Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del VIH, como la identificación de los determinantes de la transmisión del virus y la patogénesis dentro de dos de los órganos más realizados por la infección. De hecho, la progresión clave avanzada de la enfermedad de conducción tiene lugar en los tejidos. Las características y complejidad de la infección son mal reflejadas por las células en circulación o aisladas e infectadas in vitro.
La principal ventaja del cultivo de tejido ex vivo para estudiar la patogénesis del VIH es que conserva sus relaciones espaciales y funcionales originales entre las células, aunque durante dos a tres semanas. Para comenzar, llene un plato de 100 mimeter por 20 milímetros petri con 20 a 30 mililitros de CMT. Transfiera las esponjas de gelatina en el plato Petri usando fórceps estériles.
Humedezca las esponjas por ambos lados y deje que las esponjas se empapen medio durante un minuto. Presione las esponjas contra la parte inferior del plato Petri durante unos dos minutos usando una espátula estéril. Usa tijeras estériles para cortar las esponjas de gelatina rehidracionadas en trozos del mismo tamaño de aproximadamente un centímetro cuadrado.
A continuación, utilice fórceps para transferir una pieza de esponja a cada pocero de un plato de cultivo. Agregue de tres a cuatro mililitros de CMT en cada pozo de una placa de 6 pozos para las amígdalas y un mililitro por pozo en una placa de 12 pozos para el cuello uterino. Coloque las placas en la incubadora, puestas en 37 grados Celsius, 5%CO2, y mayor o igual a 90% de humedad hasta que los explantes de tejido estén listos para ser cargados en las esponjas.
Transfiera las amígdalas del contenedor de transporte a un plato Petri de 100 milímetros que contenga de 10 a 20 mililitros de CMT utilizando fórceps estériles. Utilice la tapa de la placa Petri como superficie de corte para diseccionar el tejido. Sosteniendo el tejido suavemente con fórceps, corte cada amígdala en diferentes trozos grandes usando un bisturí y una cuchilla estériles.
Usa fórceps y un bisturí para eliminar el tejido cauterizado, sangriento y fibroma, así como cualquier parte que contenga amigdalitos o de color marrón verdoso. Corte cada pieza de tejido en rodajas de aproximadamente dos milímetros de espesor. Elimine cualquier parte no deseada como en el paso anterior.
Luego corta las rebanadas de tejido en tiras de dos milímetros de espesor. Finalmente, corta las tiras de tejido en bloques de dos milímetros de espesor. Transfiera los explantes a un nuevo plato Petri de 100 milímetros que contenga de 10 a 20 mililitros de CMT para evitar la desicación de los tejidos mientras se procede a la disección.
Al final de la disección, gire la placa para aleatorizar la distribución del explant. Coloque nueve explantes de tejido encima de cada esponja de gelatina en una placa de 6 pocillos usando fórceps, permitiendo espacio entre ellos. Devuelva las placas a la incubadora.
Por lo general, los explantes se cultivan durante la noche. La inoculación con el VIH se realiza al día siguiente. Esto es para asegurarse de que no se desarrolla contaminación bacteriana o fúngica en el cultivo.
Además, las células tienden a retroceder los explantes de tejido inmediatamente después de la disección. Aspirar el medio en la placa de 6 pozos con una pipeta y desecharlo en un recipiente con solución desinfectante. Incline la placa y empuje suavemente las esponjas de gelatina a la parte superior del pozo para permitir que el medio se reúna en la parte inferior.
Aspirar y desechar el medio. A continuación, agregue de tres a cuatro mililitros de CMT a cada pozo. Ahora descongela la preparación del virus VIH-1 en el baño de agua a 37 grados centígrados.
Pipetear el inóculo del virus directamente encima de cada uno de los nueve explantes en una esponja de gelatina. Devuelva la placa a la incubadora. Utilice la tapa de la placa Petri como superficie de corte para diseccionar el tejido.
Sosteniendo el tejido suavemente con fórceps, separe la mucosa del ectocervix y/o endocervix de la parte inferior estromal y submucosa con un bisturí y una cuchilla para obtener tiras de mucosa. Corta la mucosa en tiras de dos milímetros de ancho. Retire y deseche tanta submucosa como sea posible, dejando sólo una capa de tejido de dos milímetros de espesor.
A continuación, corte las tiras en bloques de dos milímetros de espesor. Transfiera el tejido explanta a un nuevo plato Petri de 100 milímetros que contenga de 10 a 20 mililitros de CMT para evitar la desicación de tejidos mientras se procede a la disección. Al final de la disección, gire la placa para aleatorizar la distribución del explant.
Con fórceps estériles, transfiera los explants a tubos cónicos estériles de 1,5 mililitros. Retire cualquier medio del tubo con una pipeta. Para obtener resultados óptimos, los explantes de cuello uterino deben procesarse e infectarse lo antes posible después de la cirugía, idealmente el día de la cirugía.
Alternativamente, los tejidos se pueden almacenar sumergidos en CMT a 4 grados durante la noche e infectados inmediatamente después de la disección. Descongelar la preparación del VIH-1 en un baño de agua a 37 grados centígrados. Una vez descongelado, transfiera el virus a los tubos que contienen las plantas.
Transfiera los tubos a un termoequipo e incubar durante dos horas a 37 grados Centígrados en balanceo a 300 rpm. Invierta suavemente los tubos unas cuantas veces cada 30 a 60 minutos. Mientras tanto, llene una placa de 6 pozos con tres a cuatro mililitros por pozo de solución salina tamponada de fosfato estéril.
Al final de la incubación con VIH-1, utilice una pipeta para desechar toda la preparación del virus en los tubos que contienen los explantes en un recipiente con solución desinfectante. A continuación, utilice fórceps y una pipeta para transferir los explants a la placa de 6 pocillos que contiene PBS. Después de permitir que los explantes descansen en PBS durante un minuto a temperatura ambiente, lávelos suavemente pipeteando el PBS hacia arriba y hacia abajo en el pozo dos a tres veces.
A continuación, deseche el PBS en un recipiente con solución desinfectante utilizando una pipeta. Agregue tres a cuatro mililitros de nuevo PBS a cada pozo. Repita dos veces más para un total de tres lavados.
Deseche el PBS justo antes de transferir los explants a las esponjas para evitar la desicación de los tejidos. Ahora usa fórceps para transferir de cinco a ocho explantes encima de cada esponja de gelatina a un plato de 12 pocillos. Devuelva la placa a la incubadora.
Recoger una muestra de medio de cultivo con una pipeta, y transferirlo a tubos estériles de tapa de tornillo de 1,5 o dos mililitros para su almacenamiento a menos 80 grados Centígrados. Cosecha el tejido explanta con fórceps estériles, y transfiera los explantes a tubos estériles de tapa de tornillo de 1,5 o dos mililitros. Procesar o almacenar las muestras de tejido según lo requiera el experimento.
Aspirar el medio de cultivo residual en el pozo con una pipeta, y desecharlo en un recipiente con solución desinfectante. Incline la placa y empuje suavemente las esponjas de gelatina a la parte superior del pozo para permitir que el medio se reúna en la parte inferior, y luego aspire y deseche. Ahora agregue tres a cuatro mililitros de medio de cultivo a cada pozo.
Usando fórceps estériles, devuelva cualquier tejido que disminuya en el medio a la esponja de gelatina antes de devolver la placa a la incubadora. Al final del cultivo, deseche todos los residuos biológicos en contenedores apropiados de acuerdo con la normativa del instituto sobre el manejo de productos biológicos peligrosos, así como la evaluación de riesgos específica. La variabilidad entre donantes puede afectar la replicación del VIH-1 medida por la concentración de la mordaza de la proteína del núcleo del VIH p24 en el sobrenadante del cultivo del explanteo de tejidos, como se demuestra para el tejido cervical de tres donantes diferentes infectados con el mismo inóculo virus.
Para el primer donante, la acumulación de mordaza p24 en el medio de cultivo de explantes infectados con VIH-1 BaL por sí sola indica claramente una infección del producto. El medicamento antirretroviral 3TC que deroga completamente la replicación del VIH se utilizó como control negativo. La cantidad de mordaza p24 medida en un medio de cultivo de explantes tratados con 3TC revela la fracción de virus inóculo absorbido y liberado por los explantes de tejidos durante el cultivo.
En los explantes de tejido del segundo donante, la infección intestinal por VIH-1 produce una disminución constante de la concentración de la mordaza p24 con el tiempo, lo que indica una aborto de infección o indetectable mediante la cuantificación de la mordaza p24. Esto es confirmado por explantes de control tratados con 3TC que muestran una replicación cinética similar del VIH. La infección de los tejidos explanta del tercer donante produce poca cantidad de virus.
En este caso, la inclusión del tratamiento 3TC como control negativo es necesaria para determinar la presencia de infección con la producción de virus de novo. Después de este procedimiento, se pueden realizar métodos analíticos como la citometría de flujo o la inmunosumanía en diferentes momentos para responder preguntas sobre el fenotipo, la proporción o la ubicación del tejido de la población celular de interés. Al diseñar el experimento, es importante estimar el impacto de la variabilidad entre donantes en la lectura experimental de elección.
La variabilidad entre donantes puede controlarse parcialmente estableciendo criterios clínicos y, posiblemente experimentales de inclusión y exclusión, estrictos. Los cultivos de tejido humano ex vivo se pueden utilizar para estudiar la patogénesis de microbios distintos del VIH, como el virus de la vacuna o los virus del herpes. También se han utilizado como una plataforma preclínica para estudios de toxicidad antimicrobiana y ética.
Tenga en cuenta que todos los especímenes humanos, incluso de individuos sanos, pueden albergar agentes infecciosos. Se requiere educación, capacitación y protecciones apropiadas para manejar los tejidos humanos para garantizar la seguridad de usted y sus compañeros de trabajo.
