Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'oftalmologia come la proliferazione dei perciti o la migrazione. Il vantaggio principale di questa procedura è che forniscono una varietà di opzioni di visualizzazione. A dimostrare le procedure saranno Karin Dreisig e Frank W.Blixt, due post-doc del nostro laboratorio.
Per enucleare l'occhio, utilizzare prima un bisturi per fare le fessure posteriori e anteriori di circa 0,5 centimetri nella palpebra del topo. Afferrare l'occhio con le forcep e inclinarsi con cura di lato per esporre il tessuto circostante. Enucleare l'occhio facendo tagli con forbici di dissezione nel tessuto connettivo e muscolare.
Posizionare brevemente l'occhio in formaldeide al 4% e salina tamponata da fosfati per uno o due minuti. Risciacquare brevemente nel tampone di sodio prima di fare un buco al limbo corneale applicando una leggera pressione con la punta di un bisturi. Tagliare lungo il limbo corneale con forbici di dissezione per rimuovere la cornea e la lente con le forcep.
Immergere il tessuto rimanente con retina in formaldeide al 4% in PBS per due o quattro ore. Crioprotegga il tessuto immergendosi nel tampone fosfato di Sorenson contenente il 10% di saccarosio e quindi il 25% di saccarosio. Trasferire il tessuto una volta affondato sul fondo del contenitore.
Incorporare nel mezzo Yazulla preparato con il 3% di gelatina di pelle suina e il 30% di albumina di albume d'uovo di gallina. Quindi, tagliare le criosezioni verticali da 10 micron della retina incorporata nella gelatina fino al nervo ottico. Posizionare le criosezioni su uno scivolo di vetro e lasciare asciugare per un minimo di un'ora.
Una volta asciutto, immergere lo scivolo in PBS con 0,25%Triton-X 100 per 15 minuti. Quindi, gocciolare una miscela di 1:100 beta del recettore PDGF e 1:500 anticorpi primari NG2 in PBST e 1%BSA sulla criosezione e posizionare in una camera umida a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare le sezioni immergendo lo scivolo in PBST due volte per 15 minuti ogni volta.
Quindi gocciolare una miscela di anticorpi secondari collegati ad Alexa Fluor 594 anti-topo 1:100 e 1:100 anti-coniglio collegati al FITC diluiti in PBST con 3%BSA sulle criosezioni e incubare per un'ora al buio. Dopo l'incubazione, sciacquare lo scivolo di vetro in PBST due volte per 15 minuti ogni volta. Montare le criosezioni macchiate con un supporto di montaggio anti-dissolvenza contenente DAPI e un coverslip.
Una seconda tecnica di preparazione del tessuto retinale è a montaggio intero. Dopo la rimozione della cornea, utilizzare piccoli movimenti di apertura delle forcep per separare la retina dall'epitelio pigmentato retinico verso il nervo ottico. Liberare la retina al nervo ottico con forbici di dissezione e fare da tre a quattro fessure di pochi millimetri di lunghezza dalla periferia retinica verso la testa del nervo ottico.
Stendere la retina su uno scivolo di vetro e lasciare asciugare per cinque o 10 minuti. Gocciolare il 4% di formaldeide sulla retina e fissare per 20-30 minuti. Dopo la fissazione, sciacquare con PBS.
Per risultati ottimali, immunosostenibile direttamente dopo il risciacquo. In primo luogo, gocciolare PBST sull'intero supporto e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Versare il PBST, quindi aggiungere la soluzione anticorpale primaria e incubare in una camera umida a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, versare l'anticorpo primario e gocciolare sul PBST per risciacquare la retina due volte per 15 minuti ogni volta. Dopo aver versato il secondo lavaggio, gocciolare la soluzione anticorpale secondaria sulla retina e incubare per un'ora in una camera umida a temperatura ambiente al buio. Dopo l'incubazione dell'anticorpo secondario, lavare due volte con PBST come prima.
Montare l'intero supporto colorato con supporto di montaggio anti-dissolvenza contenente DAPI e uno scivolo di copertura. Alternativa al montaggio completo della retina, la vascolarizzazione retinica può essere isolata dall'isolamento ipotonico. In primo luogo, posizionare la retina in un millilitro di acqua deionizzata in una piastra di 24 pozzetti e agitare a 200 giri/min con un'orbita di vibrazione di 1,5 millimetri per un'ora a temperatura ambiente, quindi aggiungere 200 unità di DNAsi 1 per dissociare i detriti cellulari lisciviati dalla vascucolatura retinica e agitare per altri 30 minuti a temperatura ambiente.
Risciacquare la retina in acqua deionizzata per tre volte per cinque minuti ciascuna con scuotimento a 150-300 giri/min per rimuovere i detriti cellulari neuronali. La retina dovrebbe diventare più trasparente ad ogni risciacquo, indicativa della rimozione dei detriti cellulari neuronali. Dopo il risciacquo, fissare la retina in un millilitro di paraformaldeide e PBS al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente.
Risciacquare con PBS tre volte. Se si procede all'immunostaining, bloccare la vascucolatura isolata dall'ipotonico con 500 microlitri di siero d'asino del 10% diluito in PBS per un'ora con scuotimento a 100 giri/min. Dopo il blocco, incubare la retina durante la notte in 600 microlitri di soluzione di anticorpi primari costituiti da 1:100 beta del recettore PDGF e 1:500 anticorpi primari NG2 diluiti nel siero di asino al 10% e PBS.
Il giorno successivo, sciacquare la rete retinica tre volte in PBS per cinque minuti ogni volta, quindi incubare in anticorpi secondari collegati ad Alexa Fluor 594th anti-mouse 1:100 anti-coniglio e 1:100 anticorpi secondari collegati al FITC anti-coniglio, diluiti nel siero di asino al 10% e PBS con scuotimento a 100 giri/min a temperatura ambiente per un'ora al buio. Dopo un lavaggio di cinque minuti in PBST, incubare in DAPI e PBST da 0,2 nanogrammi per millilitro per 15 minuti. Lavare tre volte per cinque minuti con PBST mentre è protetto dalla luce.
Quindi, tagliare la punta di una pipetta Pasteur di plastica. Rimuovere i bordi affilati utilizzando una punta di pipetta e inumidire la pipetta Pasteur con PBST, quindi aspirare la vascucolatura retinica nella pipetta e erogare in uno scivolo a camera di vetro a quattro pozza. Il passo inumidimento è importante per evitare che la vascolarizzazione retinica si attacchi all'interno della pipetta Pasteur.
Posizionare la vascolarizzazione retinica inclinando lo scivolo della camera avanti e indietro. Rimuovere il supporto dai pozzi dello scivolo della camera. La tensione superficiale del liquido appiattirà la vascucolatura sul fondo dello scivolo.
Se necessario, gocciolare gocce di liquido sulla vascolarizzazione retinica per svolgersi. Assicurarsi che lo svolgimento corretto al microscopio prima di rimuovere i pozzali di plastica dallo scivolo della camera. Montare la vascucolatura macchiata con mezzo di montaggio anti-dissolvenza e uno scivolo di copertura.
L'immunoistochimica NG2 rivela vasi positivi all'interno della parte interna della retina. Le frecce indicano un'immunoreattività circolare e a forma di ferro di cavallo nei vasi. La punta della freccia indica un vaso tagliato longitudinalmente.
L'immunoistochimica beta del recettore PDGF mostra un'immunoreattività simile a NG2. Ancora una volta le frecce e la punta della freccia indicano l'immunoreattività nei vasi. Questa immagine mostra un'unione di NG2 in verde, beta del recettore PDGF in rosso e DAPI in blu.
Sovrapponendo i tre diversi filtri, viene rivelato che NG2 e PDGF-receptor beta sono co-localizzati. Questa immagine mostra una preparazione immunosostenibile a montaggio intero con colorazione NG2 in rosso. L'immunoreattività è visibile lungo la rete vascolare superficiale con colorazione intensa nei periciti abluminali.
Le cellule neuronali sono visibili come nuclei blu DAPI tra la microvascolarizzazione macchiata di NG2. Questa immagine mostra la rete vascolare retinica interna del ratto isolata ipotonica macchiata con NG2 in verde e beta del recettore PDGF in rosso. L'intero network ha mostrato NG2-immunoreattività.
L'immunoreattività beta del recettore PDGF è stata trovata nei somi cellulari. Ad un ingrandimento più elevato, è chiaro che la colorazione beta del recettore PDGF è osservata solo nei somi cellulari nella rete vascolare, indicando l'immunoreattività dei perciti. L'inclusione della colorazione DAPI insieme alla beta del recettore NG2 e PDGF rivela tre periciti in due celle a parete di vasi indefinite in questa immagine ad alto ingrandimento.
Seguendo queste procedure, altre immunosottenizioni come cellule muscolari lisce o colorazioni endoteliali possono essere utilizzate per rispondere a domande aggiuntive. Ad esempio, come stanno le cellule della vascucolatura retinica dopo l'ischemia?
