ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فيروس نقص المناعة البشرية، مثل تحديد محددات انتقال الفيروس والتهيئات المرضية في اثنين من أكثر الأعضاء إصابة بالعدوى. في الواقع، فإن تطور مرض القيادة المتقدمة الرئيسية يحدث في الأنسجة. وتنعكس خصائص وتعقيدات العدوى بشكل سيئ من قبل الخلايا في الدورة الدموية أو معزولة والمصابة في المختبر.
الميزة الرئيسية لثقافة الأنسجة الحية السابقة لدراسة مرض فيروس نقص المناعة البشرية هو أنه يحتفظ بعلاقاتها الأصلية spacial والوظيفية بين الخلايا على الرغم من أن لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. للبدء، ملء 100 ميلمتر من قبل 20 ملليمتر طبق بيتري مع 20 إلى 30 ملليلتر من CMT. نقل الإسفنج الجيلاتين في طبق بيتري باستخدام ملقط معقمة.
الرطب الإسفنج على كلا الجانبين والسماح للإسفنج لامتصاص المتوسطة لمدة دقيقة واحدة. اضغط على الإسفنج ضد الجزء السفلي من طبق بيتري لمدة دقيقتين تقريبا باستخدام ملعقة معقمة. استخدام مقص معقمة لقطع الإسفنج الجيلاتين rehydrated إلى قطع متساوية الحجم من حوالي سنتيمتر مربع واحد.
ثم استخدام ملقط لنقل قطعة واحدة من الإسفنج في كل بئر من لوحة الثقافة. إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من CMT في كل بئر من لوحة 6-جيدا اللوزتين وميليلتر واحد في بئر في لوحة 12 جيدا لرشق الرحم. ضع اللوحات في الحاضنة، التي تم تعيينها عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وأكبر من أو تساوي رطوبة 90٪، حتى تكون الأنسجة جاهزة للتحميل على الإسفنج.
نقل اللوزتين من حاوية النقل إلى 100 ملليمتر طبق بيتري تحتوي على 10 إلى 20 ملليلتر من CMT باستخدام ملقط معقمة. استخدم غطاء طبق بيتري كسطح قطع لتشريح الأنسجة. عقد الأنسجة بلطف مع ملقط، وقطع كل لوزة إلى قطع مختلفة، كبيرة باستخدام مشرط عقيمة وشفرة.
استخدام ملقط ومشرط لإزالة الكي، والأنسجة الدموية، والأورام الليفية، فضلا عن أي أجزاء تحتوي على tonsilloliths أو اللون البني المخضر. قطع كل قطعة الأنسجة إلى شرائح من حوالي مليمترين في سمك. إزالة أي جزء غير مرغوب فيه كما في الخطوة السابقة.
ثم قطع شرائح الأنسجة إلى شرائط بسمك 2 مليمتر. وأخيراً، قطع شرائط الأنسجة إلى كتل بسمك 2 مليمتر. نقل explants في طبق جديد من 100 ملليمتر بيتري يحتوي على 10 إلى 20 ملليلتر من CMT لتجنب جفاف الأنسجة أثناء المضي قدما في تشريح.
في نهاية التشريح، دوامة لوحة لتعشية توزيع explant. ضع تسعة أنسجة على رأس كل إسفنجة الجيلاتين في لوحة 6-جيدا باستخدام ملقط، مما يسمح الفضاء بينهما. أعيدوا الأطباق إلى الحاضنة.
عادة، يتم زراعة explants بين عشية وضحاها. يتم إجراء التلقيح مع فيروس نقص المناعة البشرية في اليوم التالي. هذا هو للتأكد من أن أي تلوث البكتيرية أو الفطرية يتطور في الثقافة.
أيضا، الخلايا تميل إلى تراجع الأنسجة explants مباشرة بعد تشريح. استلهم الوسط في لوحة 6-جيدا مع ماصة، والتخلص منه في وعاء مع محلول مطهر. إمالة لوحة ودفع بلطف الإسفنج الجيلاتين إلى الجزء العلوي من البئر للسماح للوسط لجمع في الجزء السفلي.
التعرق وتجاهل المتوسطة. ثم إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من CMT إلى كل بئر. الآن ذوبان إعداد فيروس نقص المناعة البشرية-1 في حمام الماء في 37 درجة مئوية.
Pipette الفيروس inoculum مباشرة على رأس كل من 9 explants على الإسفنج الجيلاتين. أعيدوا الصحن إلى الحاضنة. استخدم غطاء طبق بيتري كسطح قطع لتشريح الأنسجة.
عقد الأنسجة بلطف مع ملقط، وفصل الغشاء المخاطي لل ectocervix و / أو endocervix من تحت السترومال و submucosa مع مشرط وشفرة للحصول على شرائط من الغشاء المخاطي. قطع الغشاء المخاطي إلى شرائط بعرض 2 ملليمتر. إزالة والتخلص من أكبر قدر ممكن submucosa، وترك فقط طبقة من الأنسجة سمكها 2 ملليمتر.
ثم قطع الشرائط إلى كتل بسمك 2 مليمتر. نقل الأنسجة explants في جديد 100 ملليمتر بتري طبق يحتوي على 10 إلى 20 ملليلتر من CMT لتجنب جفاف الأنسجة أثناء المضي قدما في تشريح. في نهاية التشريح، دوامة لوحة لتعشية توزيع explant.
مع ملقط معقمة، ونقل explants في أنابيب مخروطية معقم 1.5 ملليلتر. إزالة أي وسيلة في أنبوب باستخدام ماصة. للحصول على أفضل النتائج، يجب معالجة explants من عنق الرحم والمصابين في أقرب وقت ممكن بعد الجراحة، ومن الناحية المثالية يوم الجراحة.
بدلا من ذلك، يمكن تخزين الأنسجة المغمورة في CMT في 4 درجات بين عشية وضحاها والمصابة مباشرة بعد تشريح. اذيب إعداد فيروس نقص المناعة البشرية-1 في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. بمجرد إذابة، نقل الفيروس إلى الأنابيب التي تحتوي على explants.
نقل الأنابيب إلى شكل حراري، واحتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية هزاز في 300 دورة في الدقيقة. عكس بلطف الأنابيب عدة مرات كل 30 إلى 60 دقيقة. وفي الوقت نفسه، ملء لوحة 6-جيدا مع ثلاثة إلى أربعة ملليلتر في بئر من الفوسفات المعقم المالحة المخزنة.
في نهاية الحضانة مع فيروس نقص المناعة البشرية-1، واستخدام ماصة للتخلص من جميع إعداد الفيروس في الأنابيب التي تحتوي على explants في حاوية مع محلول مطهر. ثم استخدام ملقط وماصة لنقل explants في لوحة 6-جيدا تحتوي على برنامج تلفزيوني. بعد السماح explants للراحة في برنامج تلفزيوني لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وغسلها عن طريق الأنابيب بلطف برنامج تلفزيوني صعودا وهبوطا في البئر مرتين إلى ثلاث مرات.
ثم تجاهل برنامج تلفزيوني في وعاء مع محلول مطهر باستخدام ماصة. إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد لكل بئر. كرر مرتين أكثر لمجموع ثلاثة يغسل.
تجاهل برنامج تلفزيوني فقط قبل نقل explants إلى الإسفنج لتجنب جفاف الأنسجة. الآن استخدام ملقط لنقل خمسة إلى ثمانية explants على رأس كل الإسفنج الجيلاتين في لوحة 12 جيدا. أعيدوا الصحن إلى الحاضنة.
جمع عينة من المتوسطة الثقافة مع ماصة، ونقلها إلى العقيمة 1.5 أو اثنين من أنابيب غطاء المسمار ملليلتر للتخزين في ناقص 80 درجة مئوية. حصاد النسيج explants مع ملقط معقمة، ونقل explants إلى العقيمة 1.5 أو اثنين من أنابيب غطاء المسمار ملليلتر. معالجة أو تخزين عينات الأنسجة كما هو مطلوب من التجربة.
استلهمي الوسيلة الثقافية المتبقية في البئر مع ماصة، وتجاهلها في حاوية مع محلول مطهر. إمالة لوحة ودفع بلطف الإسفنج الجيلاتين إلى الجزء العلوي من البئر للسماح للوسط لجمع في الجزء السفلي، ومن ثم التعرق وتجاهله. الآن إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من الثقافة المتوسطة لكل بئر.
باستخدام ملقط معقمة، والعودة أي explants الأنسجة التي سقطت في المتوسطة إلى الاسفنج الجيلاتين قبل إعادة لوحة إلى الحاضنة. وفي نهاية هذه الاستزراع، التخلص من جميع النفايات البيولوجية في حاويات نفايات مقرها وفقاً للوائح المعهد بشأن مناولة المواد البيولوجية الخطرة وكذلك تقييم المخاطر المحددة. يمكن أن تؤثر التقلبات بين المانحين على تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1 كما يقاس بتركيز هفوة البروتين الأساسي P24 في زراعة الأنسجة المستفِدَة، كما هو مُبيَّن بالنسبة لأنسجة عنق الرحم من ثلاثة مانحين مختلفين مصابين بنفس الفيروس المُصابين بالفيروس نفسه.
بالنسبة للمتبرع الأول، فإن تراكم هفوة p24 في الوسط الثقافي للطاردات المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 BaL وحدها يشير بوضوح إلى عدوى المنتج. وقد استخدم دواء 3TC المضاد للفيروسات العكوسة الذي يلغي تماماً تكرار الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية كمكافحة سلبية. كمية هفوة p24 تقاس في الوسط ثقافة explants المعالجة 3TC يكشف عن جزء من الفيروس استيعابها بشكل خاص وأفرج عنه من قبل explants الأنسجة أثناء الزرع.
في الأنسجة explants من المتبرع الثاني، يؤدي عدوى الأمعاء HIV-1 إلى انخفاض مطرد في تركيز هفوة P24 بمرور الوقت، مما يشير إلى إجهاض العدوى أو لا يمكن اكتشافها بواسطة الكم الكم الكمومي p24. وهذا ما يؤكده 3TC- المعالجة السيطرة explants التي تظهر حركية مماثلة تكرار فيروس نقص المناعة البشرية. عدوى الأنسجة explants من المانح الثالث غلة كمية قليلة من الفيروس.
في هذه الحالة، إدراج العلاج 3TC كمكافحة سلبية ضروري للتأكد من وجود العدوى مع إنتاج فيروس دي نوفو. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق تحليلية مثل تدفق الخلايا أو المناعة في نقاط زمنية مختلفة للإجابة على أسئلة حول النمط الظاهري، نسبة، أو موقع الأنسجة من السكان الخلية من الفائدة. وعند تصميم التجربة، من المهم تقدير أثر التباين بين المانحين على القراءة التجريبية المختارة.
ويمكن السيطرة على التباين بين المانحين جزئياً عن طريق وضع معايير صارمة للإدماج والاستبعاد السريريين، وربما التجريبيين. يمكن استخدام الثقافات السابقة الأنسجة البشرية vivo لدراسة التسبب في الميكروبات غير فيروس نقص المناعة البشرية، مثل فيروس التشنج أو فيروس الهربس. كما أنها تستخدم كمنصة قبل التخصصات للمواد المضادة للميكروبات ودراسات الأخلاقيات.
يرجى أن تكون على علم بأن جميع العينات البشرية، حتى من الأفراد الأصحاء، يمكن أن تؤوي العوامل المعدية. التعليم المناسب، والتدريب، والحماية مطلوبة للتعامل مع الأنسجة البشرية لضمان سلامة لكم وزملاء العمل.
