שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האיידס, כגון זיהוי של הקובעים של העברת וירוסים ופתוגנזה בתוך שניים מהאיברים המשפיעים ביותר על ידי הזיהום. למעשה, התקדמות מחלות הנהיגה המתקדמת העיקרית מתרחשת ברקמות. התכונות והמורכבות של זיהום משתקפים בצורה גרועה על ידי תאים במחזור או מבודדים ונדבקים במבחנה.
היתרון העיקרי של תרבות הרקמה ex vivo ללמוד פתוגנזה HIV היא שהיא שומרת על היחסים המקוריים שלה spacial ופונקציונלי בין תאים למרות במשך שבועיים עד שלושה שבועות. כדי להתחיל, למלא 100 מילמטר על ידי 20 מילימטר צלחת פטרי עם 20 עד 30 מיליליטר של CMT. להעביר ספוגי ג'לטין לתוך צלחת פטרי באמצעות ממטרים סטריליים.
הרטיבו את הספוגים משני הצדדים ואפשרו לספוג לספוג בינוני למשך דקה אחת. לחץ את הספוגים על החלק התחתון של צלחת פטרי במשך כשתי דקות באמצעות מרית סטרילית. השתמש מספריים סטריליים לחתוך את ספוגי ג'לטין rehydrated לחתיכות בגודל שווה של כ סנטימטר מרובע אחד.
ואז להשתמש במטסים כדי להעביר חתיכת ספוג אחת לתוך כל באר של צלחת תרבות. הוסף שלושה עד ארבעה מיליליטר של CMT לתוך כל באר של צלחת 6 באר עבור השקדים ומיליליטר אחד לתוך צלחת 12 באר עבור צוואר הרחם. מניחים את הצלחות באינקובטור, מוגדר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, וגדול או שווה ל 90% לחות עד מתפוצץ הרקמה מוכנים להיות טעון על הספוגים.
מעבירים את השקדים ממכל ההובלה לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה 10 עד 20 מיליליטר CMT באמצעות ממטרים סטריליים. השתמש במכסה של צלחת פטרי כמשטח חיתוך כדי לנתח את הרקמה. מחזיקים את הרקמה בעדינות עם מטלות, חותכים כל שקד לחתיכות שונות וגדולות באמצעות אזמל סטרילי ולהב.
השתמש במקלפים ואזמל כדי להסיר רקמה צרובה, מדממת, שרירנית, כמו גם כל החלקים המכילים שקדים או צבע ירקרק-חום. חותכים כל חתיכת רקמה לפרוסות של כשני מילימטרים בעובי. הסר כל חלק לא רצוי כמו בשלב הקודם.
ואז לחתוך את פרוסות הרקמה לרצועות בעובי שני מילימטר. לבסוף, חותכים את רצועות הרקמה לגושים בעובי שני מילימטרים. העבר את explants לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר חדש המכיל 10 עד 20 מיליליטר של CMT, כדי למנוע ייעוד רקמות תוך כדי המשך עם הניתוח.
בסוף הניתוח, מערבולת את הצלחת כדי אקראית התפלגות explant. מניחים תשעה מתפוצצים על גבי כל ספוג ג'לטין בצלחת 6 באר באמצעות מדפים, המאפשר רווח ביניהם. תחזיר את הצלחות לאנקובטור.
בדרך כלל, מתפוצצים מתורבתים בן לילה. חיסון עם HIV מבוצע למחרת. זאת כדי לוודא כי אין זיהום חיידקי או פטרייתי מתפתח בתרבות.
כמו כן, תאים נוטים לסגת מתפוצץ רקמות מיד לאחר הניתוח. שאפו את המדיום בצלחת 6 באר עם פיפטה, והשליכו אותו במיכל עם תוסף חיטוי. להטות את הצלחת בעדינות לדחוף את ספוגי ג'לטין לחלק העליון של באר כדי לאפשר למדיום לאסוף בתחתית.
שאף והשליך את המדיום. לאחר מכן מוסיפים שלושה עד ארבעה מיליליטר של CMT לכל באר. עכשיו להפשיר את הכנת נגיף HIV-1 באמבט המים ב 37 מעלות צלזיוס.
פיפטה הווירוס inoculum ישירות על גבי כל אחד מתשעה explants על ספוג ג'לטין. תחזיר את הצלחת לאנקובטור. השתמש במכסה של צלחת פטרי כמשטח חיתוך כדי לנתח את הרקמה.
החזקת הרקמה בעדינות במקלות, מפרידים את רירית האקטוקרוויקס ו/או האנדוקרוויקס מתחת לסטרומה ותת-מסיסה עם אזמל ולהב כדי להשיג רצועות רירית. חותכים את רירית לרצועות ברוחב שני מ"מ. הסר והשליך תת-ממוזה רבה ככל האפשר, והשאיר רק שכבה בעובי שני מילימטרים של רקמה.
ואז לחתוך את הרצועות לבלוקים בעובי שני מילימטר. להעביר explants רקמות לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר חדש המכיל 10 עד 20 מיליליטר של CMT, כדי למנוע ייעוד רקמות תוך כדי המשך עם הניתוח. בסוף הניתוח, מערבולת את הצלחת כדי אקראית התפלגות explant.
עם ממטרים סטריליים, להעביר את explants לתוך סטרילי 1.5 צינורות חרוט מיליליטר. הסר כל מדיום בצינור באמצעות פיפטה. לקבלת תוצאות אופטימליות, explants של צוואר הרחם צריך להיות מעובד נגוע בהקדם האפשרי לאחר הניתוח, באופן אידיאלי ביום הניתוח.
לחלופין, רקמות ניתן לאחסן שקוע CMT ב 4 מעלות לילה נגוע מיד לאחר הניתוח. להפשיר את הכנת HIV-1 באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הפשרה, להעביר את הנגיף לתוך הצינורות המכילים את explants.
מעבירים את הצינורות לתרמושאקר, ומודרים במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס מתנדנדים ב-300 סל"ד. בעדינות להפוך את הצינורות כמה פעמים כל 30 עד 60 דקות. בינתיים, למלא צלחת 6 באר עם שלושה עד ארבעה מיליליטר לגם של מלוחים סטריליים פוספט מאגר.
בסוף הדגירה עם HIV-1, להשתמש פיפטה כדי להשליך את כל הכנת הנגיף בצינורות המכילים את explants לתוך מיכל עם פתרון חיטוי. לאחר מכן השתמש במטסים ובפיגט כדי להעביר את המתפוצצים לצלחת 6 באר המכילה PBS. לאחר מתן אפשרות למתפוצצים לנוח ב- PBS במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, שטפו אותם על ידי צינורות בעדינות את ה- PBS למעלה ולמטה לתוך הבאר פעמיים עד שלוש פעמים.
ואז להשליך את PBS לתוך מיכל עם פתרון חיטוי באמצעות פיפטה. הוסף שלושה עד ארבעה מיליליטר של PBS חדש לכל באר. חזור פעמיים נוספות על סך של שלוש שטיפות.
השלך את PBS רק לפני העברת explants לספוגים, כדי למנוע ייעוד רקמות. עכשיו להשתמש מדפים להעביר חמישה עד שמונה explants על גבי כל ספוג ג'לטין לתוך צלחת 12 היטב. תחזיר את הצלחת לאנקובטור.
לאסוף מדגם של מדיום תרבות עם פיפטה, ולהעביר אותו סטרילי 1.5 או שני צינורות כובע בורג מיליליטר לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. לקצור את הרקמות explants עם ממטרים סטריליים, ולהעביר את explants לתוך סטרילי 1.5 או שני צינורות כובע בורג מיליליטר. לעבד או לאחסן את דגימות הרקמה כנדרש על ידי הניסוי.
שאפו את מדיום התרבות השיורית היטב עם פיפטה, והשליכו אותו לתוך מיכל עם תוסף חיטוי. להטות את הצלחת בעדינות לדחוף את ספוגי ג'לטין לחלק העליון של באר כדי לאפשר למדיום לאסוף בתחתית, ולאחר מכן שאף והשליך אותו. עכשיו להוסיף שלושה עד ארבעה מיליליטר של תרבות בינוני לכל באר.
באמצעות מדפים סטריליים, להחזיר את כל explants רקמה שנפל לתוך המדיום לספוג ג'לטין לפני החזרת הצלחת לחממה. בסוף התרבות, יש להשליך את כל הפסולת הביולוגית במיכלי אפוזיט בהתאם לתקנות המכון לטיפול בביולוגיה מסוכנת וכן להערכת סיכונים ספציפית. שונות בין תורמים יכולה להשפיע על שכפול HIV-1 כפי שנמדד על ידי הריכוז של חלבון ליבת HIV p24 איסור פרסום בתרבות רקמה explant, כפי שהוכח עבור רקמת צוואר הרחם משלושה תורמים שונים נגועים באותו וירוס inoculum.
עבור התורם הראשון, הצטברות של איסור פרסום p24 בתרבות בינונית של explants נגוע HIV-1 BaL לבד מצביע בבירור על זיהום במוצר. התרופה האנטי-רטרו-ויראלית 3TC כי לחלוטין abrogates שכפול HIV שימש שליטה שלילית. כמות איסור הפרסום p24 הנמדדת במדיום התרבותי של מתפוצצים שטופלו ב- 3TC חושפת את החלק השני של אינוקולום הנגיף נספג באופן ספציפי ושוחרר על ידי מתפוצצים של רקמות במהלך התרבות.
ב explants רקמות מן התורם השני, HIV-1 זיהום המעי תוצאות ירידה מתמדת בריכוז של איסור פרסום p24 לאורך זמן, המציין ביטול של זיהום או בלתי ניתן לגילוי על ידי כימות איסור פרסום p24. זה אושר על ידי 3TC מטופלים שליטה explants כי להראות קינטי שכפול HIV דומה. זיהום של מתפוצי רקמות מהתורם השלישי מניב כמות קטנה של וירוסים.
במקרה זה, הכללת הטיפול 3TC כבקרה שלילית יש צורך לברר את נוכחותו של זיהום עם ייצור וירוס דה נובו. בעקבות הליך זה, שיטות אנליטיות כמו ציטומטריית זרימה או כשל חיסוני יכולות להתבצע בנקודות זמן שונות כדי לענות על שאלות לגבי פנוטיפ, פרופורציה או מיקום רקמות של אוכלוסיית התאים המעניינים. בעת תכנון הניסוי, חשוב להעריך את ההשפעה של שונות בין תורמים על הקריאה הניסיונית של בחירה.
שונות בין תורמים יכולה להיות נשלטת חלקית על ידי קביעת קריטריונים קליניים מחמירים, ואולי, הכללה והדרה ניסיוניים. Ex vivo תרבות רקמה אנושית ניתן להשתמש כדי ללמוד את הפתוגנזה של חיידקים אחרים מאשר HIV, כגון וירוס vaccinia או וירוסים הרפס. הם שימשו גם כפלטפורמה פרה-קלינית ללימודי רעילות ואתיקה מיקרוביאלית.
אנא שימו לב כי כל הדגימות האנושיות, אפילו מאנשים בריאים, יכולות לספק מחסה לסוכנים זיהומיות. חינוך, הכשרה והגנות מתאימים נדרשים כדי לטפל ברקמות אנושיות כדי להבטיח את שלומם שלך ועם עמיתיך לעבודה.
