Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do HIV, como a identificação dos determinantes da transmissão do vírus e da patogênese dentro de dois dos órgãos mais efetuados pela infecção. Na verdade, a principal progressão avançada da doença de condução ocorre nos tecidos. As características e a complexidade da infecção são mal refletidas pelas células em circulação ou isoladas e infectadas in vitro.
A principal vantagem da cultura do tecido ex vivo para estudar a patogênese do HIV é que ela mantém suas relações espaçais e funcionais originais entre as células, embora por duas a três semanas. Para começar, encha uma placa de Petri de 100 milímetros com 20 a 30 mililitros de CMT. Transfira esponjas de gelatina para a placa de Petri usando fórceps estéreis.
Molhe as esponjas de ambos os lados e deixe as esponjas absorverem o meio por um minuto. Pressione as esponjas contra o fundo da placa de Petri por cerca de dois minutos usando uma espátula estéril. Use uma tesoura estéril para cortar as esponjas de gelatina rehidratadas em pedaços de tamanho igual de cerca de um centímetro quadrado.
Em seguida, use fórceps para transferir uma peça de esponja em cada poço de uma placa de cultura. Adicione três a quatro mililitros de CMT em cada poço de uma placa de 6 poços para as amígdalas e um mililitro por poço em uma placa de 12 poços para o colo uterino. Coloque as placas na incubadora, fixadas a 37 graus Celsius, 5% de CO2 e maiores ou iguais a 90% de umidade até que as explanações teciduais estejam prontas para serem carregadas nas esponjas.
Transfira as amígdalas do recipiente de transporte para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 a 20 mililitros de CMT usando fórceps estéreis. Use a tampa da placa de Petri como uma superfície de corte para dissecar o tecido. Segurando o tecido suavemente com fórceps, corte cada amígdala em pedaços grandes e diferentes usando um bisturi estéril e uma lâmina.
Use fórceps e um bisturi para remover tecido cauterizado, ensanguentado e miomado, bem como quaisquer partes contendo tonsillolitos ou cor marrom-esverdeada. Corte cada peça de tecido em fatias de cerca de dois milímetros de espessura. Remova qualquer peça indesejada como na etapa anterior.
Em seguida, corte as fatias de tecido em tiras de dois milímetros de espessura. Finalmente, corte as tiras de tecido em blocos de dois milímetros de espessura. Transfira as explanações para uma nova placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 a 20 mililitros de CMT para evitar a dessecação tecidual enquanto prossegue com a dissecação.
No final da dissecção, gire a placa para randomizar a distribuição da explantação. Coloque nove explantes de tecido em cima de cada esponja de gelatina em uma placa de 6 poços usando fórceps, permitindo espaço entre eles. Devolva as placas para a incubadora.
Normalmente, explantas são cultivadas da noite para o dia. A inoculação com HIV é realizada no dia seguinte. Isto é para garantir que nenhuma contaminação bacteriana ou fúngica se desenvolva na cultura.
Além disso, as células tendem a regredir explanações teciduais imediatamente após a dissecção. Aspire o meio na placa de 6 poços com uma pipeta, e descarte-o em um recipiente com solução desinfetante. Incline a placa e empurre suavemente as esponjas de gelatina para a parte superior do poço para permitir que o meio se reúna na parte inferior.
Aspire e descarte o meio. Em seguida, adicione três a quatro mililitros de CMT a cada poço. Agora descongele a preparação do vírus HIV-1 no banho de água a 37 graus Celsius.
Pipeta o vírus inóculo diretamente em cima de cada uma das nove explantas em uma esponja de gelatina. Devolva a placa para a incubadora. Use a tampa da placa de Petri como uma superfície de corte para dissecar o tecido.
Segurando o tecido suavemente com fórceps, separe a mucosa do ectocervix e/ou endocervix da parte inferior e submucosa com um bisturi e lâmina para obter tiras de mucosa. Corte a mucosa em tiras de dois milímetros de largura. Remova e descarte o máximo possível de submucosa, deixando apenas uma camada de tecido de dois milímetros de espessura.
Em seguida, corte as tiras em blocos de dois milímetros de espessura. Transfira as explanações teciduais para uma nova placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 a 20 mililitros de CMT para evitar a dessecação tecidual enquanto prossegue com a dissecação. No final da dissecção, gire a placa para randomizar a distribuição da explantação.
Com fórceps estéreis, transfira as explanações em tubos cônicos estéreis de 1,5 mililitro. Remova qualquer meio no tubo usando uma pipeta. Para obter resultados ideais, as explantas do colo do útero devem ser processadas e infectadas o mais rápido possível após a cirurgia, idealmente no dia da cirurgia.
Alternativamente, os tecidos podem ser armazenados submersos em TMC a 4 graus durante a noite e infectados imediatamente após a dissecção. Descongele a preparação do HIV-1 em um banho de água a 37 graus Celsius. Uma vez descongelado, transfira o vírus para os tubos contendo as explantas.
Transfira os tubos para um termoshaker, e incubar por duas horas a 37 graus Celsius balançando a 300 rpm. Inverta suavemente os tubos algumas vezes a cada 30 a 60 minutos. Enquanto isso, encha uma placa de 6 poços com três a quatro mililitros por poço de salina tamponada de fosfato estéril.
Ao final da incubação com HIV-1, use uma pipeta para descartar toda a preparação do vírus nos tubos que contenham as explantas em um recipiente com solução desinfetante. Em seguida, use fórceps e uma pipeta para transferir as explantas para a placa de 6 poços contendo PBS. Depois de permitir que as explantas descansem em PBS por um minuto à temperatura ambiente, lave-as gentilmente sobre a PBS para cima e para baixo no poço duas a três vezes.
Em seguida, descarte o PBS em um recipiente com solução desinfetante usando uma pipeta. Adicione três a quatro mililitros de novo PBS a cada poço. Repita mais duas vezes para um total de três lavagens.
Descarte o PBS pouco antes de transferir as explantas para as esponjas para evitar a profilação tecidual. Agora use fórceps para transferir cinco a oito explantas em cima de cada esponja de gelatina em uma placa de 12 poços. Devolva a placa para a incubadora.
Colete uma amostra de meio de cultura com uma pipeta e transfira-a para tubos de tampa de parafuso de 1,5 ou dois mililitros para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Colher as explantas teciduais com fórceps estéreis e transferir as explantas para tubos de tampa de parafuso estéril de 1,5 ou dois mililitros. Processe ou armazene as amostras de tecido conforme exigido pelo experimento.
Aspire o meio de cultura residual no poço com uma pipeta, e descarte-o em um recipiente com solução desinfetante. Incline a placa e empurre suavemente as esponjas de gelatina para a parte superior do poço para permitir que o meio se reúna na parte inferior e, em seguida, aspire e descarte-a. Agora adicione três a quatro mililitros de cultura média para cada poço.
Usando fórceps estéreis, devolva todas as explantas teciduais que caíram no meio para a esponja de gelatina antes de devolver a placa à incubadora. Ao final da cultura, descarte todos os resíduos biológicos em recipientes de apposite de acordo com as normas do instituto sobre o manuseio de biológicos perigosos, bem como a avaliação específica de riscos. A variabilidade entre doadores pode afetar a replicação do HIV-1 medida pela concentração da mordaça p24 da proteína do núcleo HIV na cultura de plantas de tecido, como demonstrado para tecido cervical de três doadores diferentes infectados com o mesmo vírus inóculo.
Para o primeiro doador, o acúmulo de mordaça p24 em meio de cultura de explants infectados com HIV-1 BaL por si só indica claramente uma infecção do produto. A droga antirretroviral 3TC que revoga completamente a replicação do HIV foi usada como controle negativo. A quantidade de mordaça p24 medida em meio de cultura de explants tratadas com 3TC revela a fração do vírus inóculo absorvido e liberado por explants teciduais durante a cultura.
Em explantas teciduais do segundo doador, a infecção intestinal pelo HIV-1 resulta em uma diminuição constante na concentração de mordaça p24 ao longo do tempo, indicando um abortamento de infecção ou indetectável pela quantificação da mordaça p24. Isso é confirmado por explants de controle tratados com 3TC que mostram uma replicação semelhante do HIV cinética. A infecção de explantas teciduais do terceiro doador produz pouca quantidade de vírus.
Neste caso, a inclusão do tratamento 3TC como controle negativo é necessária para verificar a presença de infecção com a produção do vírus de novo. Após esse procedimento, métodos analíticos como citometria de fluxo ou imunossagem podem ser realizados em diferentes pontos de tempo para responder a perguntas sobre fenótipo, proporção ou localização tecidual da população celular de interesse. Ao projetar o experimento, é importante estimar o impacto da variabilidade entre doadores na leitura experimental da escolha.
A variabilidade entre doadores pode ser parcialmente controlada estabelecendo critérios clínicos rigorosos e, possivelmente, experimentais de inclusão e exclusão. Culturas de tecidos humanos ex vivo podem ser usadas para estudar a patogênese de micróbios que não sejam o HIV, como o vírus da vaccinia ou vírus do herpes. Eles também têm sido usados como uma plataforma pré-clínica para estudos de toxicidade antimicrobiana e ética.
Por favor, esteja ciente de que todos os espécimes humanos, mesmo de indivíduos saudáveis, podem abrigar agentes infecciosos. Educação, treinamento e proteções adequadas são necessárias para lidar com tecidos humanos para garantir a segurança de você e de seus colegas de trabalho.
