يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال طب العيون مثل انتشار البيريكيت أو الهجرة. الميزة الرئيسية لهذه الإجراءات هي أنها توفر مجموعة متنوعة من خيارات التصور. إثبات الإجراءات سيكون كارين دريسيغ وفرانك دبليو بليكست، وهما بعد المستندات في مختبرنا.
لتقطير العين، أولا استخدام مشرط لجعل الشقوق الخلفية والائلة الأمامية من حوالي 0.5 سم في جفن الفئران. الاستيلاء على العين مع ملقط والميل بعناية إلى الجانب لفضح الأنسجة المحيطة بها. إنحرجي العين عن طريق إجراء التخفيضات مع مقص تشريح في النسيج الضام والعضلات.
ضع العين لفترة وجيزة في 4٪ الفورمالديهايد والملوحة الفوسفات المخزنة لمدة دقيقة إلى دقيقتين. شطف لفترة وجيزة في العازلة الصوديوم قبل إجراء ثقب في limbus القرنية عن طريق تطبيق ضغط الضوء مع غيض من مشرط. قطع على طول limbus القرنية مع مقص تشريح لإزالة القرنية والعدسة مع ملقط.
غمر الأنسجة المتبقية مع شبكية العين في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. Cryo حماية الأنسجة عن طريق الغمر في سورنسون في الفوسفات العازلة التي تحتوي على 10 ٪ سكروز ثم 25 ٪ السكروز. نقل الأنسجة بمجرد أن غرقت إلى الجزء السفلي من الحاوية.
تضمين في يازولا المتوسطة أعدت مع 3٪ الجيلاتين من الجلد بورسين و 30٪ من الألبومين من بياض البيض الدجاج. بعد ذلك، قطع 10 ميكرون cryosectionات الرأسية من شبكية العين الجيلاتين جزءا لا يتجزأ من خلال إلى العصب البصري. ضع الاحتياجات على شريحة زجاجية واسمح لها بالجفاف لمدة ساعة واحدة على الأقل.
مرة واحدة الجافة، غمر الشريحة في برنامج تلفزيوني مع 0.25٪ تريتون-X 100 لمدة 15 دقيقة. ثم، بالتنقيط خليط من 1:100 مستقبلات PDGF بيتا و 1:500 NG2 الأجسام المضادة الأولية في PBST و 1٪ BSA على القاء الماء ووضع في غرفة رطبة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بغسل المقاطع عن طريق غمر الشريحة في PBST مرتين لمدة 15 دقيقة في كل مرة.
ثم بالتنقيط خليط من 1:100 المضادة للماوس اليكسا فلور 594 المرتبطة و 1:100 المضادة للأرانب فيتك الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة المخفف في PBST مع 3 ٪ BSA على cryosections واحتضان لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد الحضانة، شطف الشريحة الزجاجية في PBST مرتين لمدة 15 دقيقة في كل مرة. قم بتركيب الاحتياضات الملطخة مع وسط تصاعد مضاد للتلاشي يحتوي على DAPI و coverlip.
تقنية إعداد الأنسجة الشبكية الثانية هي كاملة. بعد إزالة القرنية، استخدم حركات فتح صغيرة من ملقط لفصل الشبكية من ظهارة الصباغ الشبكي نحو العصب البصري. حرّر الشبكية في العصب البصري بمقص التشريح، ثم قم بعمل شقوق من 3 إلى 4 شقوق بطول بضعة ملليمترات من محيط الشبكية باتجاه رأس العصب البصري.
انشر الشبكية على شريحة زجاجية واسمح لها بالجفاف لمدة خمس إلى عشر دقائق. بالتنقيط 4٪ الفورمالديهايد على شبكية العين وإصلاح لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد التثبيت، شطف مع برنامج تلفزيوني.
للحصول على أفضل النتائج، كبت المثبطات مباشرة بعد الشطف. أولا، بالتنقيط PBST على جبل كامل واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. صب قبالة PBST، ثم إضافة الحل الأجسام المضادة الأولية واحتضان في غرفة رطبة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، صب قبالة الأجسام المضادة الأولية والتنقيط على PBST لشطف شبكية العين مرتين لمدة 15 دقيقة في كل مرة. بعد صب قبالة غسل الثانية، بالتنقيط حل الأجسام المضادة الثانوية على شبكية العين واحتضان لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية، وغسل مرتين مع PBST كما كان من قبل.
جبل كامل الملون مع تصاعد مضادة للتلاشي المتوسطة التي تحتوي على DAPI وزلة الغطاء. بديل لتركيب كامل في شبكية العين، يمكن عزل الأوعية الشبكية عن طريق العزلة تحت ضغط الدم. أولاً، ضع الشبكية في ملليلتر واحد من الماء الأيون في لوحة 24 بئرًا واهزها عند 200 دورة في الدقيقة مع مدار اهتزازي 1.5 ملليمتر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم أضف 200 وحدة من DNAse 1 لفك الحطام الخلوي من الأوعية الدموية في شبكية العين ويهتز لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة.
شطف شبكية العين في المياه الأيونية لمدة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها مع اهتزاز في 150 إلى 300 دورة في الدقيقة لإزالة حطام الخلايا العصبية. وينبغي أن تصبح شبكية العين أكثر شفافية مع كل شطف، مما يدل على إزالة الحطام الخلوي العصبي. بعد الشطف، وإصلاح شبكية العين في ملليلتر واحد من 4٪ شبهفورمالدهيد وبرنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
شطف مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. إذا كان المضي قدما في المثبطة للمناعة، كتلة الأوعية الدموية المعزولة تحت ضغط الدم مع 500 ميكرولترات من مصل حمار 10٪ المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز في 100 دورة في الدقيقة. بعد حجب, احتضان شبكية العين بين عشية وضحاها في 600 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الأولية التي تتكون من 1:100 PDGF مستقبلات بيتا و 1:500 NG2 الأجسام المضادة الأولية المخففة في 10٪ مصل الحمير وبرنامج تلفزيوني.
في اليوم التالي ، شطف شبكة شبكية العين ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق في كل مرة ، ثم احتضان في 1:100 المضادة للماوس اليكسا فلور 594th المرتبطة و 1:100 المضادة للأرانب FITC ، المخفف في مصل 10 ٪ حمار وبرنامج تلفزيوني مع اهتزاز في 100 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد غسل لمدة خمس دقائق في PBST ، احتضان في 0.2 نانوغرام لكل ملليلتر DAPI وBBST لمدة 15 دقيقة. غسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع PBST بينما محمية من الضوء.
المقبل، وقطع غيض من ماصة باستور البلاستيك. إزالة حواف حادة باستخدام طرف ماصة، وترطيب ماصة باستور مع PBST، ثم pirate الأوعية الدموية الشبكية في الماصات والاستغناء في شريحة غرفة زجاجية أربعة بئر. خطوة ترطيب المهم لتجنب الأوعية الشبكية التمسك داخل ماصة باستور.
ضع الأوعية الدموية الشبكية عن طريق إمالة الشريحة الغرفة ذهابا وإيابا. قم بإزالة الوسيط من آبار الشريحة. سوف التوتر السطحي للسائل تسطيح الأوعية الدموية على الجزء السفلي من الشريحة.
إذا لزم الأمر، قطرات بالتنقيط من السائل على الأوعية الدموية الشبكية لتتكشف. تأكد من صحة تتكشف تحت المجهر قبل إزالة الآبار البلاستيكية من الشريحة الغرفة. جبل الأوعية الدموية الملون مع مكافحة يتلاشى تصاعد المتوسطة وزلة الغطاء.
NG2 علم المناعة يكشف عن الأوعية الإيجابية داخل الجزء الداخلي من شبكية العين. تشير الأسهم إلى النشاط المناعي الدائري والخوهوة على شكل حدوة حصان في الأوعية. يشير رأس السهم إلى وعاء مقطوع طولي.
PDGF مستقبلات بيتا المناعة الكيمياء يظهر المناعي مماثلة لNG2. مرة أخرى تشير الأسهم و رأس السهم إلى نشاط المناعة في الأوعية. هذه الصورة تظهر دمج NG2 باللون الأخضر، بيتا مستقبلات PDGF باللون الأحمر، وDAPI باللون الأزرق.
من خلال فرض مرشحات ثلاثة مختلفة ، يتم الكشف عن أن NG2 و PDGF مستقبلات بيتا هي موضعية. تُظهر هذه الصورة إعدادًا كاملًا مُثبّتًا من المُنَاع مع تلطيخ NG2 باللون الأحمر. المناعة مرئية على طول شبكة الأوعية الدموية السطحية مع تلطيخ مكثف في pericytes abluminal.
الخلايا العصبية مرئية كما النوى الزرقاء DAPI بين vavasculature الملطخة ب NG2. تُظهر هذه الصورة شبكة الأوعية الدموية الشبكية الشبكية الجرذان المعزولة المهزلة الملطخة بـ NG2 باللون الأخضر وبيتا مستقبلات PDGF باللون الأحمر. وأظهرت الشبكة الكاملة NG2-المناعي.
تم العثور على PDGF مستقبلات بيتا المناعية في somas الخلية. في التكبير أعلى, فمن الواضح أن يتم رؤية تلطيخ بيتا مستقبلات PDGF فقط في سوما الخلية في شبكة الأوعية الدموية, مما يدل على النشاط المناعي pericyte. بما في ذلك تلطيخ DAPI مع NG2 و PDGF مستقبلات بيتا يكشف عن ثلاثة pericytes في اثنين من خلايا جدار السفينة غير محددة في هذه الصورة عالية التكبير.
بعد هذه الإجراءات، يمكن استخدام مناعة أخرى مثل خلايا العضلات الملساء أو البقع البطانية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال، كيف تبدو الخلايا في الأوعية الدموية الشبكية بعد نقص التروية؟
