Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ophtalmologie telles que la prolifération des péricyte ou la migration. Le principal avantage de ces procédures est qu’elles offrent une variété d’options de visualisation. Karin Dreisig et Frank W.Blixt, deux post-docs de notre laboratoire, démontreront les procédures.
Pour enucleate l’oeil, d’abord utiliser un scalpel pour faire les fentes postérieures et antérieures d’environ 0,5 centimètres dans la paupière du rat. Saisir l’œil avec des forceps et incliner soigneusement sur le côté pour exposer le tissu environnant. Enucleate l’œil en faisant des coupes avec des ciseaux de dissection dans le tissu conjonctif et musculaire.
Placez brièvement l’œil dans du formaldéhyde à 4 % et de la solution saline tamponnée de phosphate pendant une à deux minutes. Rincer brièvement dans un tampon de sodium avant de faire un trou dans les limbes cornéens en appliquant une légère pression avec la pointe d’un scalpel. Couper le long du limbe cornéen avec des ciseaux de dissection pour enlever la cornée et la lentille avec des forceps.
Submerger le tissu restant avec la rétine dans 4% de formaldéhyde dans PBS pendant deux à quatre heures. Cryo-protéger le tissu en immergeant dans le tampon de phosphate de Sorenson contenant 10% de saccharose, puis 25% de saccharose. Transférer le tissu une fois qu’il a coulé au fond du récipient.
Intégrer dans yazulla moyen préparé avec 3% de gélatine de la peau porcine et 30% albumine de blanc d’œuf de poulet. Ensuite, coupez des cryosections verticales de 10 microns de la rétine gélatine-incorporée par le nerf optique. Déposer les cryosections sur une glissière en verre et laisser sécher pendant au moins une heure.
Une fois sec, submerger la glissière dans PBS avec 0,25%Triton-X 100 pendant 15 minutes. Puis, goutte à goutte un mélange de 1:100 récepteur PDGF bêta et 1:500 NG2 anticorps primaires dans PBST et 1%BSA sur la cryosection et placer dans une chambre humide à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lavez les sections en immergeant la diapositive en PBST deux fois pendant 15 minutes à chaque fois.
Puis goutte à goutte un mélange de 1:100 anti-souris Alexa Fluor 594 liés et 1:100 anticorps secondaires anti-lapin fitc dilués dans PBST avec 3%BSA sur les cryosections et incuber pendant une heure dans l’obscurité. Après l’incubation, rincer la lame de verre en PBST deux fois pendant 15 minutes à chaque fois. Montez les cryosections tachées avec un support de montage anti-décoloration contenant dapi et un coverslip.
Une deuxième technique de préparation des tissus rétiniens est la monture entière. Après l’ablation de la cornée, utilisez de petits mouvements d’ouverture de forceps pour séparer la rétine de l’épithélium pigmentaire rétinien vers le nerf optique. Libérez la rétine du nerf optique avec des ciseaux de dissection et faites trois à quatre fentes de quelques millimètres de longueur de la périphérie rétinienne vers la tête du nerf optique.
Étendre la rétine sur une glissière en verre et laisser sécher de cinq à dix minutes. Goutte à goutte 4% formaldéhyde sur la rétine et fixer pendant 20 à 30 minutes. Après la fixation, rincer à l’aide de PBS.
Pour des résultats optimaux, immunostain directement après rinçage. Tout d’abord, goutte à goutte PBST sur l’ensemble de la monture et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Verser le PBST, puis ajouter la solution d’anticorps primaire et incuber dans une chambre humide à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, versez l’anticorps primaire et égouttez-vous sur le PBST pour rincer la rétine deux fois pendant 15 minutes à chaque fois. Après avoir versé le deuxième lavage, égouttez la solution secondaire d’anticorps sur la rétine et couvez pendant une heure dans une chambre humide à température ambiante dans l’obscurité. Après l’incubation secondaire d’anticorps, lavez-les deux fois avec le PBST comme avant.
Montez la monture entière tachée avec un support de montage anti-décoloration contenant du DAPI et un glissement de couverture. Alternative au montage entier de la rétine, la vascularisation rétinienne peut être isolée par isolation hypotonique. Tout d’abord, placez la rétine dans un millilitre d’eau déionisée dans une plaque de 24 puits et secouez à 200 tours avec une orbite de vibration de 1,5 millimètre pendant une heure à température ambiante, puis ajoutez 200 unités de DNAse 1 pour dissocier les débris cellulaires lysés de la vascularisation rétinienne et secouer pendant encore 30 minutes à température ambiante.
Rincer la rétine à l’eau déionisée pendant trois fois pendant cinq minutes chacune en secouant à 150 à 300 tours pour enlever les débris cellulaires neuronaux. La rétine devrait devenir plus transparente à chaque rinçage, ce qui indique l’enlèvement des débris cellulaires neuronaux. Après le rinçage, fixer la rétine en un millilitre de 4% de paraformaldéhyde et PBS pendant 10 minutes à température ambiante.
Rincer à l’aide de PBS trois fois. Si vous procédez à l’immunostaining, bloquez la vascularisation hypotonique-isolée avec 500 microlitres de sérum d’âne de 10% dilués dans PBS pendant une heure avec secouant à 100 rpm. Après blocage, incuber la rétine pendant la nuit dans 600 microlitres de solution primaire d’anticorps composée de 1:100 PDGF-récepteur bêta et 1:500 NG2 anticorps primaires dilués dans 10% sérum d’âne et PBS.
Le lendemain, rincez le réseau rétinien trois fois en PBS pendant cinq minutes à chaque fois, puis incubez en 1:100 anti-souris Alexa Fluor 594e lié et 1:100 anticorps secondaires anti-lapin fitc liés, dilués dans 10% sérum d’âne et PBS avec secouant à 100 rpm à température ambiante pendant une heure dans l’obscurité. Après un lavage de cinq minutes en PBST, incuber en DAPI de 0,2 nanogramme par millilitre et PBST pendant 15 minutes. Laver trois fois pendant cinq minutes avec le PBST tout en étant protégé de la lumière.
Ensuite, coupez la pointe d’une pipette Pasteur en plastique. Retirez les bords tranchants à l’aide d’une pointe de pipette et humidifiez la pipette Pasteur avec le PBST, puis aspirez la vasculature rétinienne dans la pipette et distribuez-la dans une glissière de chambre en verre de quatre puits. L’étape d’humidifier est importante pour éviter que la vascularisation rétinienne colle à l’intérieur de la pipette Pasteur.
Placez la vascularisation rétinienne en inclinant la chambre glisser d’avant en arrière. Retirer le milieu des puits de la glissière de chambre. La tension de surface du liquide aplatira la vascularisation sur le fond de la glissière.
Si nécessaire, gouttes de liquide sur la vascularisation rétinienne pour se dérouler. Assurez-vous de bien se dérouler au microscope avant d’enlever les puits en plastique de la glissière de la chambre. Montez la vasculature tachée avec le milieu de montage anti-décoloration et un glissement de couverture.
L’immunohistochimie NG2 révèle des vaisseaux positifs dans la partie interne de la rétine. Les flèches indiquent une immunoréactivité circulaire et en forme de fer à cheval dans les vaisseaux. La pointe de flèche indique un récipient coupé longitudilement.
L’immunohistochimie bêta de PDGF-récepteur montre l’immunoréactivité semblable à NG2. Encore une fois, les flèches et la pointe des flèches indiquent l’immunoréactivité dans les vaisseaux. Cette image montre une fusion de NG2 en vert, pdgf-récepteur bêta en rouge, et DAPI en bleu.
En superposant les trois filtres différents, il est révélé que ng2 et PDGF-récepteur bêta sont co-localisés. Cette image montre une préparation immunotachée de montage entier avec des taches NG2 en rouge. L’immunoréactivité est visible le long du réseau vasculaire superficiel avec des taches intenses chez les péricytes abluminaux.
Les cellules neuronales sont visibles sous forme de noyaux bleus DAPI entre la microvasculature teintée de NG2. Cette image montre le réseau vasculaire rétinien isolé hypotonique de rat taché avec NG2 dans la bêta verte et PDGF-récepteur en rouge. Le réseau complet a montré NG2-immunoréactivité.
L’immunoréactivité bêta de PDGF-récepteur a été trouvée dans les somas cellulaires. À grossissement plus élevé, il est clair que la coloration bêta de PDGF-récepteur n’est vue que dans les somas cellulaires dans le réseau vasculaire, indiquant l’immunoréactivité péricyte. Y compris la coloration DAPI avec NG2 et PDGF-récepteur bêta révèle trois péricytes dans deux cellules murales vaisseau indéfini dans cette image de grossissement élevé.
Suite à ces procédures, d’autres immunostainings comme la cellule musculaire lisse ou les taches endothéliales peuvent être utilisés afin de répondre à des questions supplémentaires. Par exemple, à quoi ressemblent les cellules de la vascularisation rétinienne après l’ischémie?
