Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du VIH, telles que l’identification des déterminants de la transmission du virus et de la pathogénie dans deux des organes les plus touchés par l’infection. En fait, la progression avancée clé de la maladie de conduite a lieu dans les tissus. Les caractéristiques et la complexité de l’infection sont mal reflétées par les cellules en circulation ou isolées et infectées in vitro.
Le principal avantage de la culture tissulaire ex vivo pour étudier la pathogénie du VIH est qu’elle conserve ses relations spaciales et fonctionnelles originales entre les cellules bien que pendant deux à trois semaines. Pour commencer, remplissez une boîte de Pétri de 100 mm sur 20 millimètres de 20 à 30 millilitres de CMT. Transférer les éponges de gélatine dans la boîte de Pétri à l’aide de forceps stériles.
Mouiller les éponges des deux côtés et laisser absorber les éponges à feu moyen pendant une minute. Presser les éponges contre le fond de la boîte de Pétri pendant environ deux minutes à l’aide d’une spatule stérile. Utilisez des ciseaux stériles pour couper les éponges de gélatine réhydratées en morceaux de taille égale d’environ un centimètre carré.
Ensuite, utilisez des forceps pour transférer un morceau d’éponge dans chaque puits d’une plaque de culture. Ajouter trois à quatre millilitres de CMT dans chaque puits d’une plaque de 6 puits pour les amygdales et un millilitre par puits dans une plaque de 12 puits pour le col de l’utérus. Placez les plaques dans l’incubateur, fixées à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 et supérieures ou égales à 90 % d’humidité jusqu’à ce que les explantations tissulaires soient prêtes à être chargées sur les éponges.
Transférer les amygdales du conteneur de transport dans une boîte petri de 100 millimètres contenant de 10 à 20 millilitres de CMT à l’aide de forceps stériles. Utilisez le couvercle de la boîte de Pétri comme surface de coupe pour disséquer le tissu. Retenant doucement le tissu avec des forceps, coupez chaque amygdale en différents gros morceaux à l’aide d’un scalpel stérile et d’une lame.
Utilisez des forceps et un scalpel pour enlever les tissus cautérisés, sanglants et fibromes, ainsi que toutes les parties contenant des amygdales ou de couleur brun verdâtre. Couper chaque morceau de tissu en tranches d’environ deux millimètres d’épaisseur. Supprimez toute pièce indésirable comme dans l’étape précédente.
Ensuite, coupez les tranches de tissu en lanières de deux millimètres d’épaisseur. Enfin, couper les bandes tissulaires en blocs de deux millimètres d’épaisseur. Transférer les explantations dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 millimètres contenant de 10 à 20 millilitres de CMT pour éviter la dessiccation des tissus tout en procédant à la dissection.
À la fin de la dissection, faites tourbillonner la plaque pour randomiser la distribution de l’explantation. Placer neuf explants tissulaires sur chaque éponge de gélatine dans une plaque de 6 puits à l’aide de forceps, permettant ainsi un espace entre eux. Remettre les assiettes à l’incubateur.
En général, les explants sont cultivés du jour au lendemain. L’inoculation par le VIH est effectuée le lendemain. Il s’agit de s’assurer qu’aucune contamination bactérienne ou fongique ne se développe dans la culture.
En outre, les cellules ont tendance à régresser les explantations tissulaires immédiatement après la dissection. Aspirer le milieu dans la plaque de 6 puits avec une pipette, et le jeter dans un récipient avec une solution désinfectante. Inclinez la plaque et poussez doucement les éponges de gélatine vers la partie supérieure du puits pour permettre au milieu de se rassembler au fond.
Aspirer et jeter le milieu. Ajouter ensuite trois à quatre millilitres de CMT à chaque puits. Décongelez maintenant la préparation du virus VIH-1 dans le bain d’eau à 37 degrés Celsius.
Pipette l’inoculum de virus directement sur chacun des neuf explants sur une éponge de gélatine. Remettre l’assiette à l’incubateur. Utilisez le couvercle de la boîte de Pétri comme surface de coupe pour disséquer le tissu.
Retenant doucement le tissu avec des forceps, séparez la muqueuse de l’ectocervix et/ou de l’endocervix du stromal et du submucosa en dessous avec un scalpel et une lame pour obtenir des bandes de muqueuse. Couper la muqueuse en lanières de deux millimètres de large. Enlever et jeter autant de submucosa que possible, ne laissant qu’une couche de tissu de deux millimètres d’épaisseur.
Ensuite, coupez les bandes en blocs de deux millimètres d’épaisseur. Transférer les explantations tissulaires dans une nouvelle boîte de Pétri de 100 millimètres contenant de 10 à 20 millilitres de CMT pour éviter la dessiccation des tissus tout en procédant à la dissection. À la fin de la dissection, faites tourbillonner la plaque pour randomiser la distribution de l’explantation.
Avec des forceps stériles, transférer les explants dans des tubes coniques stériles de 1,5 millilitre. Retirer n’importe quel milieu du tube à l’aide d’une pipette. Pour des résultats optimaux, les explantations de col de l’utérus doivent être traitées et infectées dès que possible après la chirurgie, idéalement le jour de la chirurgie.
Alternativement, les tissus peuvent être stockés immergés dans cmt à 4 degrés pendant la nuit et infectés immédiatement après la dissection. Décongeler la préparation du VIH-1 dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Une fois décongelé, transférer le virus dans les tubes contenant les explants.
Transférer les tubes dans un thermoshaker, et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius berçant à 300 rpm. Inverser délicatement les tubes à quelques reprises toutes les 30 à 60 minutes. Pendant ce temps, remplissez une plaque de 6 puits de trois à quatre millilitres par puits de salin tamponné de phosphate stérile.
À la fin de l’incubation avec le VIH-1, utiliser une pipette pour jeter toute préparation du virus dans les tubes contenant les explants dans un récipient avec solution désinfectante. Ensuite, utilisez des forceps et une pipette pour transférer les explants dans la plaque de 6 puits contenant PBS. Après avoir laissé les explants se reposer dans PBS pendant une minute à température ambiante, lavez-les en pipetting doucement le PBS de haut en bas dans le puits deux à trois fois.
Puis jeter le PBS dans un récipient avec une solution désinfectante à l’aide d’une pipette. Ajouter trois à quatre millilitres de nouveau PBS à chaque puits. Répétez deux fois de plus pour un total de trois lavages.
Jetez le PBS juste avant de transférer les explants aux éponges pour éviter la dessiccation des tissus. Maintenant, utilisez des forceps pour transférer cinq à huit explants sur le dessus de chaque éponge de gélatine dans une plaque de 12 puits. Remettre l’assiette à l’incubateur.
Prélassez un échantillon de milieu de culture à l’intérieur d’une pipette et transférez-le dans des tubes stériles de bouchon à vis de 1,5 ou 2 millilitres pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Récoltez les explantations tissulaires avec des forceps stériles et transférez les explants dans des tubes stériles de bouchon à vis de 1,5 ou 2 millilitres. Traiter ou stocker les échantillons de tissus selon les besoins de l’expérience.
Aspirer le milieu de culture résiduel dans le puits avec une pipette, et le jeter dans un récipient avec solution désinfectante. Inclinez la plaque et poussez doucement les éponges de gélatine vers la partie supérieure du puits pour permettre au milieu de se rassembler au fond, puis aspirez et jetez-la. Maintenant, ajoutez trois à quatre millilitres de milieu culturel à chaque puits.
À l’aide de forceps stériles, retourner les explants tissulaires qui sont tombées dans le milieu à l’éponge gélatine avant de retourner la plaque à l’incubateur. À la fin de la culture, éliminer tous les déchets biologiques dans des conteneurs apposite conformément aux règlements de l’institut sur la manipulation des produits biologiques dangereux ainsi que l’évaluation spécifique des risques. La variabilité inter-donneurs peut affecter la réplication du VIH-1 mesurée par la concentration du bâillon p24 de protéine de base du VIH dans le supernatant de culture d’explantation tissulaire, comme démontré pour le tissu cervical de trois donneurs différents infectés par le même virus inoculum.
Pour le premier donneur, l’accumulation de bâillon p24 dans le milieu culturel des explants infectés par le VIH-1 BaL seul indique clairement une infection par le produit. Le médicament antirétroviral 3TC qui abroger complètement la réplication du VIH a été utilisé comme un contrôle négatif. La quantité de bâillon p24 mesurée dans le milieu de culture des explantations traitées par 3TC révèle la fraction de l’inoculum du virus aspécifiquement absorbé et libéré par les explantations tissulaires pendant la culture.
Chez les explantations tissulaires du deuxième donneur, l’infection intestinale par le VIH-1 entraîne une diminution constante de la concentration de bâillon p24 au fil du temps, ce qui indique une interruption de l’infection ou indétectable par quantification du bâillon p24. Ceci est confirmé par des explants de contrôle traités par 3TC qui montrent une réplication similaire du VIH cinétique. L’infection des explantations tissulaires du troisième donneur donne peu de quantité de virus.
Dans ce cas, l’inclusion du traitement 3TC comme contrôle négatif est nécessaire pour déterminer la présence d’infection par la production de virus de novo. À la suite de cette procédure, des méthodes analytiques comme la cytométrie du débit ou l’immunostaining peuvent être effectuées à différents moments pour répondre à des questions sur le phénotype, la proportion ou l’emplacement tissulaire de la population cellulaire d’intérêt. Lors de la conception de l’expérience, il est important d’estimer l’impact de la variabilité inter-donateurs sur la lecture expérimentale de choix.
La variabilité inter-donneurs peut être partiellement contrôlée en établissant des critères cliniques rigoureux et, éventuellement, expérimentaux d’inclusion et d’exclusion. Les cultures ex vivo de tissus humains peuvent être utilisées pour étudier la pathogénie des microbes autres que le VIH, comme le virus de la vaccinia ou les virus de l’herpès. Ils ont également été utilisés comme plate-forme préclinique pour la toxicité antimicrobienne et les études d’éthique.
Veuillez noter que tous les spécimens humains, même provenant d’individus en bonne santé, peuvent abriter des agents infectieux. Une éducation, une formation et des protections appropriées sont nécessaires pour manipuler les tissus humains afin d’assurer la sécurité de vous et de vos collègues.
