هذا البروتوكول مهم ، لأنه يسمح لك بإجراء الكيمياء النسيجية المناعية على notum من ذبابة الفاكهة ، حتى بعد أن أصيبوا سابقا ، وصورهم الحية ، دون تعطيل بنية الأنسجة. تتيح لك هذه التقنية الاستفادة من المجموعة الواسعة من بقع الأجسام المضادة المتاحة بالفعل لتلطيخ الخلايا والهياكل والبروتينات في ظهارة notum. لقد استخدمنا هذه التقنية للكيمياء المناعية ، وتلطيخ الحمض النووي.
ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا التشريح كنقطة انطلاق لتقنيات أخرى ، مثل التهجين في الموقع. قد يكون هذا البروتوكول صعبا ، لأن الخادرة صغيرة وحساسة ، لذلك يتطلب الأمر يدا ثابتة لإجراء التشريح. ويصبح الأمر أسهل مع الخبرة ، لذلك تدرب على الخادرة غير المهمة قبل تلك المهمة.
ابدأ بإزالة ثلاث إلى أربع شرانق بعناية في المرحلة P5 ، باستخدام منظار تشريح ، وجمعها على شريحة المجهر بجوار الشريط. بعد ذلك ، ضع الشرانق على الأقل عرض خادرة واحدة على حدة ، على الشريط ، مع جوانبها البطنية لأسفل. الآن ، ضع قطرة من الغراء اللاصق على فيلم بارافين ، أو في غطاء أنبوب الطرد المركزي.
بعد ذلك ، اغمس نهاية طرف ماصة من 0.1 إلى 10 ميكرولتر في قطرة الغراء اللاصق ، واضغط على طرف الماصة مرتين على زلة غطاء ، على بعد سنتيمتر واحد في سنتيمتر واحد من الزاوية ، مما يخلق خطا من الغراء اللاصق ، ما يقرب من نصف طول الخادرة. بعد ذلك ، قم بتعيين ماصة P2 مسبقا عند ميكرولترين ، وماصة P200 بحجم 200 ميكرولتر ، وتناسبها مع نصائح. الآن ، أدخل ملقط بالقرب من جانب الرأس ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من علبة التلميذ برفق ، والعمل من الأمام إلى الخلف.
بعد ذلك ، أمسك بأرجل الخادرة النامية ، مع زوج من الملقط الحاد ، واسحب الخادرة بعناية من علبتها. ضع الخادرة في زاوية زلة الغطاء. أمسك الخادرة في الجزء الخلفي من البطن ، أو الجناح النامي ، باستخدام ملقط حاد.
ارفع وضع الجانب البطني من الخادرة لأسفل ، في خط الغراء اللاصق. املأ ماصة P2 بسرعة ، بميكرولترين من PBS أحادي القوة ، تحتوي على 0.1 ملليمولار من الكالسيوم ، واحتفظ بها في الهواء ، وطرد ما يكفي لتشكيل فقاعة صغيرة عند الطرف. المس الفقاعة الصغيرة للمحلول ، إلى جانب واحد من الخادرة عند قاعدة الصدر ، ثم كرر الإجراء على الجانب الآخر.
بعد ذلك ، املأ ماصة P200 ، ب 200 ميكرولتر من PBS أحادي القوة ، مع 0.1 ملليمولار من الكالسيوم ، ثم ضع طرف الماصة فوق الصدر ، واطرد المحتويات لغمر الشرانق تماما ، وسوف يتصلب ما تبقى من الغراء اللاصق على الفور. الآن ، قم بإزالة ما يقرب من 100 ميكرولتر من محلول PBS ، بحيث بالكاد يتم غمر الخادرة ، قبل المتابعة الفورية إلى الخطوة التالية. لتشريح النوتوم، أمسك بزوج من مقص التشريح الدقيق، واستعد جانبا واحدا من المقبض ضد السبابة والإصبع الأوسط لليد المهيمنة، بحيث يطبق إبهام اليد المهيمنة قوة القطع.
بعد ذلك ، قم بتثبيت عنق المقص ضد الإصبع الأوسط لليد غير المهيمنة ، مع تجهيز انزلاق الغطاء ، باستخدام إصبع البنصر لليد غير المهيمنة. الآن ، قص في منتصف البطن الظهري لإنشاء ثقب صغير من حوالي 0.2 إلى 0.5 ملم. لعزل الأنسجة الظهرية ، قم بعمل قطع صغيرة من 0.5 إلى 0.75 ملم من خلال التكامل ، من الخلف إلى الأمام ، وفي النهاية ، ستطوق الأنسجة الظهرية.
علاوة على ذلك ، كرر الجروح الخلفية إلى الأمامية على الجانب الآخر من الشرانق. قم بتدوير مرحلة التشريح ، للسماح بقطع نظيف عبر الرأس إذا لزم الأمر. حدد ما إذا كان قد تم عزل notum ، من خلال معرفة ما إذا كان يتم تحريكه بسهولة.
أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من PBS أحادي القوة إلى وسط انزلاق الغطاء ، وقم بإنشاء قناة تربطها بقطرة التشريح الأصلية ، عن طريق سحب طرف الماصة برفق عبر زجاج الغطاء ، من القطرة الجديدة إلى القطرة الأصلية. باستخدام زوج من الملقط الحاد ، ادفع أو اسحب بلطف النوتوم المعزول إلى وسط الغطاء وانزلق واستدار ، بحيث يواجه الجانب الداخلي لأعلى. امسك النوتوم لأسفل باستخدام ملقط حاد ، عن طريق الضغط على قسم البطن أو الرأس.
باستخدام زوج من الملقط الحاد والطرد اللطيف ل PBS أحادي القوة ، من ماصة 200 ميكرولتر ، قم بإزالة أي جسم دهني متبقي أو عصابات عضلية أو رفع الهيمو ، لفضح الظهارة أحادية الطبقة بالكامل. بمجرد تنظيف الأنسجة ، استخدم ماصة 200 ميكرولتر لإزالة أكبر قدر ممكن من محلول PBS ، مع المراقبة باستخدام نطاق التشريح ، لتجنب استنشاق النوتوم. بعد إزالة السائل إلى أقصى حد ، استخدم منديلا ماصا ، لمسح بقية الغراء اللاصق بعناية ، وجثة حدقة العين ، وغيرها من الحطام الموجود على زلة الغطاء.
الآن ، أضف 150 إلى 200 ميكرولتر من 4٪ PFA ، وقم بإصلاحه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. واعتمادا على سرعة التشريح ، يمكن تشريح واحد إلى ثلاثة شرانق أخرى ، أثناء تثبيت الخادرة الأولى على زلات غطاء منفصلة. قم بإزالة PFA ، واستبدله ب PBS أحادي القوة ، لغسل notum مرة واحدة لمدة 30 ثانية.
إذا استمر في تلطيخ الأجسام المضادة ، فقم بإجراء ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق ، في PBS أو PBST أحادي القوة ، لتخلل الأنسجة إذا كان المستضد داخل الخلايا. يمكن تخزين العينة في PBS أحادي القوة ، مع 0.02٪ من أزيد الصوديوم بين عشية وضحاها في غرفة رطبة. بعد التلطيخ ، قم بإعداد قسيمة غطاء جديدة يشار إليها باسم الطبقة العلوية ، مع دعامات.
قم بإنشاء فجوة تبلغ حوالي 200 ميكرومتر ، باستخدام فواصل مصنوعة من 22 × 22 زلة غطاء ، على بعد سنتيمتر واحد تقريبا ، في منتصف الجزء العلوي. للالتصاق ، قم بطلاء التماس الفاصل الأبعد عن المركز ، بطبقة رقيقة من طلاء الأظافر ، ثم اتركه يجف. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول المائي من العينة ، وقم على الفور بتطبيق قطرتين من وسط التركيب المضاد للتلاشي على العينة.
إذا لزم الأمر، استخدم ملقط حاد نظيف لوضع النوتوم في مركز القطيرات المتوسطة المقاومة للتلاشي. ضع الغطاء مع النوتوم، على دعامة رغوة 10 × 40 ملم تقريبا لرفع العينة حتى لا تلتصق بسطح العمل. تحت نطاق التشريح ، اخفض الجزء العلوي ببطء على العينة.
بمجرد أن يلتقي وسط التركيب المضاد للتلاشي بالجزء العلوي ، حرره بلطف ، واسمح للعمل الشعري بسحب الجزء العلوي لأسفل. ضع قطعة أخرى من الرغوة على الجزء العلوي ، واستخدم شريحة مجهر قياسية كوزن ، لإقناع وسط التركيب المضاد للتلاشي بلطف بين زلة غطاء العينة ، والجزء العلوي ، والفواصل. بعد 5-10 دقائق، استخدم منديلا ماصا للتخلص من أي وسيط تركيب زائد مضاد للتلاشي، عن طريق لمس حواف الغطاء برفق.
ضعي طلاء الأظافر بلطف على كل ركن من أركان الغطاء للالتصاق بهما معا. لمنع انزلاق الغطاء من التحول وإتلاف الأنسجة الظهرية ، تجنب حواف الطلاء أولا ، وبمجرد أن يجف طلاء الأظافر في الزوايا ، قم بطلاء جميع حواف الغطاء لينزلق لإغلاقه. يسمح هذا البروتوكول بتصوير العينات الثابتة، باستخدام الأجسام المضادة والبقع الخلوية.
يمكن استخدام هذا البروتوكول على العينات التي سبق أن أصيبت بجروح وتم تصويرها مباشرة. تظهر المقارنة بين الصور الحية والثابتة أن البروتوكول يحافظ على بنية الأنسجة والمورفولوجيا. يسمح البروتوكول بوجهات نظر مختلفة لفكرة تشريحية.
يعد المنظر القمي مثاليا لتصور حدود الخلايا الظهارية والنوى ، أسفل البشرة. يكشف العرض القاعدي بشكل أفضل عن الهياكل القاعدية على هامش الجرح. تأكد من عدم ثني أو تشويه النغمة أثناء التشريح.
قطع قطعة مسطحة عن طريق تجنب الحواف الجانبية. لا تقطع بالقرب من الجوانب البطنية ، وإلا فسوف تتشوه أثناء التركيب. بعد تشريح حدقة العين ، يمكن تطبيق العديد من التقنيات الأخرى ، مثل المجهر الإلكتروني والمقطع العرضي.
يمكن أن تسمح هذه التقنيات بالتحقيق في الهياكل المصورة سابقا بتفصيل هائل.
