이 연구는 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 대표이사 (RO1 GM079351). 우리는 그녀의 원래 프로토콜에 따라 번데기 난소 해에 그녀의 유용한 조언에 대 한 Dorothea 좋음 감사 합니다. 우리는 또한 그녀의 지원 및 원고에 대 한 의견에 대 한에 이미 Reilein 감사합니다.

1입니다. EggLaying
<ol><li>결합 약 10 남자와 정상적인 풍부한 비행 음식 효 모와 보충의 유리병에 원하는 유전자의 15 여성 성인 초파리 파리. 유리병과 밀을 피하기 위해, 성관계 여성 더 이상 보다 2-4 h14에 대 한 계란을 낳을 수 없습니다.</li>
	<li>비행 음식 다른 유리병에 대 한 열기는 유리병을 활용 하 여 새로운 병으로 유리병에서 성인 전송. 계란 3-4 일 동안 실 온에서 애벌레로 개발을 허용 합니다.</li>
</ol>2. 여성 애벌레를 선택
<ol><li>소프트로 촉촉한 좋은 브러시를 사용 하 여, 잘 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 가득한 테두리에 유리를 유리병에서 방황 3 탈피 애벌레를 전송 유리병의 벽을 따라 브러시와 롤링 운동을 확인 합니다. 1 x PBS 가득 잘 다른 그들을 전송 하 여 애벌레에서 음식을 파편을 씻어.</li>
	<li>남성과 여성의 애벌레 집게를 사용 하 여 구분 합니다. 남성 애벌레, 라운드, 크고 반투명 testes의 앞쪽 끝15에서 아래로 몸 약 2/3의 측면 쪽에 뚱뚱한 몸에 포함 된의 쌍을 확인 합니다. 여성 애벌레 평균에 더 큰, 남성, 보다 덜 반투명 고 훨씬 작은 생식 선을 검출 하기가 더 어렵습니다.</li>
	<li>여성 애벌레를 수집 남성 애벌레에 대 한 선택 합니다. 우물에서 적어도 10 여성을 수집 합니다. 1 x PBS 잘 가득 별도 여성 애벌레를 놓습니다.</li>
	<li>부드럽게 신선한 비행 식품의 새로운 유리병에 여성 애벌레를 전송 집게를 사용 누 룩과 보충.</li>
	<li>Pupariation16을 촉진 하기 위하여 어두운 위치에서 여성 애벌레와 유리병을 놓습니다. 하루 동안, pupariation에 대 한 애벌레를 모니터링 합니다. 각 유 충 움직이게 하 고는 prepupa로 개발 하 고, 원형 유리병에 대 한 prepupa 고 때 처음에 prepupa 형성 하는 대략적인 시간을 기록 합니다. 앞쪽 spiracles의 돌출 및 puparium 형성17의 타이밍에 의해 prepupae를 식별 합니다. Prepupae (puparium 형성, APF 후 시간 측정) 원하는 시간 정도로 개발을 허용 합니다. 참고: 약 10 h 간격 내에서 puparium 형성을 받 다 어떤 동물 든 지 여겨질 수 있다는 prepupa. 자리를 차지 하는 내부 탈피 후 번데기 단계 puparium 형성 후 약 12 h를 시작 합니다.</li>
</ol>3. 항 체 얼룩이 Pupae 준비
<ol><li>
번데기 뚱뚱한 몸을 비운 나중 단계에서 사용 되는 얇은 유리 피펫으로 형성 합니다.
	<ol>
<li>분 젠 버너에 파스퇴르 피펫으로의 유리 팁을 녹여. 유리가 녹으면 집게를 사용 하 여 얇은 팁을 피펫으로의 나머지에서 가로로 팁을.</li>
		<li>냉각 후, 깔끔한 원형 개통을 형성을 피펫으로 팁의 일부를 끊다. 전구는 피펫으로의 다른 쪽 끝에 연결 합니다.</li>
		<li>1 x PBS와 피펫으로 로드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유리병의 벽에 붙어 있다, pupae 수확 번데기와 유리병 사이의 접촉 영역에 따라 물 작은 방울을 적용 합니다. 단백질 수 있도록 1-2 분을 대기 접착제를 부드럽게 촉촉한 괜 찮 브러시와 벽에서 번데기를 해제 하기 전에 해산. 1 x PBS 가득 잘 유리에 번데기를 전송 합니다. 우물과 밀을 피하기 위해 번데기 당 단일 잘을 칩니다.</li>
	<li>한 쌍의 집게와 번데기의 후부 끝을 잡고, 번데기의 머리 표시 될 때까지 신중 하 게 다른 쌍 번데기 케이스의 앞쪽 부분을 눈물.</li>
	<li>집게와 번데기 머리의 앞쪽 대부분 팁을 부드럽게 당겨 번데기는 번데기 케이스에서. 참고: 뚱뚱한 몸 부분의이 과정 밖으로 유출 수 있습니다.</li>
	<li>하 고 복 부 자루만 남아 때까지 후부 반에서 번데기의 앞쪽 절반을 삭제 합니다.</li>
	<li>
복 부 자루에서 뚱뚱한 몸 세포를 추출 합니다.
	<ol>
<li>얇은 유리 피펫으로 1 x PBS 다른 손에 가득 들고 한 손에 집게와 우물의 바닥에 대 한 복 부 자루를 파악.</li>
		<li>번데기 난소 주변의 지방 신체 세포를 씻어 하 복 부에 자루와 천천히 피펫으로 1 x PBS의 개통으로 얇은 피펫으로 팁을 목표로 합니다. 참고: 난소는 한 쌍의 작은, 반투명, 전기, 및 직사각형 구조를 복 자루 안에 남아 있어야 한다.</li>
		<li>뚱뚱한 몸 세포 지방 시체의 2/3 이상 사라질 때까지 또는 난소 복 자루의 개통의 가까이 볼 수 있습니다 때까지 씻어. 그것은 매우 천천히이 단계를 실행 하는 것이 중요 사고에 의해 복 부 로부터 난소를 씻어 수 없습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>난소 뚱뚱한 몸을 셀 세척 하는 동안 밖으로 유출가지고 확인을 잘을 검사 합니다. 난소 안에 잘 볼 수 있다면, 그들은 복 부에 남아 있다 한다. 경우 난소 밖으로 서, 새로운 번데기에 잘 놓고이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>고정 버퍼 (1 x PBS, 4 %paraformaldehyde)으로 가득 분명 coverglass 챔버로 복 부를 전송 하 고 상단에는 뚜껑을 배치. 되도록 난소의 충분 한 수 견딜 얼룩 및 장착 과정 보다 더 많은 난소를 해 부. 주의: 고정 버퍼 paraformaldehyde 독성을 포함 합니다. 적절 한 보호 장갑, 안전 안경, 등등을 착용 하십시오.</li>
</ol>4입니다. Immunohistochemistry
<ol><li>착 색 과정을 통해 집게를 사용 하 여 부드럽게 밀어 어떤 부동 난소는 덮개 유리의 바닥에 난소 항 체 솔루션에 완전히 몰입 하는 보장 하기 위해.</li>
	<li>장소는 Nutator의 평평한 표면에 양면 테이프의 스트립 하 고 연 발된 coverglass 접착 표면에 장소.</li>
	<li>실 온에서 15 분 동안 3.7 단계에서 고정 버퍼에서 난소를 품 어.</li>
	<li>난소를 씻어 3 시간 1 %1 x PBS에 Triton X-100 5, 10, 및 45 분 (총에서 1 시간), 각각, 철저 한 permeabilization 수 있도록.</li>
	<li>1 x PBS 0.5%에서 10% 정상 염소 혈 청에서 난소를 차단 30 분 대 한 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>600에서 난소를 밤새 품 어 선택의 1 차적인 항 체의 µ L 희석 0.5%와 1 x PBS에 적절 한 농도에 4 ° c.에 트라이 톤 X-100</li>
	<li>1 x PBS 0.5%에서 3 시간 5 분 동안 난소 린스 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>선택의 이차 항 체의 600 µ L에 2 h 0.5%와 1 x PBS에 적절 한 농도를 희석 Triton X-100 실내 온도에 대 한 난소를 품 어.</li>
	<li>1 x PBS 0.5% 트라이 톤 X-100와 1 x PBS에 5 분 동안 한 번에에서 5 분 동안 두 번 난소를 씻어.</li>
</ol>5. 해 부하 고 번데기 난소를 장착
<ol><li>현미경 슬라이드에 1 x PBS의 작은 방울을 배치 합니다. 복 부 자루에서 연 발된 coverglass 유리 잘 전송 사용 집게 1 x PBS 가득 합니다. 우물과 밀을 피하기 위해 번데기 당 단일 잘을 칩니다.</li>
	<li>찢 어 떨어져 복 부 자루 및 모든 나머지 지방 시체 집게와. 참고: 작은, 반투명, 전기, 및 직사각형 구조는, 난소는 우물 안에 표시 되어야 합니다. 난소는 종종 밀접 하 게 지방 기관에 의해 포위, 모든 뚱뚱한 몸을 철저 하 게 늘 확인 하는 것이 중요 하다 그래서 떨어져.</li>
	<li>1 x는 집게의 끝 사이 난소의 중심을 파악 하 여 슬라이드를 현미경에 PBS의 드롭에 우물에서 난소를 전송. 그것은 매우 잃을 또는 전송 하는 동안 그들을 파괴 하는 것을 그렇게 하지 않도록 난소를 압박 하지 않고 확고 한 그립을 사용 하는 것이 중요. 솔루션을 시간이 지남에 밖으로 마르면 때 슬라이드에 1 x PBS의 몇 방울을 추가 합니다.</li>
	<li>일단 모든 난소는 해 부 하 고 현미경 슬라이드, 피펫으로 40 µ L 22 x 22 mm coverslip 장소 난소 위에 부드럽게 coverslip에 장착 매체의 전송. 슬라이드 이미징 전에 하룻밤을 건조 하 게.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Stem+Cell+Niches:+A+Decade+of+Discovery+Suggests+a+United+View+of+Stem+Cell+Regulation.">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Dansereau, D. 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(1), e52 (2006).</li></ol>

저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 프로토콜의 가장 중요 하 고 어려운 단계 고정 전에 번데기 난소의 준비를 포함 한다. 작고 뚱뚱한 몸 세포 번데기 복 부 내부에 의해 묻혀 난소 항 체와 함께 충분히 스테인드은,이 뿐만 아니라 복 부 자루에 큰 여 겸 자, 함께 눈물 하지만 방해 하는 뚱뚱한 몸을 셀 추출 하는 것이 중요 합니다 항 체에서의 난소 이 단계를 성공적으로 실행 해야 복 부 자루에서 뚱뚱한 몸 세포를 세척 하는 동안 ...

줄기 세포 연구 초파리 난소를 사용 하 여 줄기 세포 틈새1,2,,34의 첫 번째 문서부터 널리 확장 했다. 개발 도구의 계보 추적 유전자 초파리 난소 해 일반적으로 줄기 세포 계보를 연구 하는 데 사용 되었습니다 다음 하 고 줄기 세포 유지, 확산, 및 운명 줄기 세포 틈새에 경로 신호. 이러한 신호 통로의 지식 탈 선 줄기 세포 활동5,,67에서 발생 하는 암의 잠재적인 원인에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 그것은 또한 최근 여 포 줄기 세포 (FSCs)로 알려진 초파리 난소에서 체세포 줄기 세포 강하게 그들의 조직8의 여러 측면에서 포유류 장 줄기 세포를 닮은 표시 되었습니다. 이러한 이유로, 초파리 난소는 줄기 세포 행동을 공부 하기 위한 매우 유용한 모델 시스템.
이른 줄기 세포 개발 및 틈새, 마지막 줄기 세포 조직에 단서를 각각 제공 하는 애벌레와 성인 난소 번데기 난소는 생식 및 체세포 재구성 및 그들의 정체성을 확립 하는 중간 구조 9 , 10. 여러 연구 번데기 난소10,11,,1213에 조직 개발의 측면 검사, 질문 남아 있다 분화와 공간 조직에 관한 난소 세포 유형 번데기 개발 중. 특히, FSCs의 규격은이 기간 동안 발생합니다. 이 프로토콜 설명 해 부하 고 원하는 시간 지점에서 번데기 난소를 얼룩이 지는 방법-성인 단계를 자세하게는 애벌레에서 번데기 난소 개발 분석 시간 과정 실험에 사용할 수 있는 기술.
작은 크기, 반투명, 및 번데기 복 부 내에서 번데기 난소의 어려움에 대 한 계정,이 프로토콜 활용 도구 주문 품 얇은 밀고 파스퇴르 피펫으로 복 부 지방을 신체 조직에 항 체 접근을 방해를 제거 하는 난소입니다. 명확 하 고, 연 발 coverglass 번데기와 락는 "Nutator"에 난소에 gentler 플랫폼의 제공 더 큰 시야를 얼룩이 지는 항 체 중에 사용 마이몬과 Gilboa14애벌레 난소 해에 대 한 프로토콜에 따라, Triton X-100의 상대적으로 높은 농도 고용 착 절차의 초기 단계에서 세포 막 permeabilization 및 항 체에 대 한 액세스를 극대화 하는 난소 세포입니다.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Forceps, biology</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen</td><td></td></tr><tr><td>9 Depression Glass Spot Plates</td><td>Pyrex</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet bulb</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm glass coverslips No 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine brush #0, #3-#5</td><td>Various vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman Starter Kit</td><td>Thomas Scientific</td><td>F167300</td><td>Contains p20, p200, p1000 pipettors</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Dilute to 1x PBS</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>5000121</td><td>Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)</td><td>Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)</td><td>Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td><td></td><td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td></tr><tr><td>Fly vials</td><td>Denville Scientific</td><td>V9406</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Balls, For Wide Vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-102W</td><td></td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>101400</td><td></td></tr><tr><td>Fly food</td><td>Produced in laboratory</td><td></td><td>Mixture of water, brewer&#039;s yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid</td></tr><tr><td>Male and female &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and staining of drosophila pupal ovaries

성인 초파리 난소와 달리 번데기 난소는 상대적으로 어려운 액세스 하 여 검사 때문에 그들의 작은 크기, 반투명, 번데기 케이스 내 인. 번데기 난소를 해 부의 도전 또한 번데기 내의 그들의 물리적 위치에 속 인 다: 난소 번데기 복 부 내부 지방 신체 세포로 둘러싸여 있으며, 적절 한 항 체 얼룩이 지기 수 있도록 이러한 지방 세포를 제거 해야 합니다. 이러한 문제를 해결 하려면이 프로토콜 번데기 복 부에서 지방을 신체 세포를 추출 하는 사용자 지정 된 파스퇴르 pipets를 사용 합니다. 또한, 연 발된 coverglass 대신 사용 된다 microcentrifuge 튜브 착 과정 중 번데기의 가시성을 개선 하기 위해. 그러나, 이들과 다른 장점이이 프로토콜에 사용 되는 툴,에 불구 하 고 이러한 기술의 성공적인 실행 될 수 있습니다 여전히 번데기 난소의 작은 크기로 인해 연습의 몇 일. 이 프로토콜에서 설명 하는 기술은 난소 번데기 개발의 다양 한 단계에서 분석 하는 시간 과정 실험에 적용할 수 있습니다.

이 절차의 성공적인 실행 명확한 항 체는 그 구조와 초파리 번데기 난소의 세포 조직 얼룩 발생 한다. 이 프로토콜에서 설명 Immunohistochemistry 애벌레와 성인 난소에 얼룩진 일반적으로 셀 형식을 식별 하 사용할 수 있습니다. 셀에서 파생 된 번데기 줄기의 메뚜기 세포18 (흰색에서 Fasciclin III에 의해 제시 된)는 그림 3에 표시 됩...

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Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

9.3K 조회수.  Columbia University. Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.

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Dissection of Drosophila Ovaries

Drosophila 난소의 해부

연구

생물학

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

의 수직 이미지<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 챔버

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

발생학

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

라이브 이미징을 사용하여 Drosophila 계란 챔버에 산화 손상의 효과 시각화

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

초 파리 Oogenesis 동안 양극화 된 세포 내 밀매 및 기저막 단백질의 분비의 공초점 및 수퍼 해상도 이미징

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

해부 그리고 스테 이닝 Drosophila 애벌레 난소

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서<em&gt; 초파리</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구<em&gt; 초파리</em&gt; 난소

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Drosophila Pupal Notum 해부, 고정 및 시각화

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

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