Cette recherche a été financée par les National Institutes of Health (GM079351 RO1 à D.K.). Nous remercions Dorothea Godt pour ses conseils utiles sur des dissections ovaire pupal basé sur son protocole original. Nous remercions également Amy Reilein pour son aide et les commentaires sur le manuscrit.

1. EggLaying
<ol><li>Mélanger environ dix hommes et quinze femelles adultes drosophile mouches du génotype désiré dans un flacon de nourriture normale de mouche riche additionné de levure. Pour éviter le surpeuplement de la fiole, permettent des femelles accouplées à pondre pour pas plus de 2 à 4 h14.</li>
	<li>Transférer les adultes à partir du flacon dans un flacon de nouveau en tapant sur le flacon d’ouverture contre un flacon différent avec de la nourriture volée. Laissez les oeufs deviennent des larves à température ambiante pendant 3 à 4 jours.</li>
</ol>2. sélection des larves femelles
<ol><li>À l’aide d’un pinceau humide de poils doux, faire un mouvement de roulement avec la brosse le long de la paroi du flacon pour transférer des larves de troisième stade errants dans le flacon à un verre bien rempli à ras bord 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Lavez les débris de nourriture au large de la larve en transférant vers un autre bien remplis avec du PBS 1 x.</li>
	<li>Séparer les larves mâles et femelles avec une pincette. Identifier les larves mâles par une paire de testicules grands, rond et translucides, intégrée dans les corps gras sur le côté latéral du corps environ deux-tiers vers le bas de son extrémité antérieure15. Les larves femelles sont en moyenne plus gros, moins translucide que les hommes et ont des gonades plus petites qui sont plus difficiles à détecter.</li>
	<li>Choisir contre les larves mâles pour recueillir les larves femelles. Recueillir au moins dix femelles du puits. Placez les larves femelles dans un autre bien rempli avec du PBS 1 x.</li>
	<li>Utilisation de forceps pour transférer les larves femelles doucement dans un nouveau flacon de lindustrie alimentaire des produits mouche additionné de levure.</li>
	<li>Placez le flacon avec les larves femelles dans un endroit sombre afin de faciliter le puparium16. Tout au long de la journée, surveiller les larves pour puparium. Comme chaque larve immobilise et se développe en un prepupa, entourez le prépupale contre le flacon et enregistrer le temps approximatif quand il forme tout d’abord dans un prepupa. Identifier les prénymphes par la saillie du stigmate antérieur et le calendrier du puparium formation17. Laissez les prénymphes de développer jusqu’au délai souhaité (mesurée en heures après la formation du puparium, CSA). Remarque : Tous les animaux qui subissent une formation puparium dans un intervalle environ 10 h peuvent être considéré comme un prepupa. Le stade pupal commence environ 12 h après la formation du puparium après qu’une mue interne a eu lieu.</li>
</ol>3. préparation des nymphes pour la coloration des anticorps
<ol><li>
Former une pipette de verre mince pour être utilisé dans les étapes ultérieures de compensation sur le tissu adipeux pupal.
	<ol>
<li>Faire fondre le bout de verre d’une pipette Pasteur au-dessus d’un brûleur Bunsen. Comme le verre fond, utilisez pince pour tirer la pointe horizontalement, loin du reste de la pipette pour former une pointe plus fine.</li>
		<li>Après refroidissement, casser une petite portion de l’extrémité de la pipette pour former une ouverture circulaire soignée. Fixez une ampoule à l’autre extrémité de la pipette.</li>
		<li>Charger la pipette avec du PBS 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour récolter les nymphes, qui sont collées à la paroi du flacon, appliquer une petite goutte d’eau le long de la zone de contact entre la pupe et la flacon. Attendre 1 à 2 min de la protéine de laisser la colle se dissolvent avant de soulever délicatement la nymphe sur le mur avec un pinceau humide. Transférer la nymphe à un verre bien remplie de solution 1 PBS x. Dédiez un puits unique par chrysalide pour éviter la surpopulation du puits.</li>
	<li>Tout en tenant l’extrémité postérieure de la nymphe avec une paire de pinces, déchirez soigneusement la portion antérieure de la pupe avec une autre paire jusqu'à ce que la tête de la nymphe est visible.</li>
	<li>Saisissez l’extrémité antérieure plus de la tête de nymphe avec une pince et tirer doucement la chrysalide hors de sa pupe. Remarque : Une partie du tissu adipeux peut déborder au cours de ce processus.</li>
	<li>Séparer et jeter la moitié antérieure de la nymphe de la moitié postérieure, jusqu'à ce que seulement le sac abdominal reste.</li>
	<li>
Extraire les cellules du tissu adipeux de la housse abdominale.
	<ol>
<li>Saisir le sac abdominal contre le fond du puits avec une pince d’une main tout en tenant la pipette de verre mince remplie de PBS 1 x dans une autre main.</li>
		<li>Viser l’embout de la pipette mince vers l’ouverture du sac et PBS 1 x pipet lentement dans l’abdomen pour évacuer les cellules du tissu adipeux entourant les ovaires nymphales. Remarque : Les ovaires sont une paire de petites, translucides, striés et oblongues des structures qui devraient rester à l’intérieur du sac abdominal.</li>
		<li>Laver que le tissu adipeux cellules jusqu'à ce qu’au moins deux-tiers du tissu adipeux est allé ou jusqu'à ce que les ovaires sont visibles près de l’ouverture du sac abdominal. Il est très important d’exécuter cette étape lentement pour ne pas laver les ovaires hors de l’abdomen par accident.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Examiner le puits pour vérifier si les ovaires ont renversé lors du lavage de cellule de corps gras. Si les ovaires ne sont pas visibles à l’intérieur du puits, ils aurait dû rester dans l’abdomen. Si les ovaires sont sortis, placez une chrysalide nouvelle dans le puits et répétez cette étape.</li>
	<li>Transférer l’abdomen dans une chambre de lamelle clairement remplie de tampon de fixation (1 x PBS, paraformaldéhyde à 4 %) et placer le couvercle sur le dessus. Pour assurer un nombre suffisant d’ovaires résister à la coloration et le processus de montage, disséquer les ovaires plus que nécessaire. ATTENTION : Le tampon de fixation contient paraformaldéhyde qui est toxique. Veuillez porter des protections appropriées telles que des gants, des lunettes de sécurité, etc..</li>
</ol>4. immunohistochimie
<ol><li>Tout au long du processus de coloration, utilisez pince pour pousser doucement vers le bas les ovaires flottants au fond du puits lamelle couvre-objet pour s’assurer que les ovaires soient complètement immergées dans la solution d’anticorps.</li>
	<li>Place des bandes de ruban adhésif double-face sur la surface plane d’une Nutator et placez ensuite la lamelle compartimentée sur la surface adhésive.</li>
	<li>Incuber les ovaires dans le tampon de fixation de l’étape 3,7 à température ambiante pendant 15 minutes.</li>
	<li>Rincer les ovaires trois fois dans du PBS 1 x 1 % X-100 Triton pour 5, 10 et 45 minutes (1 h au total), respectivement, pour permettre la perméabilisation approfondie.</li>
	<li>Bloquer les ovaires dans 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS 1 x 0,5 % Triton X-100 pendant 30 min.</li>
	<li>Incuber les ovaires du jour au lendemain en 600 µL d’anticorps primaire de choix dilué à la concentration appropriée dans du PBS 1 x 0,5 % Triton X-100 à 4 ° C.</li>
	<li>Rincer les ovaires trois fois pendant 5 min dans du PBS 1 x 0,5 % X-100 Triton.</li>
	<li>Incuber les ovaires pendant 2 h dans 600 µL d’anticorps secondaire de choix diluée à la concentration appropriée dans du PBS 1 x 0,5 % Triton X-100 à température ambiante.</li>
	<li>Rincer les ovaires deux fois pendant 5 min dans du PBS 1 x 0,5 % Triton X-100 et une fois pendant 5 min dans du PBS 1 x.</li>
</ol>5. dissection et ovaires pupes de montage
<ol><li>Placez une petite goutte de PBS 1 x sur une lame de microscope. Utilisation de forceps pour transférer le sac abdominal de la lamelle compartimentée à un verre bien rempli de PBS 1 x. Dédiez un puits unique par chrysalide pour éviter la surpopulation du puits.</li>
	<li>Déchirer le sac abdominal et n’importe quel corps gras restantes avec une pince. Remarque : Les ovaires, qui soient caractérisent par des structures petites, translucides, striés et oblongues, devraient être visibles à l’intérieur du puits. Les ovaires sont souvent étroitement entourés par le tissu adipeux, il est donc important de s’assurer que tous les corps gras est complètement déchiré dehors.</li>
	<li>Transférer les ovaires du puits dans la goutte de 1 x PBS sur le microscope slide en saisissant le Centre des ovaires entre les extrémités de la pince. Il est très important d’utiliser une prise ferme sans serrer les ovaires afin de ne pas de perdre ou de les détruire au cours du transfert. Ajouter quelques gouttes de PBS 1 x à la diapositive lorsque la solution s’assèche au fil du temps.</li>
	<li>Une fois que tous les ovaires ont été disséqués et transférés à la lame de microscope, ajouter 40 µL de milieu de montage sur une lamelle de 22 x 22 mm et place la lamelle doucement sur les ovaires. Laisser la lame sécher pendant la nuit avant l’imagerie.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Stem+Cell+Niches:+A+Decade+of+Discovery+Suggests+a+United+View+of+Stem+Cell+Regulation.">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Dansereau, D. 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L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INSECT+FAT+BODY:+ENERGY,+METABOLISM,+AND+REGULATION.">INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).</li><li>Zhang, Y., Xi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+Body+Development+and+its+Function+in+Energy+Storage+and+Nutrient+Sensing+in+Drosophila+melanogaster.">Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster.</a> J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).</li><li>Wong, L. C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+Ovaries.">Dissection of Drosophila Ovaries.</a> J Vis Exp. (1), e52 (2006).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

L’étape la plus critique et difficile du présent protocole nécessite la préparation des pupes ovaires avant la fixation. Pour s’assurer que les ovaires, petits et enterrées par les cellules de corps gras à l’intérieur de l’abdomen pupal, sont suffisamment colorées avec les anticorps, il est important de larme non seulement une grande ouverture dans le sac abdominale avec une pince, mais aussi extraire les cellules de corps gras qui obstruent les ovaires de l’anticorps. L’exécution réussie de cette ?...

Recherche sur les cellules souches utilisant drosophile ovaires a largement augmenté depuis la première documentation d’une cellule souche niche1,2,3,4. Suit l’évolution des outils génétiques du traçage de lignage, drosophile ovaire dissections ont été couramment utilisées pour étudier des lignées de cellules souches et les voies qui régulent la maintenance des cellules souches, la prolifération et sort dans la niche de cellules souches de signalisation. Connaissance de ces voies de signalisation peut-être donner un aperçu des causes possibles des cancers qui proviennent des cellules souches aberrantes activité5,6,7. Il a récemment été démontré que les cellules souches somatiques dans l’ovaire de la drosophile , appelées cellules souches de follicule (FSC), ressemblent fortement aux mammifères les cellules souches intestinales dans de nombreux aspects de leur organisation8. Pour cette raison, les ovaires de drosophile sont un système modèle hautement utile pour étudier le comportement des cellules souches.
Alors que les ovaires larvaires et adultes offrent des indices de développement précoce de cellules souches et l’organisation de la finale des cellules souches dans la niche, respectivement, l’ovaire pupal est une structure intermédiaire, dans lequel les cellules germinales et les cellules somatiques réorganiser et d’établir leur identité 9 , 10. bien que plusieurs études ont examiné des aspects du développement des tissus dans l’ovaire pupal10,11,12,13, questions subsistent quant à la différenciation et l’organisation spatiale des types de cellules ovariennes au cours du développement de pupe. En particulier, la spécification du FSC se produit pendant cette période. Ce protocole décrit une méthode de dissection et coloration des pupes ovaires aux moments désirés — une technique qui peut être utilisée dans des expériences de cours temps qui analysent le développement de pupes ovarien en détail de du stade larvaire au stade adulte.
Pour expliquer la petite taille, translucidité et inaccessibilité de l’ovaire pupe dans l’abdomen de pupe, ce protocole utilise des outils tels qu’une pipette de Pasteur à pointe fine sur mesure pour enlever le tissu adipeux abdominal entrave l’accès d’anticorps à la ovaires. Une lamelle de claire, chambrée utilisée au cours de l’anticorps coloration offre une plus grande visibilité de la pupe et une plateforme plus douce balancement des ovaires sur un « Nutator ». Basé sur un protocole pour les dissections de larves ovaire de Maimon et Gilboa14, une concentration relativement élevée de Triton X-100 a été utilisée dans les premières étapes de la procédure de marquage pour maximiser l’accès perméabilisation et anticorps de membrane cellulaire à la cellules ovariennes.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Forceps, biology</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen</td><td></td></tr><tr><td>9 Depression Glass Spot Plates</td><td>Pyrex</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet bulb</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm glass coverslips No 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine brush #0, #3-#5</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman Starter Kit</td><td>Thomas Scientific</td><td>F167300</td><td>Contains p20, p200, p1000 pipettors</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Dilute to 1x PBS</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>5000121</td><td>Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)</td><td>Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)</td><td>Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Fly vials</td><td>Denville Scientific</td><td>V9406</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Balls, For Wide Vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-102W</td><td></td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>101400</td><td></td></tr><tr><td>Fly food</td><td>Produced in laboratory</td><td></td><td>Mixture of water, brewer&#039;s yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid</td></tr><tr><td>Male and female &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and staining of drosophila pupal ovaries

Contrairement aux ovaires de drosophile adultes, ovaires nymphales sont relativement difficiles d’accès et examiner en raison de leur petite taille, la translucidité et moulant au sein de la pupe. Le défi de disséquer les ovaires nymphales réside aussi dans leur emplacement physique au sein de la chrysalide : les ovaires sont entourées par des cellules de corps gras à l’intérieur de l’abdomen pupal, et ces cellules adipeuses doivent être enlevés pour permettre une bonne anticorps. Pour surmonter ces défis, ce protocole utilise des pipettes Pasteur personnalisés afin d’extraire les cellules du tissu adipeux de l’abdomen pupal. En outre, une lamelle compartimentée est utilisée à la place d’un tube de microcentrifuge pendant le processus de coloration pour améliorer la visibilité de la pupe. Cependant, malgré ces et d’autres avantages des outils utilisés dans le présent protocole, l’exécution réussie de ces techniques peut nécessiter encore plusieurs jours de pratique en raison de la petite taille des ovaires nymphales. Les techniques décrites dans le présent protocole pourraient être appliquées à des expériences de cours moment où ovaires sont analysés à différents stades de développement de pupe.

L’exécution réussie de cette procédure devrait se traduire par anticorps clair coloration qui révèle la structure et l’organisation cellulaire d’un ovaire de pupes de drosophile . Immunohistochemistry décrite dans le présent protocole peut être utilisé pour identifier les types de cellule couramment teintés ovaires larvaires et adultes. Les cellules de la tige de pupe dérivé essaim cellules18 (contour blanc par Fasciclin III) sont indiqu?...

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Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

L’ovaire de la drosophile est un système excellent modèle pour étudier le développement de niche de cellules souches. Bien que les méthodes pour disséquer les ovaires larvaires et adultes ont été publiées, les dissections ovaires nymphales exigent d’autres techniques qui n’ont pas été publiées en détail. Ici, nous exposons un protocole de dissection, coloration et montage des ovaires nymphales.

Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

dissection-and-staining-of-drosophila-pupal-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

9.3K vues.  Columbia University. L’ovaire de la drosophile est un système excellent modèle pour étudier le développement de niche de cellules souches. Bien que les méthodes pour disséquer les ovaires larvaires et adultes ont été publiées, les dissections ovaires nymphales exigent d’autres techniques qui n’ont pas été publiées en détail. Ici, nous exposons un protocole de dissection, coloration et montage des ovaires nymphales.

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Dissection of Drosophila Ovaries

Dissection des ovaires chez la drosophile

Recherche

Biologie

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Imagerie Montant du<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambres d&#39;oeufs

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Biologie du développement

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

Visualisation des effets des dommages oxydatifs sur les chambres d&apos;oeufs Drosophila à l&apos;aide de l&apos;imagerie en direct

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Imagerie confocale et super-résolution du trafic intracellulaire polarisé et de la sécrétion de protéines de la membrane basale au cours de l’oogenèse de la drosophile

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection et la coloration des Drosophile Ovaires larvaires

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

L&#39;immunohistochimie drosophile Abdomen Nymphe

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Étudier mitochondrial Structure et fonction<em&gt; Drosophila</em&gt; ovaires

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Disséquer, fixer et visualiser la nymphe de la drosophile Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal

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Dissection des ovaires chez la drosophile

Imagerie Montant du

Visualisation des effets des dommages oxydatifs sur les chambres d'oeufs Drosophila à l'aide de l'imagerie en direct

Imagerie confocale et super-résolution du trafic intracellulaire polarisé et de la sécrétion de protéines de la membrane basale au cours de l’oogenèse de la drosophile

Dissection et la coloration des Drosophile Ovaires larvaires

L'immunohistochimie drosophile Abdomen Nymphe

Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de

Étudier mitochondrial Structure et fonction

Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila

Disséquer, fixer et visualiser la nymphe de la drosophile Notum