Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области офтальмологии, такие как перицитное распространение или миграция. Основным преимуществом этой процедуры является то, что они предоставляют различные варианты визуализации. Демонстрация процедур будет Карин Dreisig и Фрэнк W.Blixt, два пост-документы в нашей лаборатории.
Чтобы окутать глаз, сначала используйте скальпель, чтобы сделать задние и передние щели примерно 0,5 сантиметра в веко крысы. Захватите глаз миппами и осторожно наклоните в сторону, чтобы разоблачить окружающие ткани. Enucleate глаз, делая порезы с рассечением ножницами в соединительной и мышечной ткани.
Кратко поместите глаз в 4%формальдегида и фосфат-буферного солевого раствора в течение одной-двух минут. Промыть кратко в буфер натрия, прежде чем отверстие в лимбуса роговицы, применяя легкое давление с кончиком скальпеля. Вырезать вдоль роговицы лимбуса с ножницами вскрытия, чтобы удалить роговицу и хрусталик с миппами.
Погрузите оставшуюся ткань с сетчаткой в 4%формальдегид в PBS в течение двух-четырех часов. Крио-защита ткани путем погружения в фосфатный буфер Соренсона, содержащий 10% сахарозы, а затем 25% сахарозы. Перенесите ткань после того, как она опустилась на дно контейнера.
Вставлять в Yazulla среднего подготовлены с 3%gelatine из свиной кожи и 30%альбумин из куриного яичного белка. Затем вырежьте 10-микрон вертикальные криозеты желатин-встроенной сетчатки до зрительного нерва. Поместите cryosections на стеклянную горку и дайте высохнуть в течение как минимум одного часа.
После высыхания, погрузите слайд в PBS с 0,25%Triton-X 100 в течение 15 минут. Затем капать смесь 1:100 PDGF рецептор бета и 1:500 NG2 первичных антител в PBST и 1%BSA на крик и место во влажной камере при четырех градусах Цельсия в одночасье. На следующий день, мыть разделы, погружая слайд в PBST два раза в течение 15 минут каждый раз.
Затем капать смесь 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-связанных и 1:100 Anti-Rabbit FITC связанных вторичных антител, разбавленных в PBST с 3%BSA на криозиции и инкубировать в течение одного часа в темноте. После инкубации, промыть стеклянную горку в PBST два раза в течение 15 минут каждый раз. Гора окрашенных cryosections с анти-увядание монтажа среды, содержащей DAPI и coverslip.
Второй метод подготовки тканей сетчатки является цельно-монтаж. После удаления роговицы, использовать небольшие движения открытия типсов, чтобы отделить сетчатку от пигмента сетчатки эпителия к зрительному нерву. Освободите сетчатку зрительного нерва ножницами и сделайте три-четыре прорези длиной в несколько миллиметров от периферии сетчатки к голове зрительного нерва.
Распредельте сетчатку на стеклянную горку и дайте высохнуть в течение пяти-десяти минут. Опустите 4%формальдегид на сетчатку и исправить в течение 20 до 30 минут. После фиксации, промыть PBS.
Для достижения оптимальных результатов, иммуностина сразу после полоскания. Во-первых, капать PBST на всю гору и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут. Слейте PBST, а затем добавить первичный раствор антитела и инкубировать во влажной камере при четырех градусах по Цельсию на ночь.
На следующий день, слить первичные антитела и капать на PBST для полоскания сетчатки дважды в течение 15 минут каждый раз. После заливки второй стирки, капельного вторичного раствора антитела на сетчатку и инкубировать в течение одного часа во влажной камере при комнатной температуре в темноте. После вторичной инкубации антител, мыть дважды с PBST, как и раньше.
Гора окрашенных цельно-монтаж с анти-увядание монтажа среды, содержащей DAPI и крышка скольжения. Альтернативой полной монтаж сетчатки, сосуды сетчатки могут быть изолированы гипотонической изоляции. Во-первых, поместите сетчатку в один миллилитр деионизированной воды в 24-хорошо пластины и встряхнуть при 200 об /мин с 1,5-миллиметровой орбиты вибрации в течение одного часа при комнатной температуре, а затем добавить 200 единиц DNAse 1, чтобы отмежеваться от lysed клеточного мусора из сетчатки сосуда и встряхнуть еще 30 минут при комнатной температуре.
Промыть сетчатку в деионизированной воде в течение трех раз в течение пяти минут каждый с встряхивания на 150 до 300 об / мин для удаления нейрональных клеток мусора. Сетчатка должна стать более прозрачной с каждым полоскать, что свидетельствует об удалении нейронального клеточного мусора. После полоскания, исправить сетчатки в один миллилитр 4%paraformaldehyde и PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.
Промыть PBS три раза. При переходе к иммуностимулятору блокируйте гипотонико-изолированную сосудообразуемую сосуды с 500 микролитров сыворотки 10%осла, разбавленной в PBS в течение одного часа при тряске при 100 об/мин. После блокирования инкубировать сетчатку на ночь в 600 микролитров первичного раствора антител, состоящий из 1:100 PDGF-рецептор бета и 1:500 NG2 первичных антител, разбавленных в 10%donkey сыворотки и PBS.
На следующий день, промыть сетчатки сети три раза в PBS в течение пяти минут каждый раз, а затем инкубировать в 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-связанных и 1:100 Anti-Rabbit FITC связанных вторичных антител, разбавленных в 10%donkey сыворотки и PBS с тряской при температуре 100 об/мин при комнатной температуре в течение одного часа в темноте. После пятиминутной стирки в PBST, инкубировать в 0,2 нанограмма на миллилитр DAPI и PBST в течение 15 минут. Вымойте три раза в течение пяти минут с PBST в то время как защищены от света.
Затем вырежьте кончик пластиковой пипетки Pasteur. Удалите острые края с помощью наконечника пипетки, и смочьте пастер пипетку с PBST, а затем аспирировать сосуды сетчатки в пипетку и обойтись в четыре хорошо стеклянная камера слайд. Увлажняющий шаг имеет важное значение, чтобы избежать сосудов сетчатки прилипания к внутренней части трубы Пастера.
Распоитить сосуды сетчатки, наклоняя камеру слайд вперед и назад. Удалите среду из колодцев камерного слайда. Поверхностное натяжение жидкости сгладит сосуды на дно слайда.
При необходимости, капельные капли жидкости на сосуды сетчатки разворачиваться. Убедитесь, что правильно разворачивается под микроскопом, прежде чем удалить пластиковые скважины из камеры слайда. Намонтировать окрашенные сосуды с анти-увядание монтажа среды и крышки скольжения.
Иммуногистохимия NG2 выявляет положительные сосуды во внутренней части сетчатки. Стрелки указывают на круговую и подковообразную иммунореактивность сосудов. Наконечник стрелы указывает на продольно разрезанное судно.
PDGF-рецептор бета иммуногистохимия показывает аналогичную иммунореактивность NG2. Снова стрелки и наконечник стрелы указывают на иммунореактивность сосудов. На этом изображении показано слияние NG2 в зеленый цвет, БЕТА-рецептор PDGF - в красном, а DAPI - в синем.
Путем намерить 3 по-разному фильтра, показано что бета NG2 и PDGF-рецептор co-локализованы. На этом снимке показан иммуноолентный цельно-монтажный препарат с окрашивание NG2 в красный цвет. Иммунореактивность видна вдоль поверхностной сосудистой сети с интенсивным окрашивание в аблюминальные перициты.
Нейронные клетки видны как daPI синие ядра между NG2-окрашенных микроваскакулатуры. На этом снимке показана гипотоническая изолированная крысиная сосудистая сеть сетчатки, окрашенная NG2 в зеленый цвет и бета-рецептор PDGF-рецептор в красном цвете. Полная сеть показала NG2-иммунореактивность.
PDGF-рецептор бета иммунореактивности был найден в клеточной сомы. При более высоком увеличении, ясно, что PDGF-рецептор бета-окрашивания наблюдается только в клеточной сомы в сосудистой сети, что указывает на перицит иммунореактивности. В том числе DAPI окрашивания вместе с NG2 и PDGF-рецептор бета показывает три перицита в двух неопределенных клеток стенки сосуда в этом высоком увеличении изображения.
После этих процедур, другие иммуностимуляторы, такие как гладкая мышечная клетка или эндотелиальные окрашивания могут быть использованы для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, как клетки в сосудах сетчатки выглядят следующими ишемией?
