وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية.

1. اليوم 1 قبل البدء : ينبغي الحفاظ على صحة السكان من الذباب باستخدام بروتوكولات زراعة القياسية : إزالة البالغين من زجاجات أو قوارير بعد 3-4 أيام من وضع البيض ، والسماح التنمية والمضي قدما في درجة حرارة ثابتة حتى يتجول 3 اليرقات طور مرحلي بدء pupariation الثالثة. يتم وضع علامة على انتقال اليرقات / العذراء قبل تشكيل prepupae (نظرت 0 بعد ساعات من تشكيل puparium - APF). وتتميز الشرانق متحركة من كبار السن الشرانق التي تلون بها من البيض واليرقات التي لم تبدأ بعد pupariation التي مستطيل وشكلها مستدير ، وبروز لspiracles الأمامي. ستحتاج إلى : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرشاة طلاء لجمع الشرانق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء غرفة رطبة لزراعة الشرانق : طبق بيتري اصطف مع منشفة ورقية مرطبة ومغطاة رقة الترشيح ملحوظا لنقاط زمنية مختلفة من التركيب الوراثي ، وجمع أو الجنس من الشرانق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لغسل الشرانق </li></ul> جمع وزراعة والتدريج الشرانق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفرشاة المبللة إزالة بلطف 0hr APF الشرانق من زجاجات ثقافة / قنينات ووضعها في غطاء حجرة رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة الرسام وبرنامج تلفزيوني 1X غسل بلطف لإزالة الحطام الشرانق من القضية خادرة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان ضروريا لفرز الشرانق حسب نوع الجنس. يمكن استخدام primordia الغدد التناسلية من الشرانق لفرز الجنسين. وprimordia التناسلية الذكور هي زوج من الأقراص الشفافة الوحشي ينظر اليه بسهولة من خلال ما يقرب من إهاب العذراء 03/02 باستمرار طول الجسم 5. وprimordia التناسلية الأنثى هي أصغر وليس تحديدها بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشرانق في الموقف المسمى بشكل مناسب في الغرفة الرطبة والعودة الى درجة حرارة ثابتة. الثقافة إلى نقطة زمنية التنموية المناسبة. </li></ol> 2. 2 اليوم : تشريح وتثبيت الحضانة والابتدائي الأضداد قبل البدء : ستحتاج إلى : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح stereomicroscope </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملقط جراحي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبضع الجراحة مع رقم 11 ريش </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اثنين من الاكتئاب الزجاج تسعة أطباق جيدا (كورنينج المنتج # 7220-85) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تملأ الآبار من صحن واحد مع 1X PBS : هذا هو الطبق الشطف لتنظيف الشرانق تشريح </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق من الآبار الثانية مع العازلة التثبيت </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغرفة الرطبة للحضانة الأضداد. نستخدم صناديق بلاستيكية شطيرة اغلاقها باحكام اصطف مع المناشف الورقية المبللة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة التثبيت : 1X PBS ، بارافورمالدهيد 4 ٪ ، وحمض deoxycholic 0.2 ٪ (على permeabilization) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منصة التشريح : مسح شريحة المجهر مع قطعة من الشريط على الوجهين انضمت الى جانب واحد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P100 P200 أو pipettor </li></ul> تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط إزالة بلطف one الشرانق في وقت ووضعها على منصة التشريح مع نهاية الأمامي من الشرانق التي تواجه أوسع عرض الشريط. إذا الشرانق والرطب بشكل مفرط ، أولا وصمة عار لهم الجافة باستخدام منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الشرانق انضمت تماما على الشريط ، واستخدام الفرشاة لوضع لهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للعذارى في الهواء الجاف والتمسك الشريط (5-10 دقائق) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مشرط الجراحة تشريح كل الشرانق ثنائيا. هذا هو أفضل إنجاز مع خفض سريع واحد من الأمام إلى نهاية الخلفي من الشرانق. إذا فعلت بشكل صحيح ، فإن خفض شطر الأمامية والخلفية على حد سواء spiracles أزواج. تشريح لا يزيد عن 10 الشرانق في وقت والغسيل والتنظيف العينات بسرعة اللازمة لمنع الضرر للبروتين الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة الرسام ، ونقل كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني 1X لكل الشرانق تشريح للتخفيف عليهم من الشريط. </li></ol> التنظيف ، وتثبيت الحضانة والابتدائي الأضداد <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج من ملقط الجراحة فهم نصف خادرة الفردية الأمامية وتزج فورا في بئر للطبق الشطف. ينبغي الاستعاضة عن منصة التشريح بواسطة الطبق الشطف على المسرح المجهر. وينبغي أن يترك القضية الشرانق على العينة حتى يتم استكمال تجهيز العينات وتكون جاهزة للتركيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين لا يزال يمسك النصف خادرة استخدام pipettor لغسل بلطف بعيدا الأنسجة الداخلية من البطن. يمكن الضغط كثيرا أثناء الغسل تؤدي إلى فقدان الخلايا الظهارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل على الفور النصف خادرة نظيفة لتثبيت العازلة في درجة حرارة الغرفة وعملية الباقية نصفين خادرة بالمثل. مع أن الممارسة ، تشريح وغسل نصفي خادرة 20 تستغرق أقل من 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لاحتضان الشرانق في تثبيت العازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 (واحد) ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الشرانق 3X الثابتة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني 1X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تتم معالجتها على الفور عينات لالمناعية أو قد تكون مخزنة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر دون فقدان الخلايا أو التفاعل حاتمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتخزين العينات وعينات تتوازن من خلال تخفيفسلسلة من برنامج تلفزيوني : EtOH (3:1 ، 1:1 ، 1:3) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في كل تمييع قبل الانتقال إلى EtOH 100 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تكون العينات إعادة معايرتها في برنامج تلفزيوني من خلال سلسلة لعكس قبل معالجة المناعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة العينات في برنامج تلفزيوني 1X (تستكمل مع ألبومين المصل البقري 2 ٪) لمدة 1 (واحد) قبل ساعة بالإضافة إلى الأجسام المضادة الأولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الأولية المخفف الى التركيز المناسب في برنامج تلفزيوني 1X طوال الليل في 4 درجات مئوية دون هزاز. </li></ol> 3. يوم 3 : الحضانة الضد الثانوي ، التركيب والتصوير قبل البدء : ستحتاج إلى : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اثنين ملقط جراحي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصاعد وسائل الإعلام (الجلسرين ، Vectashield [المتجهات مختبرات] ، أو Slowfade الذهب [Invitrogen]) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاكتئاب جيدا الشرائح المجهر (0.8 ملم) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips (24 × 40 ملم) </li></ul> الثانوية حضانة الأضداد وتصاعد : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات 3X 10 دقيقة مع كل برنامج تلفزيوني 1X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة العينات في برنامج تلفزيوني 1X (تستكمل مع ألبومين المصل البقري 2 ٪) لمدة 1 (واحد) قبل ساعة بالإضافة إلى الأجسام المضادة الثانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف إلى التركيز المناسب في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة في الظلام لساعات دون هزاز (ثلاثة) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات 3X 10 دقيقة مع كل برنامج تلفزيوني 1X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان ذلك مناسبا ، ملون مباين الشرانق (مثال صمة عار علينا النوى مع دابي [4 &#39;،6 - diamidino - 2 - phenylindole] مخففة في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن العينات (لا تقل عن 30 دقيقة) في وسائل الإعلام المناسبة قبل التركيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شريحة العينة. في التشكل من الشرانق يمنع تصاعد مسطحة. هي التي شنت في البئر عينات من شريحة الاكتئاب (الشريحة قطرة) للتصوير. 75 100ul مكان من وسائل الإعلام في تصاعد الاكتئاب أيضا. يمكن تركيب عدة عينات على شريحة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب إزالة حالة خادرة من العينات قبل التركيب. فهم حالة الفرد خادرة يجري الأمامية تأكد من عدم فهم الغشاء الداخلي العذراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الزوج الثاني من ملقط فهم بلطف الغشاء الداخلي العذراء من قبل رئيس وإزالته من حالة العذراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل على الفور إلى عينة من الاكتئاب وكذلك متابعة معالجة عينات إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط أو موقف المسبار عينات بشكل موحد في الاكتئاب جيدا مع السطح الوحشي مواجهة. ويمكن إزالة فقاعات الهواء في بعض الأحيان مع التحقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض بلطف ساترة على العينات مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء </li></ol> 4. ممثل النتائج : إعداد العينات باستخدام هذا البروتوكول الإبقاء على التشكل الإجمالي من البطن الكبار. قد يكون من المتوقع مداخن الصورة لتوليد صورة ثنائية الأبعاد أو جعلها 3 - D يمكن تطبيقها لتحقيق طوبولوجيا البطن. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. وكانت تصور في 26 ساعة بعد تشكيل puparium (APF) مع الماوس المضادة للWG (4D4 : أيوا ورم هجين البنك الدولي) : منتجات التجزئة في جينات ذبابة الفاكهة البروتين الشرانق مجنح والتعبير Engrailed (UAS - GFP اون gal4). ومكافحة GFP. التكبير 10x ، هو الأمامي الأيسر والظهري متروك. وcounterstained Nucleii مع دابي. وكان من المتوقع حوالي 50 رزمة من الصور (ΔZ بين شرائح غير 2.5μm).

<ol>
	<li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila.">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Matsuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Morphology+and+evolution+of+the+insect+abdomen.">in Morphology and evolution of the insect abdomen.</a> , (1976).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster.">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويمكن استخدام التقنيات المعروضة في هذا الفيديو لإعداد عذارى ذبابة الفاكهة من مجموعة متنوعة من النقاط الزمنية التنموية. الشرانق معالجتها خلال الفترة من 24 ساعة إلى 32 ساعة APF APF هي الأكثر عرضة لفقدان الخلية من الظهارة. استخدام المنظفات (مثل 100 - X تريتون وتوين 20) خلال الخطوات حضانة طويلة يزيد من احتمال فقدان الخلية وبالتالي لا يوصى. بدلا من ذلك ، يتم استخدام حمض deoxycholic باعتبارها خطوة المنظفات خلال التثبيت الأولي. يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في برنامج تلفزيوني 1X دون المنظفات. بالإضافة إلى ذلك ، هزاز عينات خلال الخطوات حضانة طويلة يزيد من فقدان الخلية ويجب تجنبها. ولا يمكن تصوير العينات باستخدام تقنيات الفحص المجهري متحد البؤر. ويمكن أيضا ومع ذلك ، ذبابة الفاكهة الشرانق معالجتها كما هو موضح يمكن تصوير المجهري باستخدام الإضاءة هيكلة النظام العائد جودة الصورة مشابهة لتقنيات مبائر.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح stereomicroscope </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملقط جراحي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبضع الجراحة مع رقم 11 ريش </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كذلك تسعة أطباق الاكتئاب الزجاج (كورنينج المنتج # 7220-85) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غرفة رطبة لزراعة الشرانق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 11 مشرط جراحي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريط على الوجهين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة التثبيت : 1X PBS ، بارافورمالدهيد 4 ٪ ، وحمض deoxycholic 0.2 ٪ (على permeabilization) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P100 P200 أو pipettor </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاكتئاب جيدا الشرائح المجهر (0.8 ملم) </li></ul>

drosophila pupal abdomen immunohistochemistry

بطن العذراء ذبابة الفاكهة هو نظام أنشئ نموذج لدراسة التشكل الظهارة وتطوير morphologies جنسيا ديمبرافيك 1-3. خلال pupation ، الذي يمتد نحو 96 ساعة (عند 25 درجة مئوية) ، والسكان من الخلايا المتكاثرة تخيلي استبدال البشرة اليرقات لإنشاء شرائح البالغين في البطن. تخيلي هذه الخلايا ، ولدت خلال مرحلة التطور الجنيني ، كما توجد أزواج الوحشي للأعشاش أرومة منسجة في كل جزء من البطن اليرقات. أربعة أزواج من أعشاش أرومة منسجة تؤدي إلى إهاب الظهرية الكبار (أعشاش الظهري الأمامي والخلفي) ، وإهاب بطني (أعشاش بطني) وspiracles المرتبطة بكل قطعة (منتفس أعشاش) 4. puparation على هذه الخلايا مضاعفا (مميزة من حيث حجم أكبر من اليرقات المتعددة الصبغيات موظفين المدنيين المحليين خلايا البشرة) بدء عملية النمطية للهجرة ، والانتشار واستبدال موظفين المدنيين المحليين. ويمكن استخدام مختلف الأدوات الجزيئية والجينية للتحقيق في مسارات مساهمات الجينية التي تساهم في التشكل من البطن الكبار. عادة يتم تحليل الظواهر الكبار النهائي تشريح التالية من البشرة البطن الكبار. ومع ذلك ، والتحقيق في العمليات الجزيئية الكامنة وراء يتطلب تحليلات المناعى للظهارة العذراء ، والتي تشكل تحديات فريدة من نوعها. زمنيا التشكل الحيوي والتفاعلات من المجموعتين السكانيتين الظهارية مميزة (اليرقات وتخيلي) توليد الأنسجة الهشة عرضة لفقدان الخلية المفرطة خلال تشريح ومعالجة لاحقة. وقد طورنا أساليب التشريح ، التثبيت ، وتصاعد والتصوير من ذبابة الفاكهة abdominem ظهارة العذراء للدراسات المناعى التي تولد متسقة عينات عالية الجودة مناسبة لالمجهري الفلورسنت مبائر أو القياسية.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry at JoVE.com

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

تلوين الأجسام المضادة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الشرانق يمكن تعزيز التحليلات الجينية الوراثة الكبار التنموية في البطن. نقدم لدينا بروتوكول تلطيخ تشريح ، وتثبيت الأجسام المضادة للنظم<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البطن العذراء.

ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

16.2K Views.  University of Alabama. تلوين الأجسام المضادة من ذبابة الفاكهة الشرانق يمكن تعزيز التحليلات الجينية الوراثة الكبار التنموية في البطن. نقدم لدينا بروتوكول تلطيخ تشريح ، وتثبيت الأجسام المضادة للنظم ذبابة الفاكهة البطن العذراء.

Video: Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Sectioning رقيقة من الاستعدادات لشريحة المناعية

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ hybridizations, a mainstay of developmental biology, are useful to study the spatial and temporal patterns of gene expression in developing tissues at the level of transcription. If antibodies that target the protein products of gene transcription have not yet been developed, and/or there are multiple gene copies of a particular protein in the genome that cannot be differentiated using available antibodies, in situs can be used instead. While an in situ technique for larval wing discs has been available to the butterfly community for several years, the current protocol has been optimized for the larger and more fragile pupal wings.

In order to examine gene expression in the pupal wing tissue of Bicyclus anynana, we present an optimized protocol for in situ hybridizations using riboprobes. We also provide guidelines for the further optimization of this protocol for use in pupal wings of other Lepidopteran species.

في البروتوكول الموقع للأجنحة الفراشة العذراء طريق Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

المناعية : أقسام البارافين باستخدام ABC Vectastain مجموعة من مختبرات المتجهات

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

المناعية على أقسام البارافين للبشرة باستخدام الماوس أجسام نيون

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

بروتوكول الأمثل لإعداد Wholemount الشبكية للتصوير والمناعية

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

التصوير من خلال حالة العذراء من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

فيفو السابقين الثقافة من ذبابة الفاكهة العذراء خصية واحدة ذكر الخراجات جرثومة خط: تشريح، التصوير، والمعالجة الدوائية

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

تشريح وتركيب<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء أقراص العين

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.