Esses métodos podem ajudar a responder a perguntas-chave no campo da oftalmologia, como a proliferação de pericílitos ou a migração. A principal vantagem deste procedimento é que eles fornecem uma variedade de opções de visualização. Demonstrando os procedimentos serão Karin Dreisig e Frank W.Blixt, dois pós-doutores em nosso laboratório.
Para enuclear o olho, primeiro use um bisturi para fazer as fendas posteriores e anteriores de aproximadamente 0,5 centímetros na pálpebra de rato. Pegue o olho com fórceps e incline cuidadosamente para o lado para expor o tecido circundante. Enuclear o olho fazendo cortes com tesoura de dissecção no tecido conjuntivo e muscular.
Coloque brevemente o olho em 4% de formaldeído e salina tamponada com fosfato por um a dois minutos. Enxágüe brevemente no tampão de sódio antes de fazer um furo no limbus da córnea aplicando pressão leve com a ponta de um bisturi. Corte ao longo do limbus da córnea com uma tesoura de dissecção para remover a córnea e a lente com fórceps.
Submergir o tecido restante com retina em 4% de formaldeído na PBS por duas a quatro horas. Crio-proteger o tecido imergindo no tampão fosfato de Sorenson contendo 10% de sacarose e, em seguida, 25% de sacarose. Transfira o tecido uma vez que tenha afundado para o fundo do recipiente.
Embutido em yazulla médio preparado com 3% de gelatina de pele suína e 30% albumina de clara de ovo de galinha. Em seguida, corte crioseções verticais de 10 mícrons da retina incorporada à gelatina até o nervo óptico. Coloque as crioseções em um escorregador de vidro e deixe secar por pelo menos uma hora.
Uma vez seco, submergir o slide em PBS com 0,25% Triton-X 100 por 15 minutos. Em seguida, gotejar uma mistura de 1:100 PDGF receptor beta e 1:500 NG2 anticorpos primários em PBST e 1%BSA na criosecção e colocar em uma câmara úmida a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave as seções imergindo o slide no PBST duas vezes por 15 minutos cada vez.
Em seguida, gotejar uma mistura de 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-linked e 1:100 Anticorpos secundários ligados ao FITC anti-coelho diluídos em PBST com 3%BSA nas crioseções e incubar por uma hora no escuro. Após a incubação, enxágue o deslizamento de vidro em PBST duas vezes por 15 minutos cada vez. Monte as crioseções manchadas com meio de montagem anti-desbotamento contendo DAPI e um deslizamento de tampa.
Uma segunda técnica de preparação de tecido retiniano é de montagem total. Após a remoção da córnea, use pequenos movimentos de abertura de fórceps para separar a retina do epitélio pigmento da retina em direção ao nervo óptico. Liberte a retina no nervo óptico com uma tesoura de dissecção e faça de três a quatro fendas de alguns milímetros da periferia da retina em direção à cabeça do nervo óptico.
Espalhe a retina em uma lâmina de vidro e deixe secar por cinco a 10 minutos. Gotejar 4% de formaldeído na retina e fixe por 20 a 30 minutos. Após a fixação, enxágue com PBS.
Para obter resultados ideais, imunostain diretamente após a lavagem. Primeiro, gotejar PBST sobre o monte inteiro e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Despeje o PBST, em seguida, adicione a solução de anticorpos primários e incubar em uma câmara úmida a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, despeje o anticorpo primário e gotejamento no PBST para enxaguar a retina duas vezes por 15 minutos cada vez. Depois de derramar a segunda lavagem, gotejar a solução de anticorpos secundários na retina e incubar por uma hora em uma câmara úmida à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação de anticorpos secundários, lave duas vezes com PBST como antes.
Monte o conjunto manchado inteiro com meio de montagem anti-desbotamento contendo DAPI e um deslizamento de cobertura. Alternativa à montagem integral da retina, a vasculatura da retina pode ser isolada pelo isolamento hipotônico. Primeiro, coloque a retina em um mililitro de água deionizada em uma placa de 24 poços e agite a 200 rpm com uma órbita de vibração de 1,5 milímetros por uma hora à temperatura ambiente, depois adicione 200 unidades de DNAse 1 para dissociar os detritos celulares da vasculatura da retina e agitar por mais 30 minutos em temperatura ambiente.
Enxágüe a retina em água deionizada por três vezes por cinco minutos cada, tremendo a 150 a 300 rpm para remover detritos de células neuronais. A retina deve ficar mais transparente a cada enxágue, indicativo da remoção de detritos celulares neuronais. Após a lavagem, fixe a retina em um mililitro de 4% de paraformaldeído e PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.
Enxágüe com PBS três vezes. Se continuar para a imunossucultura, bloqueie a vasculatura hipotônica isolada com 500 microlitres de soro de burro de 10% diluídos na PBS por uma hora com tremor a 100 rpm. Após o bloqueio, incubar a retina durante a noite em 600 microliters de solução de anticorpos primários consistindo de 1:100 PDGF-receptor beta e 1:500 NG2 anticorpos primários diluídos em 10% de soro de burro e PBS.
No dia seguinte, enxágue a rede de retina três vezes na PBS por cinco minutos cada vez, depois incubar em 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-ligado e 1:100 anticorpos secundários ligados ao FITC anti-coelho, diluídos em 10% de soro de burro e PBS com agitação a 100 rpm à temperatura ambiente por uma hora no escuro. Após uma lavagem de cinco minutos no PBST, incubar em 0,2 nanogramas por mililitro DAPI e PBST por 15 minutos. Lave três vezes por cinco minutos com PBST enquanto estiver protegido contra a luz.
Em seguida, corte a ponta de uma pipeta pasteur de plástico. Remova as bordas afiadas usando uma ponta de pipeta e umedeça a pipeta Pasteur com PBST, depois aspire a vasculatura de retina na pipeta e dispense em um slide de câmara de vidro de quatro poços. O passo umedecido é importante para evitar que a vasculatura de retina grude no interior da pipeta Pasteur.
Posicione a vasculatura da retina inclinando o deslizamento da câmara para frente e para trás. Remova o meio dos poços do deslizamento da câmara. A tensão superficial do líquido achatará a vasculatura na parte inferior do slide.
Se necessário, gotejamento de gotas de líquido sobre a vasculatura da retina para se desdobrar. Certifique-se de desdobrar corretamente sob um microscópio antes de remover os poços de plástico do escorregador da câmara. Monte a vasculatura manchada com meio de montagem anti-desbotamento e um deslizamento de cobertura.
A imunohistoquímica NG2 revela vasos positivos na parte interna da retina. As setas indicam imuno-reatividade circular e em forma de ferradura nos vasos. A ponta da flecha aponta um vaso longitudinalmente cortado.
A imunohistoquímica beta do receptor PDGF mostra imunoreatividade semelhante ao NG2. Novamente as flechas e a ponta da flecha indicam imunoreatividade nos vasos. Esta imagem mostra uma fusão de NG2 em verde, beta receptor PDGF em vermelho e DAPI em azul.
Ao sobrepor os três filtros diferentes, é revelado que o NG2 e o receptor beta do PDGF são co-localizados. Esta imagem mostra uma preparação de montagem completa imunostained com coloração NG2 em vermelho. A imunoreatividade é visível ao longo da rede vascular superficial com manchas intensas em pericítos abluminais.
As células neuronais são visíveis como núcleos azuis DAPI entre a microvasculatura manchada de NG2. Esta imagem mostra a rede vascular de retina de rato isolado hipotônico manchada com NG2 em verde e pdgf-receptor beta em vermelho. A rede completa mostrou NG2-imunoreatividade.
A imunoreatividade beta do receptor PDGF foi encontrada em somas celulares. Em maior ampliação, é claro que a coloração beta do receptor PDGF só é vista em somas celulares na rede vascular, indicando imunoreatividade pericíte. Incluindo a coloração da DAPI juntamente com NG2 e PDGF-receptor beta revela três pericílitos em duas células de parede de vasos indefinidas nesta imagem de alta ampliação.
Após esses procedimentos, outras imunostenções como células musculares lisas ou manchas endoteliais podem ser usadas para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, como as células da vasculatura da retina parecem seguir a isquemia?
