصوير

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

خلية "التجميع فحوصات" لتقييم ربط الشق المورفولوجية مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

في فيفو تصوير Morphogenesis وتر العضلات في المورفولوجية الخوادر

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

يعيش التصوير لل

التصوير تستقيم من

تحليل

التصوير الكالسيوم في

طويلة الأجل تصوير لايف

استخدام في فيفو والأنسجة والخلايا Explant نهج لدراسة Morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والولادة

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

خلية "التجميع فحوصات" لتقييم ربط الشق المورفولوجية مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس