Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'HIV, come l'identificazione dei determinanti della trasmissione del virus e della patogenesi all'interno di due degli organi più colpiti dall'infezione. In effetti, la progressione avanzata chiave della malattia della guida avviene nei tessuti. Le caratteristiche e la complessità dell'infezione sono scarsamente riflesse dalle cellule in circolazione o isolate e infette in vitro.
Il principale vantaggio della coltura tissutale ex vivo per studiare la patogenesi dell'HIV è che mantiene le sue relazioni spaziali e funzionali originali tra le cellule anche se per due o tre settimane. Per iniziare, riempire una piastra di Petri da 100 millmeter per 20 millimetri con 20-30 millilitri di CMT. Trasferire le spugne di gelatina nella piastra di Petri utilizzando forcep sterili.
Bagnare le spugne su entrambi i lati e lasciare che le spugne assorbono il mezzo per un minuto. Premere le spugne contro il fondo della piastra di Petri per circa due minuti utilizzando una spatola sterile. Utilizzare forbici sterili per tagliare le spugne di gelatina reidrata in pezzi di dimensioni uguali di circa un centimetro quadrato.
Quindi utilizzare le forcep per trasferire un pezzo di spugna in ogni pozzo di un piatto di coltura. Aggiungere da tre a quattro millilitri di CMT in ogni pozzo di una piastra da 6 pozzetti per le tonsille e un millilitro per pozzo in una piastra da 12 pozzetti per la cervice. Posizionare le piastre nell'incubatrice, impostate a 37 gradi Celsius, 5%CO2 e superiori o uguali al 90% di umidità fino a quando gli espianto tissutali non sono pronti per essere caricati sulle spugne.
Trasferire le tonsille dal contenitore di trasporto in una piastra di Petri da 100 millimetri contenente da 10 a 20 millilitri di CMT utilizzando forcep sterili. Utilizzare il coperchio della piastra di Petri come superficie di taglio per sezionare il tessuto. Tenendo delicatamente il tessuto con le arpe, tagliare ogni tonsille in pezzi diversi e grandi usando un bisturi e una lama sterili.
Utilizzare le forcelle e un bisturi per rimuovere il tessuto cauterizzato, sanguinante e fibroso, nonché tutte le parti contenenti tonsilloliti o colore bruno-verdastro. Tagliare ogni pezzo di tessuto a fette di circa due millimetri di spessore. Rimuovere qualsiasi parte indesiderata come nel passaggio precedente.
Quindi tagliare le fette di tessuto a strisce spesse due millimetri. Infine, tagliare le strisce di tessuto in blocchi spessi due millimetri. Trasferire gli espianto in una nuova piastra di Petri da 100 millimetri contenente da 10 a 20 millilitri di CMT per evitare l'essiccazione tissutale mentre si procede con la dissezione.
Alla fine della dissezione, ruotare la piastra per randomizzare la distribuzione dell'espianto. Posizionare nove espianto tissutale sopra ogni spugna di gelatina in una piastra a 6 po 'usando le forcelle, lasciando spazio tra di loro. Riportare le piastre all'incubatrice.
In genere, le espianto vengono coltivate durante la notte. L'inoculazione con l'HIV viene eseguita il giorno successivo. Questo per assicurarsi che non si sviluppi alcuna contaminazione batterica o fungina nella coltura.
Inoltre, le cellule tendono a regredire le espianto dei tessuti immediatamente dopo la dissezione. Aspirare il mezzo nella piastra a 6 po 'con una pipetta e scartarlo in un contenitore con soluzione disinfettante. Inclinare la piastra e spingere delicatamente le spugne di gelatina nella parte superiore del pozzo per consentire al mezzo di raccogliere sul fondo.
Aspirare e scartare il mezzo. Quindi aggiungere da tre a quattro millilitri di CMT a ciascun pozzo. Ora scongelare la preparazione del virus HIV-1 nel bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
Pipettare l'inoculo virale direttamente sopra ciascuno dei nove espianto su una spugna di gelatina. Riportare la piastra all'incubatore. Utilizzare il coperchio della piastra di Petri come superficie di taglio per sezionare il tessuto.
Tenendo delicatamente il tessuto con le forcelle, separare la mucosa dell'ectocervix e/o dell'endocervix dal sottostromale e sottomucosa con bisturi e lama per ottenere strisce di mucosa. Tagliare la mucosa in strisce larghe due millimetri. Rimuovere e scartare quanta più sottomucosa possibile, lasciando solo uno strato di tessuto spesso due millimetri.
Quindi tagliare le strisce in blocchi spessi due millimetri. Il tessuto di trasferimento espianta in una nuova piastra di Petri da 100 millimetri contenente da 10 a 20 millilitri di CMT per evitare l'essiccazione tissutale mentre si procede con la dissezione. Alla fine della dissezione, ruotare la piastra per randomizzare la distribuzione dell'espianto.
Con forcette sterili, trasferire le espianto in tubi conici sterili da 1,5 millilitri. Rimuovere qualsiasi mezzo nel tubo utilizzando una pipetta. Per risultati ottimali, gli espianto della cervice devono essere elaborati e infettati il prima possibile dopo l'intervento chirurgico, idealmente il giorno dell'intervento chirurgico.
In alternativa, i tessuti possono essere conservati immersi in CMT a 4 gradi durante la notte e infetti immediatamente dopo la dissezione. Scongelare la preparazione dell'HIV-1 in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Una volta scongelato, trasferire il virus nei tubi contenenti le espianto.
Trasferire i tubi in un termoshaker e incubare per due ore a 37 gradi Celsius dondolando a 300 giri/min. Invertire delicatamente i tubi alcune volte ogni 30-60 minuti. Nel frattempo, riempire una piastra da 6 po 'con tre o quattro millilitri per pozzo di soluzione salina tamponata di fosfato sterile.
Al termine dell'incubazione con HIV-1, utilizzare una pipetta per scartare tutta la preparazione del virus nei tubi contenenti le espianto in un contenitore con soluzione disinfettante. Quindi utilizzare le forcep e una pipetta per trasferire gli espianto nella piastra a 6 potte contenente PBS. Dopo aver permesso agli espianto di riposare in PBS per un minuto a temperatura ambiente, lavarli tubazionando delicatamente il PBS su e giù nel pozzo due o tre volte.
Quindi scartare il PBS in un contenitore con soluzione disinfettante utilizzando una pipetta. Aggiungere da tre a quattro millilitri di nuovo PBS a ciascun pozzo. Ripetere altre due volte per un totale di tre lavaggi.
Scartare il PBS poco prima di trasferire le espianto alle spugne per evitare l'essiccazione tissutale. Ora usa le forcep per trasferire da cinque a otto espianto sopra ogni spugna di gelatina in un piatto da 12 po '. Riportare la piastra all'incubatore.
Raccogliere un campione di mezzo di coltura con una pipetta e trasferirlo in tubi sterili a vite da 1,5 o due millilitri per lo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius. Raccogliere il tessuto espianta con forcelle sterili e trasferire le espianto in tubi sterili a vite da 1,5 o due millilitri. Elaborare o conservare i campioni di tessuto come richiesto dall'esperimento.
Aspirare il mezzo di coltura residua nel pozzo con una pipetta e scartarlo in un contenitore con soluzione disinfettante. Inclinare il piatto e spingere delicatamente le spugne di gelatina nella parte superiore del pozzo per consentire al mezzo di raccogliere sul fondo, quindi aspirarlo e scartarlo. Ora aggiungi da tre a quattro millilitri di mezzo di coltura per ogni pozzo.
Utilizzando forcelle sterili, restituire tutti gli espianto di tessuto che sono caduti nel mezzo alla spugna di gelatina prima di restituire il piatto all'incubatrice. Al termine della coltura, smaltire tutti i rifiuti biologici in contenitori di apposite secondo le normative dell'istituto sulla manipolazione di biologici pericolosi e la specifica valutazione del rischio. La variabilità tra donatori può influenzare la replicazione dell'HIV-1 misurata dalla concentrazione della proteina del nucleo hiv p24 gag nel supernatante della coltura di espianto tissutale, come dimostrato per il tessuto cervicale da tre diversi donatori infettati dallo stesso inoculo virale.
Per il primo donatore, l'accumulo di gag p24 nel mezzo di coltura di espianto infettati da HIV-1 BaL da solo indica chiaramente un'infezione del prodotto. Il farmaco antiretrovirale 3TC che abroga completamente la replicazione dell'HIV è stato utilizzato come controllo negativo. La quantità di p24 gag misurata nel mezzo di coltura delle espianto trattate con 3TC rivela la frazione dell'inoculo virale assorbito e rilasciato specificamente dagli espianto tissutali durante la coltura.
Negli espianto tissutali del secondo donatore, l'infezione intestinale da HIV-1 si traduce in una costante diminuzione della concentrazione di gag p24 nel tempo, indicando un'interruzione dell'infezione o non rilevabile dalla quantificazione del bavaglio p24. Ciò è confermato dagli espianto di controllo trattati con 3TC che mostrano un simile cinetico di replicazione dell'HIV. L'infezione degli espianto tissutali dal terzo donatore produce poca quantità di virus.
In questo caso, l'inclusione del trattamento 3TC come controllo negativo è necessaria per accertare la presenza di infezione da produzione di virus de novo. Seguendo questa procedura, metodi analitici come la citometria del flusso o l'immunostaining possono essere eseguiti in diversi punti di tempo per rispondere a domande sul fenotipo, la proporzione o la posizione tissutale della popolazione cellulare di interesse. Quando si progetta l'esperimento, è importante stimare l'impatto della variabilità tra donatori sulla lettura sperimentale della scelta.
La variabilità tra donatori può essere parzialmente controllata stabilendo rigorosi criteri clinici e, possibilmente, sperimentali di inclusione ed esclusione. Le colture di tessuti umani ex vivo possono essere utilizzate per studiare la patogenesi di microbi diversi dall'HIV, come il virus vaccinia o i virus dell'herpes. Sono stati anche utilizzati come piattaforma preclinica per studi di tossicità antimicrobica ed etica.
Si prega di essere consapevoli del fatto che tutti gli esemplari umani, anche da individui sani, possono ospitare agenti infettivi. Sono necessarie un'istruzione, una formazione e protezioni adeguate per gestire i tessuti umani per garantire la sicurezza di te e dei tuoi colleghi.
