تتناول هذه الطريقة كيفية تحليل العمليات التنموية مثل تقلصات العضلات والتدوير التي تحدث في جنين دروسوفيليا. بعض مزايا هذه التقنية هي أنها غير اضعة ومفصلة للغاية ، ومع ذلك فهي بسيطة نسبيًا في الأداء. يمكن تطوير أسلوبنا بشكل أكبر للفحص القائم على التحليل عالي المحتوى لعزل وتحليل الطفرات الجديدة التي تؤثر على تقلصات العضلات الجنينية والعمليات التنموية الأخرى.
عند تصور تقلصات العضلات، من المهم أن يتم وقت مجموعات الأجنة بشكل صحيح لأن الانقباضات تبدأ فقط في مرحلة نمو محددة. يمكن أن يساعد العرض التوضيحي المرئي خطوة بخطوة بشكل كبير في التحليل الكمي للعمليات التنموية. للتصوير الحي لأجنة Drosophila المركبة، ضع الأجنة على خشبة مسرح مجهر epifluorescence مع وظيفة timelapse وكاميرا رقمية مع مرشحات الانبعاثات مناسبة واختيار 10X عدسة الهدف غمر المياه.
ثم الفيديو الحي تسجيل الأجنة باستخدام برنامج تسجيل المجهر المناسب لمدة ساعة إلى ساعتين مع معدل اقتناء أربعة إطارات في الثانية الواحدة. في نهاية التجربة، قم بتصدير الفيديو المسجل مباشرة إلى ImageJ. حدد الصورة والمحاصيل لرسم مربع حول كل جنين فردي لاحصد تسجيلات الفيديو إلى حجم كل جنين.
انقر فوق صورة، تحويل وتدوير لتدوير الصور المقتصة لتحقيق موضع عمودي لخط الوسط الجنيني بالنسبة للشاشة. لتعيين قياسات المسافة إلى ميكرومتر، انقر على تحليل وتعيين مقياس، ثم أدخل عامل تحويل نسبة البكسل إلى ميكرون المعروف لإعداد المجهر. ثم يتم الإبلاغ عن جميع القياسات اللاحقة في ميكرومترات.
لتحليل الجنين المتداول، أولاً وضع علامة على موقف واحد أو كل من القصبة الهوائية من الجنين في الإطار الأول من الفيديو في منتصف الطريق بين الطرفين الخلفي والخلفي وانقر فوق تحليل، أدوات ومنطقة من مدير الفائدة. رسم ما يقرب من سبعة ميكرومتر من قبل مربع 7 ميكرومتر حول القصبة الهوائية وانقر فوق مفتاح T على لوحة المفاتيح لتسجيل هذا الموقف كإحداثيات س ص. وضع علامة على موضع نفس المنطقة من القصبة الهوائية بعد تقلصات الاستقبال من الفائدة ورسم خط يربط بين مراكز كل مربع النقر M على لوحة المفاتيح لقياس المسافة من موقف ما قبل الانكماش إلى موقف ما بعد الانكماش.
لتحليل تقلصات العضلات الجنينية باستخدام الأجنة التي تعبر عن علامات العضلات الفلورية، استخدم تسجيل قراءات الفلورسنت لرسم منطقة ذات فائدة تتمحور حول عضلات الفلوريسينغ لجزء معين من الجسم من الاهتمام. حدد علامة التبويب إضافة T في إدارة منطقة الاهتمام لتسجيل موضع المنطقة التي تهمك. انقر فوق إدارة منطقة الاهتمام وقياس لتسجيل متوسط كثافة الفلورسنت لكل منطقة من مناطق الاهتمام المحددة لكل إطار من الفيديو.
نقل مربع إلى مراكز شرائح الجسم الأخرى من الفائدة وانقر فوق إضافة T لتسجيل مواقعها للحصول على مناطق ذات أهمية ذات حجم مماثل في جميع شرائح الجسم ليتم تحليلها. في إدارة منطقة الاهتمام، اضغط على مفتاح التحكم أثناء تحديد كافة المناطق ذات الأهمية المسجلة كإحداثيات س ص. انقر فوق "المزيد" و"قياس متعدد" لقياس متوسط شدة الفلورسنت لكل منطقة ذات أهمية لكافة إطارات الفيديو.
هذا سيتم تقرير كل قياس في جدول مع كل منطقة من مناطق الاهتمام كعمود من الجدول وكل إطار كصف. ثم نقل الجدول إلى برنامج جدول بيانات لمزيد من التحليل. رسم رسم بياني برقم الإطار على المحور س وكثافة الفلورس في محور y وتحويل رقم الإطار إلى وقت باستخدام الإطارات الأربعة لكل معدل إطار ثانية.
تقلصات العضلات زيادة كثافة GFP لأنها تجلب المزيد من GFP في المنطقة المجاورة للمنطقة المحورية كما الحصول على سحب المزيد من العضلات في خلال هذه الانقباضات. لتحديد سعة تقلص العضلات، قم بتقدير كثافة GFP الأساسية كمتوسط كثافة المناطق بين القمم. ثم تقييم الزيادة في كثافة الفلورية GFP نسبة إلى خط الأساس هذا.
ثم تقسيم كل منطقة من قيمة كثافة الفائدة على كثافة خط الأساس لتطبيع كثافة GFP إلى خط الأساس. قارن كثافة GFP تطبيع في الأجزاء الخلفية، والمتوسطة والأجزاء الأمامية خلال موجة تقلص العضلات لدراسة التغيرات في مدى تقلص العضلات كما تنتشر الموجة وتحديد اتجاه الموجة. لمقارنة تقلصات العضلات على الجانبين الأيمن والأيسر من الجنين، وتحليل شدة الذروة لنفس الأجزاء على جانبي الجنين.
استخدام السعة انكماش وتوقيت القمم للكشف عن الاختلافات، إن وجدت، ومدى وتوقيت موجات تقلص العضلات الطموح. هنا تظهر تقلصات العضلات الرادعة الطبيعية في نوع البرية Drosophila الجنين. في هذا الفيديو من المتداول في نوع من الجنين البرية، لاحظ أن الملحق الظهري لا يتحرك في حين أن القصبة الهوائية لا تشير إلى أن الجنين قد تدحرجت داخل قوقعتها.
في هذا التحليل التمثيلي، تمثل قمم تقلص العضلات خلال الفترة الزمنية 165 إلى 178 ثانية موجة أمامية واحدة. بالنسبة لهذا الجنين، لم يتم قياس أي فرق في السعة ووقت تقلصات العضلات على الجانبين الأيمن والأيسر للجنين. ويُعيَّن الانكماش الرادلي كموجة من النوع الأول إلى الأمام إذا كان ملفه الشخصي له ذروة تنشأ في المنطقة الخلفية تليها أولاً قمم في المناطق الوسطى والائلة.
A الخلفية موجة من النوع الأول هو الذروة التي تنشأ أولا في الأجزاء الأمامية ومن ثم ينتشر نحو المناطق الخلفية. نوع اثنين موجات تبدأ في نهاية واحدة من الجنين والمضي قدما نحو المناطق الوسطى قبل العودة إلى أصلها كما موجة كاسحة بدأت من جديد في الطرف المقابل. تظهر الأجنة المتحولة في وضع الجسم ترددًا نسبيًا غير طبيعي من النوع الأول لنوع جيل الموجة الثاني الذي ينتج عنه شذوذ في وضع الجسم المعين كالتواء الجسم أو النمط الظاهري للدوران.
لاستخدام الفلوريسكين كمطالعة لمعلمات تقلص العضلات ، من الضروري استخدام الأجنة مع مراسل في الأنسجة العضلية. ويمكن استخدام هذه الطريقة للتسجيل المتزامن للتقلصات العضلية للعديد من الأجنة، وتقييم الاستجابات لمختلف المحفزات أو الأدوية أو التغيرات البيئية.
