كان يؤيد هذا البحث "المعاهد الوطنية للصحة" (RO1 GM079351 إلى D.K.). ونشكر دوروثيا Godt على نصيحتها مفيدة في تشريح المبيض الخوادر استناداً إلى بلدها الأصلي للبروتوكول. ونشكر أيضا ريلين إيمي لها المساعدة والتعليقات على المخطوطة.

1-اجلايينج
<ol><li>تجمع حوالي عشرة الذكور والإناث خمسة عشر الكبار من الذباب المورفولوجية للنمط الوراثي المطلوب في قنينة الطعام يطير الغنية العادي وتستكمل مع الخميرة. لتجنب الازدحام القنينة، السماح بتفعيل الإناث وضع البيض لمدة لا تزيد على 2 – 4 ح14.</li>
	<li>نقل الكبار من القنينة في قنينة جديدة بالتنصت على القنينة فتح ضد قنينة مختلفة مع الغذاء يطير. السماح للبيض أن تتطور إلى اليرقات في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 أيام.</li>
</ol>2-اختيار الإناث اليرقات
<ol><li>باستخدام فرشاة رطبة غرامة مع شعيرات ناعمة، جعل حركة متجددة مع الفرشاة على طول الجدار القنينة لنقل تجول اليرقات الطور الثالث من القنينة إلى زجاج مليئة بأسنانها جيدا 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). أغسل بقايا الطعام قبالة اليرقات بتحويلها إلى آخر كذلك مليئة ببرنامج تلفزيوني 1 x.</li>
	<li>فصل يرقات الذكور والإناث باستخدام الملقط. تحديد يرقات الذكور بزوج من الخصيتين كبيرة، جولة، وشفافة، جزءا لا يتجزأ من الجسم الدهون الجانب الأفقي للجسم ما يقرب من الثلثين إلى أسفل من النهاية الأمامية في15. الإناث اليرقات في المتوسط أكبر وشفافة أقل من الذكور، وتكون أصغر بكثير من الغدد التناسلية التي أكثر صعوبة للكشف عن.</li>
	<li>حدد ضد يرقات الذكور لجمع الإناث اليرقات. جمع الإناث على الأقل عشرة من البئر. وضع اليرقات الإناث في منفصلة أيضا مليئة ببرنامج تلفزيوني 1 x.</li>
	<li>استخدام الملقط لنقل اليرقات الإناث برفق في قنينة جديدة من المواد الغذائية الطازجة يطير تستكمل مع الخميرة.</li>
	<li>مكان القنينة مع الإناث اليرقات في مكان مظلم لتسهيل بوبارييشن16. وطوال اليوم، رصد اليرقات بوبارييشن. كما يشل كل يرقة ويتطور إلى بريبوبا، دائرة بريبوبا ضد القنينة وسجل الوقت التقريبي عندما تشكل أولاً في بريبوبا. تحديد بريبوباي بنتوء سبيراكليس الأمامي وتوقيت تشكيل بوباريوم17. السماح بريبوباي لوضع نقطة الوقت المطلوب (مقاسة بالساعات بعد تشكيل بوباريوم، الإدارة العامة الاتحادية). ملاحظة: يمكن اعتبار أي الحيوان الذي يخضع تشكيل بوباريوم ضمن فاصل زمني حوالي 10 ح بريبوبا. تبدأ مرحلة الخوادر حوالي 12 ح بعد تشكيل بوباريوم بعد تساقط داخلية قد حدث.</li>
</ol>3-إعداد الخوادر لتلطيخ جسم
<ol><li>
وتشكل بيبيت زجاج رقيقة لاستخدامها في خطوات لاحقة للتخلص من الدهون في الجسم الخوادر.
	<ol>
<li>تذوب تلميح الزجاج بيبيت باستور على موقد بنسن. كما يذوب الزجاج، استخدام الملقط لسحب تلميح أفقياً بعيداً عن بقية بيبيت لتشكيل تلميح أرق.</li>
		<li>وبعد التبريد، قطع جزء صغير من تلميح بيبيت لتشكيل افتتاح دائري أنيق. إرفاق لمبة للنهاية الأخرى بيبيت.</li>
		<li>تحميل بيبيت مع برنامج تلفزيوني 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لحصاد الخوادر، التي يتم لصقها بالجدار القنينة، تطبيق قطره صغيرة من الماء على طول منطقة الاتصال بين عذراء والقنينة. انتظر 1 – 2 دقيقة للسماح للبروتين تذوب الغراء قبل رفع خادرة قبالة الحائط بفرشاة رطبة غرامة بلطف. نقل عذراء لزجاج جيدا مليئة 1 x PBS. أهدى بئر واحدة كل عذراء لتجنب الاكتظاظ شكل جيد.</li>
	<li>الخلفي نهاية الخادرة مع زوج واحد من الملقط، بينما تتشبث بعناية الدموع الجزء الأمامي من القضية الخوادر مع زوج آخر حتى رئيس الخادرة مرئياً.</li>
	<li>قبضة الحافة الأمامية معظم الرأس الخوادر مع الملقط واجذب عذراء من مرافعته الخوادر. ملاحظة: قد تسرب جزء من الجسم الدهون بها أثناء هذه العملية.</li>
	<li>منفصلة وتجاهل النصف الأمامي من عذراء من النصف الخلفي حتى يبقى كيس البطن فقط.</li>
	<li>
استخراج خلايا الجسم الدهون من كيس البطن.
	<ol>
<li>فهم كيس البطن ضد أسفل البئر مع الملقط في يد واحدة بينما يمسك بيبيت الزجاج رقيقة مليئة ببرنامج تلفزيوني 1 x في جهة أخرى.</li>
		<li>وتهدف نصيحة بيبيت رقيقة نحو فتح الكيس وبطء بيبيت 1 x برنامج تلفزيوني في البطن ليغسل الجسم الدهون الخلايا المحيطة المبايض الخوادر. ملاحظة: المبايض هي زوج من هياكل صغيرة وشفافة، striated ومستطيل التي ينبغي أن تبقى داخل كيس البطن.</li>
		<li>يغسل الجسم الدهون الخلايا حتى على الأقل ثلثي الجسم الدهون ذهب أو حتى المبيضين مرئية قرب افتتاح كيس البطن. من المهم جداً تنفيذ هذه الخطوة ببطء حتى لا تتعرض ليغسل المبيض من البطن عن طريق الصدفة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تفحص البئر للتحقق إذا كانت المبايض قد تسرب خلال يغسل خلايا الجسم الدهون. إذا كانت المبايض غير مرئية داخل البئر، قد ظلت في البطن. إذا كان يخرج المبيض، ضع عذراء جديدة في البئر وكرر هذه الخطوة.</li>
	<li>نقل البطن إلى غرفة كوفيرجلاس واضحة مليئة بتثبيت المخزن المؤقت (PBS x 1، 4% بارافورمالدهيد) ووضع الغطاء في الأعلى. لضمان وجود عدد كاف من المبايض تحمل تلطيخ وعملية التركيب، تشريح المبايض أكثر من اللازم. تنبيه: يحتوي المخزن المؤقت التثبيت بارافورمالدهيد سمية. يرجى ارتداء وسائل الحماية المناسبة مثل القفازات، ونظارات السلامة، إلخ.</li>
</ol>4-إيمونوهيستوتشيميستري
<ol><li>طوال عملية المصبوغة، استخدام الملقط لدفع بلطف أسفل أي المبايض عائمة إلى أسفل البئر الزجاج غطاء التأكد من أن المبايض مغمورة تماما في حل جسم.</li>
	<li>مكان يجرد من وجهي الشريط على سطح مسطح من نوتاتور ومن ثم ضع كوفيرجلاس غرف على سطح لاصق.</li>
	<li>احتضان المبايض في المخزن المؤقت للتثبيت من الخطوة 3، 7 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>شطف المبايض ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1 x % 1 X-100 تريتون ل 5 و 10 و 45 دقيقة (ح 1 في المجموع)، على التوالي، للسماح بيرميبيليزيشن شامل.</li>
	<li>كتلة المبيض في مصل الماعز العادي 10% في برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.5% X-100 تريتون لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>احتضان المبايض بين عشية وضحاها في 600 ميليلتر جسم الابتدائية المفضل المخفف بتركيز مناسب في برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.5% X-100 تريتون في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>شطف المبايض ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.5% X-100 تريتون.</li>
	<li>احتضان المبايض عن ح 2 في 600 ميليلتر من جسم الثانوي الاختيار المخفف بتركيز مناسب في برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.5% X-100 تريتون في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>شطف المبايض مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.5% X-100 تريتون ومرة لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1 x.</li>
</ol>5-تشريح وتركيب المبايض الخوادر
<ol><li>ضع قطره صغيرة من برنامج تلفزيوني 1 x إلى شريحة مجهر. استخدام الملقط لنقل كيس البطن من كوفيرجلاس غرف لزجاج مليئة ببرنامج تلفزيوني 1 x. أهدى بئر واحدة كل عذراء لتجنب الاكتظاظ شكل جيد.</li>
	<li>تمزق كيس البطن وأي هيئة الدهون المتبقية مع الملقط. ملاحظة: يجب أن تكون المبايض، وزوج من هياكل صغيرة وشفافة، striated ومستطيل، مرئية داخل البئر. المبايض هي غالباً محكم محاط بالجسم الدهون، ولذلك فمن المهم للتأكد من دقة تمزق جميع الدهون في الجسم عن بعضها البعض.</li>
	<li>نقل المبيض من البئر إلى قطره من 1 x برنامج تلفزيوني في المجهر الشريحة باستيعاب وسط المبايض بين النصائح من الملقط. من المهم جداً استخدام من أحكام قبضتهم دون الضغط على المبايض حتى لا لتفقد أو تدميرها أثناء النقل. إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني 1 x إلى الشريحة عندما يجف الحل مع مرور الوقت.</li>
	<li>مرة واحدة تم تشريح ونقلها إلى الشريحة المجهر، ميليلتر بيبيت 40 متوسطة المتصاعدة على ساترة 22 مم × 22 مم، ومكان ساترة بلطف فوق المبايض المبايض جميع. واسمحوا الشرائح الجافة بين عشية وضحاها قبل التصوير.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Stem+Cell+Niches:+A+Decade+of+Discovery+Suggests+a+United+View+of+Stem+Cell+Regulation.">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Germline+Stem+Cells+in+Drosophila.">The Development of Germline Stem Cells in Drosophila.</a> Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).</li><li>Pearson, J., L&#243;pez-Onieva, L., Rojas-R&#237;os, P., Gonz&#225;les-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+Drosophila+stem+cell+biology.">Recent advances in Drosophila stem cell biology.</a> Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).</li><li>Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells,+wound+healing+and+cancer.">Epithelial stem cells, wound healing and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+myeloid+leukemia:+proving+ground+for+cancer+stem+cells.">Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells.</a> Cell. 119 (3), 314-316 (2004).</li><li>Reilein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+direct+stem+cell+derivatives+defined+by+stem+cell+location+and+graded+Wnt+signaling.">Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling.</a> Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).</li><li>Eliazer, S., Buszczack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+niche:+studies+from+the+Drosophila+ovary.">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).</li><li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+&#224;+brac.">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric &#224; brac.</a> Development. 121 (1), 173-187 (1995).</li><li>King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+female+Drosophila+reproductive+system.">The development of the female Drosophila reproductive system.</a> J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).</li><li>Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pak-regulated+cell+intercalation+event+leading+to+a+novel+radial+cell+polarity+is+involved+in+positioning+of+the+follicle+stem+cell+niche+in+the+Drosophila+ovary.">A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary.</a> Development. 142 (1), 82-91 (2015).</li><li>Irizarry, J., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+supports+Drosophila+fertility+by+regulating+development+of+ovarian+muscle+tissues.">FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues.</a> Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).</li><li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Staining+of+Drosophila+Larval+Ovaries.">Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries.</a> J Vis Exp. (51), e2537 (2011).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER.">The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Courdec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bric+&#224;+brac+locus+consists+of+two+paralagous+genes+encoding+BTB/POZ+domain+proteins+and+acts+as+a+homeotic+and+morphogenetic+regulator+of+imaginal+development+in+Drosophila.">The bric &#224; brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila.</a> Development. 129, 2419-2433 (2002).</li><li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INSECT+FAT+BODY:+ENERGY,+METABOLISM,+AND+REGULATION.">INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).</li><li>Zhang, Y., Xi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+Body+Development+and+its+Function+in+Energy+Storage+and+Nutrient+Sensing+in+Drosophila+melanogaster.">Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster.</a> J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).</li><li>Wong, L. C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+Ovaries.">Dissection of Drosophila Ovaries.</a> J Vis Exp. (1), e52 (2006).</li></ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في إعلان.

أن الخطوة الأكثر صعبة وحرجة من هذا البروتوكول ينطوي على إعداد الخوادر المبايض قبل التثبيت. للتأكد من أن المبايض، صغيرة ودفن بخلايا الجسم الدهون داخل البطن الخوادر، ملطخة بما فيه الكفاية مع الأجسام المضادة، من المهم أن الدموع ليس فقط فتحه كبيرة في كيس البطن بالملقط، ولكن أيضا استخراج خلاي...

بحوث الخلايا الجذعية باستخدام المبايض المورفولوجية وسعت على نطاق واسع منذ أول الوثائق المتعلقة بالخلايا الجذعية المتخصصة1،2،،من34. بعد وضع النسب تتبع الأدوات الوراثية، المبيض المورفولوجية تشريح استخدمت عادة لدراسة الأنساب الخلايا الجذعية، ويشير إلى الممرات التي تنظم صيانة الخلايا الجذعية، والانتشار، ومصير الخلايا الجذعية المتخصصة. قد تسفر عن المعرفة من هذه المسارات إشارات ثاقبة الأسباب المحتملة للسرطانات التي تنشأ من الخلايا الجذعية الشاذة النشاط5،،من67. لقد ثبت مؤخرا أن الخلايا الجذعية الجسدية في المبيض المورفولوجية ، المعروفة باسم الخلايا الجذعية جريب (التابعة)، بقوة تشبه الخلايا الجذعية المعوية الثدييات في جوانب كثيرة من تلك المنظمة8. لهذا السبب، المبايض المورفولوجية نظام نموذج مفيد للغاية لدراسة سلوك الخلايا الجذعية.
بينما المبايض اليرقات والكبار تقديم أدلة للإسراع بتطوير الخلايا الجذعية والمنظمة نهائياً من الخلايا الجذعية في المكانة، على التوالي، المبيض الخوادر هو هيكل وسيطة التي germline وخلايا جسدية إعادة تنظيم وتحديد هوياتهم 9 , 10-على الرغم من أن العديد من الدراسات قد درست جوانب التنمية أنسجة المبيض الخوادر10،11،،من1213، تبقى الأسئلة المتعلقة بالتمايز ومنظمة المكانية أنواع خلية المبيض أثناء تطوير الخوادر. على وجه الخصوص، مواصفات التابعة يحدث خلال هذه الفترة. هذا البروتوكول يحدد طريقة لتشريح وتلطيخ المبايض الخوادر في النقاط الزمنية المطلوبة – تقنية التي يمكن استخدامها في تجارب دورة الوقت أن تحليل التنمية المبيض الخوادر بالتفصيل من اليرقات إلى مرحلة الكبار.
يستخدم هذا البروتوكول لحساب حجم صغير وترانسلوسينسي، وصعوبة الوصول إلى المبيض الخوادر داخل البطن الخوادر، أدوات مثل مصنوعة خصيصا بيبيت باستور رقيقة-يميل إلى إزالة أنسجة الجسم الدهون البطن التي تعرقل وصول الأجسام المضادة المبيض. كوفيرجلاس واضحة، وغرف المستخدمة خلال جسم تلطيخ رؤية عروض أكبر في الخوادر ومنصة الطف لهزاز المبايض في "نوتاتور". بناء على بروتوكول لتشريح المبيض اليرقات ميمون وجلبوا14، استخدمت في الخطوات الأولى للإجراء المصبوغة إلى أقصى حد ممكن الوصول غشاء الخلية بيرميبيليزيشن والأجسام المضادة لتركيزات عالية نسبيا من X-100 تريتون خلايا المبيض.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Forceps, biology</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen</td><td></td></tr><tr><td>9 Depression Glass Spot Plates</td><td>Pyrex</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet bulb</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm glass coverslips No 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine brush #0, #3-#5</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman Starter Kit</td><td>Thomas Scientific</td><td>F167300</td><td>Contains p20, p200, p1000 pipettors</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Dilute to 1x PBS</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>5000121</td><td>Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)</td><td>Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)</td><td>Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Fly vials</td><td>Denville Scientific</td><td>V9406</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Balls, For Wide Vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-102W</td><td></td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>101400</td><td></td></tr><tr><td>Fly food</td><td>Produced in laboratory</td><td></td><td>Mixture of water, brewer&#039;s yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid</td></tr><tr><td>Male and female &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and staining of drosophila pupal ovaries

على عكس الكبار المورفولوجية المبايض، المبايض الخوادر صعبة نسبيا الوصول ودراسة سبب هذه الصغيرة الحجم، وترانسلوسينسي، وغلفت ضمن حالة الخوادر. ويكمن التحدي لتشريح المبايض الخوادر أيضا في موقعها الفعلي داخل الخادرة: المبيض محاطة بخلايا الجسم الدهون داخل البطن الخوادر، ويجب إزالة هذه الخلايا الدهنية للسماح لتلطيخ جسم سليم. للتغلب على هذه التحديات، يستخدم هذا البروتوكول بيبيتس باستور مخصصة لاستخراج خلايا الجسم الدهون من البطن الخوادر. وعلاوة على ذلك، يستخدم كوفيرجلاس غرف بدلاً من أنبوب ميكروسينتريفوجي أثناء عملية المصبوغة لتحسين الرؤية الخوادر. ومع ذلك، على الرغم من هذه المزايا الأخرى للأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول، والتنفيذ الناجح لهذه التقنيات قد تنطوي على لا تزال عدة أيام من الممارسة نظراً لصغر حجم المبايض الخوادر. يمكن تطبيق التقنيات المبينة في هذا البروتوكول على تجارب دورة الوقت الذي يتم تحليل المبايض في مراحل مختلفة من التنمية الخوادر.

ينبغي أن يؤدي تنفيذ هذا الإجراء بنجاح في تلطيخ جسم واضح أن يكشف عن هيكل وتنظيم الخلوية من المبيض الخوادر المورفولوجية . يمكن استخدام إيمونوهيستوتشيميستري المبينة في هذا البروتوكول تحديد أنواع الخلايا الملون عادة في المبايض اليرقات والكبار. خلايا ساق الخوادر المست?...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries at JoVE.com

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

والمبيض المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية المتخصصة التنمية. ولو تم نشر أساليب لتشريح المبايض اليرقات والكبار، تتطلب تشريح المبيض الخوادر التقنيات المختلفة التي لم تنشر بالتفصيل. هنا أننا مخطط بروتوكول لتشريح وتلطيخ، وتصاعد المبايض الخوادر.

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

dissection-and-staining-of-drosophila-pupal-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

9.3K Views.  Columbia University. والمبيض المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية المتخصصة التنمية. ولو تم نشر أساليب لتشريح المبايض اليرقات والكبار، تتطلب تشريح المبيض الخوادر التقنيات المختلفة التي لم تنشر بالتفصيل. هنا أننا مخطط بروتوكول لتشريح وتلطيخ، وتصاعد المبايض ?...

Video: Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection of Drosophila Ovaries

تشريح المبايض ذبابة الفاكهة

Biology

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

التصوير تستقيم من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; غرف البيض

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

تصور آثار الضرر التأسدي على غرف البيض Drosophila باستخدام التصوير الحي

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

التصوير البؤري وفائق الدقة للاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي أثناء تكوين بويضات ذبابة الفاكهة

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

دراسة الميتوكوندريا هيكل وظيفة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المبايض

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

تشريح وإصلاح وتصور ذبابة الفاكهة العذراء Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video