Name: subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

المؤلف تقر مساعدة لوبيز أندير وميرين تيليتكسيا لتسجيل الفيديو وتحريرها. وتمول ACR زمالة إيكيرباسك ومشروع بحثي من رابطة سيلياكوس دي مدريد (ACM). جرب الممولة من مشروع إيسسيي-PI16/00258 والممول من "الاتحاد الأوروبي" سيطلب/كلية العلوم التربوية "طريقة لجعل أوروبا". من هو ممول بمنحه مشروع بحوث 2015111068 من "وزارة الصحة إقليم الباسك". سيبحث و AJM معتمدة بمنح زمالة بريدوكتورال من UPV/اهو وإدارة التعليم في إقليم الباسك، على التوالي.

وأقر "مجلس أخلاقيات مستشفى جامعة كروسيس" هذه الدراسة وأجريت التحاليل بعد أن تم الحصول على الموافقة المستنيرة من جميع المواضيع أو أولياء أمورهم.
1-خزعة جمع
ملاحظة: خزعة عينات من العفج القاصي من المرضى يتم الحصول عليها أثناء التنظير التشخيص الروتينية إدارة الخزعات التي تتراوح بين 2 و 10 ميكروغرام في الوزن. فحص الأنسجة نسيج معقد يتألف من أنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك الخلايا الظهارية، ومحصنة وبطانية. أخصائي أمراض الباطنة السريرية إجراء التنظير يلي المبادئ التوجيهية السريرية.
<ol><li>ضع الخزعة في ورقة تصفية عقيمة فقط بعد التنظير.</li>
	<li>استخدام الملقط لنقل الخزعات في أنابيب 1.5 مل ونقع عليها مع برنامج تلفزيوني، ووضعه في كريوتوبي.</li>
	<li>تبقى أنابيب على الجليد حتى وصولها المختبر.<ol>
<li>بدء تجهيز خزعات جديدة فورا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الخزعات المجمدة، فلاش تجميد خزعة تحتوي على أنابيب وتخزينها في النتروجين السائل حتى الاستخدام. ملاحظة: من المهم أن تبقى العينة المجمدة حتى تتم إضافة المخزن المؤقت تستكمل الباردة 1.</li>
</ol>2. إعداد المخزن المؤقت
ملاحظة: قبل البدء، الملحق المخازن المؤقتة على النحو التالي.
<ol><li>أضف 1 مم DTT (تركيز النهائية) ومبطلات والفوسفاتيز المانع كوكتيل (1 × التركيز النهائي) إلى المخزن المؤقت ناقص التوتر 1 ومكثف المخزن المؤقت 2 (الجدول 1).<ol>
<li>إعداد 1.5 مل من المخزن المؤقت 1 و 150 ميليلتر من المخزن المؤقت 2 كل عينة. سيتم منع DTT أكسدة العينات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد الأنوية يغسل المخزن المؤقت عن طريق إضافة المنظفات 1% (نونيل فينوكسيبوليثوكسيليثانول) بتركيز 0.1% إلى المخزن المؤقت تستكمل الفعل 1 نهائي. إعداد 1 مل من المخزن المؤقت ليغسل النوى كل عينة.</li>
</ol>3-خزعة التجانس
<ol><li>
خزعات جديدة
	<ol>
<li>ضع مدقة المتاح في خلاط يجهز. ضمان وصول المدقة إلى الجزء السفلي من الأنبوب.</li>
		<li>إخراج الخزعة من كريوتوبي ووضعه في أنبوب 1.5 مل مع تلميح ماصة.</li>
		<li>إضافة 200 ميليلتر لتستكمل المخزن المؤقت 1 إلى أنبوب 1.5 مل.</li>
		<li>مجانسة الخزعة مع المدقة حتى الأنسجة معطلة تماما وإبقائه على الجليد.</li>
		<li>حالما يتم تجانس جميع خزعات المضي قدما في الخطوة 4. ملاحظة: يجب تغيير المدقات المتاح بين الخزعات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
الخزعات المجمدة تنبيه: تعامل مع النتروجين السائل بعناية؛ اتصال النتروجين السائل مع الجلد أو العينين قد تسبب إصابة تجميد خطيرة. حماية اليدين والعينين دائماً عند العمل مع النتروجين السائل.<ol>
<li>تأخذ بعض النتروجين السائل في مربع لتخزين كريوتوبيس استردادها من خزان النتروجين.</li>
		<li>البحث عن الخزعة في خزان النتروجين ووضع في كريوتوبي في المربع مع النتروجين السائل. كرر هذه الخطوة لكل خزعات.</li>
		<li>نقل الخزعة من كريوتوبي إلى أنبوب 1.5 مل. ملاحظة: سوف يتم إرفاق خزعات لأنبوب المجمدة. دفع الخزعة مع تلميح ماصة معقمة حيث أنه سيتم فصل من الأنبوب.</li>
		<li>إضافة 200 ميليلتر لتستكمل المخزن المؤقت 1.</li>
		<li>مجانسة الأنسجة باستخدام مدقة وهاون حتى الأنسجة معطلة تماما، والحفاظ على درجة حرارة 4 درجة مئوية طوال جميع الإجراء. ملاحظة: لا تدع خزعات ذوبان الجليد قبل إضافة المخزن المؤقت.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-السيتوبلازم العزلة
<ol><li>احتضان خزعة المتجانس على الجليد لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>إضافة 10 ميليلتر من المنظفات 1% (نونيل فينوكسيبوليثوكسيليثانول) لكل عينة إلى نهائي تركز 0.05%. ملاحظة: سوف تضخم الخلايا وانفجر قبل تحلل ناضح كما سيتم تعطيل خفيف المنظفات غشاء الخلية.</li>
	<li>تبني على الجليد لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>الدوامة بإيجاز وأجهزة الطرد المركزي في ز 400 x في 4 ˚C ل 2 دقيقة.</li>
	<li>وبعد فورتيكسينج، إزالة المادة طافية ونقلها إلى أنبوب مل 1.5 نظيفة جديدة؛ وسوف يكون هذا الكسر هيولى. عدم تجاهل بيليه.</li>
</ol>5-المجال النووي العزلة
<ol><li>ريسوسبيند بيليه من الخطوة السابقة مع 200 ميليلتر نوى غسل المخزن المؤقت.</li>
	<li>الطرد المركزي في أنبوب لمدة 2 دقيقة على 400 x ز و 4 درجات مئوية.</li>
	<li>تجاهل المادة طافية وكرر الإجراء الغسيل مرتين أخريين. ملاحظة: يغسل إلى إزالة التلوث هيولى في الكسر النووية.</li>
	<li>بعد الغسيل الثالث، ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت 2.</li>
	<li>هزة العينة بقوة في ˚C 4 عن 30 دقيقة بدلاً من ذلك، احتضان العينة على الجليد ودوامه كل 5 دقائق.</li>
	<li>بعد الهز، الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقائق في سرعة قصوى (> 12,000 س ز) و 4 درجة مئوية.</li>
	<li>وبعد فورتيكسينج، بتحويل المادة طافية إلى 1.5 نظيفة جديدة. أنبوب مل. وسيكون هذا الكسر النووية.</li>
</ol>6-البروتين الكمي
ملاحظة: تحديد كمية البروتينات مع عدة مقايسة بروتين (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك. تركيز البروتينات في الكسور وسوف تتراوح بين 0.5 و 5 ميكروغرام/ميليلتر، عن انخفاض في الكسر النووي (انظر الجدول 2 لتركيزات البروتين الناتجة من خزعات 2 مغ).
<ol><li>إعداد منحنى قياسي مع ألبومين المصل البقري (BSA) التالي المبالغ (ميكروغرام)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>إعداد الكواشف اللازمة لاستخدام 100 ميليلتر من المزيج اتفاق التعاون الأساسي النهائي كل عينة.</li>
	<li>"الماصة؛" 2 ميليلتر من كل جزء من البروتين في طبق جيدا 96 وإضافة مزيج اتفاق التعاون الأساسي واتبع إرشادات الشركة المصنعة للقراءة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).</li><li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases:+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies.">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li><li>Ericsson, C., Franz&#233;n, B., Nist&#233;r, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling,+cryopreservation,+extraction,+and+use+for+proteomic+analysis.">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يستخدم بروتوكول الموصوفة هنا لتجزئة النووية وحشوية من الخزعات المعوية. البروتينات المنقاة هي عدم التشويه والتحريف ويمكن استخدامه ليس فقط في تحليل لطخة غربية كما هو مبين في الشكل 2 و 3 ولكن أيضا في الاختبارات التي تتطلب البروتينات مطوية أصلي مثل إيمونوبريسيبيتيشن، تنقل الغرواني الكهربي التحول المقايسة (أمسا) أو أصلي polyacrylamide هلام التفريد (صفحة).
الأسلوب وصف يعتمد على تجانس النسيج جنبا إلى جنب مع تحلل ناضح اندفاع غشاء الخلية دون التأثير على الغشاء النووي الميكانيكية. والنتيجة تجزئة نظيفة من البروتينات هيولى والنووية لاستخدامها لتحليل المتلقين للمعلومات. من المهم مراقبة تدهور البروتينات أثناء العملية بإضافة مثبطات البروتين والفوسفاتيز. وعلاوة على ذلك، إذا البروتينات المستخرجة التي ستستخدم لفحوصات الوظيفية المصب، من المهم أيضا تجنب تمسخ وبروتيوليسيس من العينات. ينبغي أن تجري العمليات في 4 درجات مئوية وتضاف بمسف أيضا للمخازن المؤقتة.
الإجراء الموصوفة في هذا البروتوكول بسيطة وميسورة، ووقت التجهيز بعينه الحد الأدنى. المشاكل مثل أوقات المعالجة منذ فترة طويلة، واستخدام مجموعات تجزئة مكلفة لا قيود في هذا البروتوكول.
الخزعات طازجة ومجمدة على حد سواء استخدامها في هذا البروتوكول، مع الخزعات المجمدة إعطاء نتائج تجزئة جداً نظيفة واستنساخه كما هو مبين في الشكل 2 و 3. إذا لم يكن هناك حجرة التلوث، يمكن تخفيض الوقت تحلل الخلية لتجنب إطلاق النووي إلى السيتوبلازم والغسيل خطوات يمكن أن تضاف إلى تجنب التلوث هيولى في حجرة النووية.
يمكن زيادة إمكانية استخدام الأنسجة المجمدة لتحليل مستقل للكسور البروتين النووي وهيولي معرفتنا حول أمراض التهاب الأمعاء يتم فيه تخزين الخزعات المجمدة. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يمكن تكييفها وفقا لأنواع أخرى من الأنسجة البشرية المكتسبة من الخزعات. يجب أن يتم تعديل حجم المخازن المؤقتة المستخدمة تبعاً لحجم الخزعة.
تم تصميم البروتوكول هو موضح هنا لتوليد أنسجة استنساخه الكسور؛ ومع ذلك، بعض التغيرات الجوهرية ضمن العينة، بما في ذلك الحجم وحالة الأنسجة يمكن أن يؤدي إلى انحرافات في كمية البروتين والتوزيع التي تدار في كل جزء.

البروتينات المشاركة في ما يقرب من جميع الوظائف البيولوجية داخل خلية وأي اختلاف في هيكل أو الكمية أو مكان يمكن أن يؤدي إلى سيناريو المسببة للأمراض. أساليب وجود عينة الأنسجة نهجاً مفيداً الحد من تعقيد المرض ذات الصلة بتحليل البروتين. بعض الدراسات استخدام البروتين التعريب المعلومات أو إثراء بروتين من حجرة الهاتف خلوي محددة، ذلك بروتوكول لتجزئة استنساخه من البروتينات سليمة مفيدة للرد على بعض الأسئلة البيولوجية. تحديد الترجمة سوبسيلولار للبروتينات والرصد على إعادة توزيع مقسم أو التفاعلات في القاعدية وظروف المرض سيساعد على تحديد الأمراض المتعلقة بالاختلافات الوظيفية1،2. وبالتالي، يهدف هذا الأسلوب إلى تكاثر يجزئ خزعات الأنسجة المعوية، الطازجة والمجمدة، في مقصورات سوبسيلولار هيولى والنووية على حد سواء.
عينات خزعة الأمعاء بشكل روتيني يتم الحصول عليها من خلال إجراءات التنظير3 (الشكل 1)، ويمكن استخدامه بفعالية لتحديد مقدار البروتين أو الدراسات إيمونوبريسيبيتيشن. سوف تحتوي على عينات الأنسجة من الأمعاء الظهارية البروتينات التي قد تكون ضالعة مباشرة في إمراضية المرض4، عينات خزعة الأمعاء مصدرا قيماً للغاية لتحديد هوية الناجحة الخاصة بالأمراض المعوية البروتينات. عينات الأنسجة المجمدة، والمريض المخزنة جنبا إلى جنب مع المعلومات السريرية موارد مفيدة لتحليل البروتين، وإعداد نموذج بسيط واستنساخه مسألة أساسية لتوفير معلومات الخلية يغلب استخدام المبالغ المقيدة لتجميد 5من الأنسجة.
هناك عدة مجموعات المتاحة تجارياً للفصل بين كسور الخلوية، ولكن هذه أكثر تكلفة وعموما أكثر استهلاكاً للوقت من البروتوكول المعروضة هنا. استناداً إلى بروتوكولات متعددة الخطوات المتدرجة الطرد المركزي وكما استخدمت التدرجات المستمر سابقا لتجزئة المقصورات الخلوية المتنوعة في أنسجة مختلفة6،7. ومع ذلك، الحفاظ على الاتساق بين التدرجات المستمر غالباً ما مهمة صعبة. بروتوكولات مماثلة تستند إلى تحلل متسلسل للأغشية وقد وصفت سابقا ولكن يحتاجون عادة اثنين أو أكثر من المخازن المؤقتة والأيدي في الوقت المحدد هو أطول8 .
عند تجزئة عينات الأنسجة، إلا يغيب عن البال أن النسيج عينات التفاعلات خلية خلية وخلية المصفوفة الحالية التي غير موجودة في الخلايا المستزرعة وهامة عند الشروع في استخراج البروتين. انهيار السليم بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية دون التأثير على نوعية البروتين سيكون عاملاً حاسما في عزل بروتين الأنسجة المعوية9. في هذا البروتوكول، جهات الاتصال خلية خلية وخلية المصفوفة أولاً مكسورة، الإفراج عن الخلايا ويسمح المخزن المؤقت للوصول إلى الخلايا الفردية. لتجنب البروتين-حجرة خلط قبل تجزئة، يجب أن يحدث انهيار الاتصالات دون تغيير سلامة الخلايا أو الأغشية النووية.
سبب إثراء البروتياز المختلفة في مخاطية الأمعاء10، من المهم مراقبة تدهور البروتين أثناء الاستخراج. للحد من تدهور البروتين المحتملة، يجب تضمين مثبط البروتياز متعددة في مخازن استخراج البروتين. بالإضافة إلى ذلك، إذا مقتطفات ذاهبون لاستخدامها لفحوصات الوظيفية، من الضروري لتجنب تمسخ البروتينات أو بروتيوليسيس لأن هذا سوف يسبب خسارة في نشاط البروتين11. ولهذا الغرض، يتم تنفيذ البروتوكول في 4 درجات مئوية وفلوريد فينيلميثيلسولفونيل الطازج (بمسف) يتم إضافة إلى المخازن المؤقتة بتركيز 0.1 مم فقط قبل استخدامها لتمنع كذلك proteolysis نهائية.
هو الخطوة الأولى في وجود خلية اختلال الأنسجة وتحلل الخلية. وكما ذكر سابقا، يتمثل الهدف في تصنيف الخلايا وكسر لهم فتح مع الحد الأدنى من الضرر. يجب أن يكون تجانس عينات الأنسجة المعوية، وتفكيك الخلايا لتحقيق الحد الأقصى من الكسر من غشاء الخلية. في هذا البروتوكول، نستخدم خلاط مدقة يجهز لكسر الأنسجة المعوية الذي هو تجانس في غضون ثوان عن طريق عمل فورتيكسينج عالية السرعة. بعد التجانس، هي المحتضنة خلايا الأنسجة في المخزن مؤقت ناقص التوتر الذي سوف تنفجر غشاء الخلية ولكن سوف تبقى النواة سليمة، تليها إضافة منظفات غير يشوه (نونيل فينوكسيبوليثوكسيليثانول) ودوامه قصيرة لفصل النوى من الكسر هيولى. بعد إزالة السيتوبلازم، غشاء نواة الخلية هو اقتحام حاجز مكثف مع الهز.
طريقة المقدمة هنا هي طريقة مناسبة لتجزئة سوبسيلولار من الخزعات المعوية الطازجة والمجمدة التي تم الحصول عليها خلال المنظار وتتراوح بين 2 و 10 ميكروغرام في الوزن. البروتوكول سهل واستنساخه، ويمكن أن يؤديها باستخدام المعدات المختبرية الأساسية والمواد الكاشفة في أقل من ساعة.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase and phosphatase inhibitors</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Protein quantification kit</td></tr><tr><td>Disposable plastic pestles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogeneizer</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 basic</td><td></td></tr></tbody></table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

والغرض من هذا البروتوكول يجزئ الأنسجة المعوية البشرية التي حصل عليها التنظير في المقصورات النووية وهيولي لتحليل التعريب من بروتينات محددة أو مجمعات البروتين في الأنسجة مختلف الدول (أي، صحية مقابل المرض). يعد هذا الأسلوب مفيداً لتجزئة كلا عينات الأنسجة المعوية الطازجة والمجمدة؛ ومن الوصول إليها بسهولة لجميع المختبرات ولا تستغرق وقتاً طويلاً.

ويبين الشكل 1 ثم توضع تلطيخ قسم خزعة الأمعاء مع الزوائد سليمة وهياكل سرداب.
وتظهر نتائج الممثل وجود النووي وهيولي استخدام هذا البروتوكول في الأرقام 2 و 3. في هذه التجربة هو مبين في الشكل 2، طازجة (Fh) ومجمدة (Fz) خزعة كانت في الوقت نفسه مجزأ بعد البروتوكول المعروضة هنا، ووصمة عار غربية أجرى باستخدام 20 ميكروغرام لكل عينة. تركيزات البروتين في كل جزء وخزعة مبينة في الجدول 2، وتركيزات البروتين ليست مختلفة جداً بين الطازجة والمجمدة الأنسجة. عائد البروتينات المستخرجة من خزعات 2 مغ حول 3-4 ميكروغرام/ميليلتر في الكسر هيولى وحوالي 1.5 ميكروغرام/ميليلتر في الكسر النووية. للتحقق من نقاء الكسور، واستخدمت HSP90 وتوبولين كوضع ضوابط هيولى و HDAC1 و H3 كضوابط نووية13. يمكن ملاحظة أن HSP90 وتوبولين الأولية الموجودة في السيتوبلازم و HDAC1 و H3 موجودة في النواة مع خلط ضئيلة جداً بين الكسور اثنين. لتقييم ما إذا كان البروتوكول يؤثر موت الخلية، ونحن أيضا مسح لوجود كاسباسي 3. من الشكل 2، يقدم كل العينات تلطيخ ضئيلة جداً ل caspase 3 تؤكد أن الإجراء لا يؤثر في مسار موت الخلية حتى بعد فلاش تجميد في الخزعات. قد تم أيضا تحليل إذا حوفظ على التعديلات البروتين بعد هذا الإجراء، حيث يمكن استخدام البروتينات لفحوصات الوظيفية المتلقين للمعلومات. واستخدمت PhosphoSTAT1 لتلطيخ خزعة المجمدة المستخدمة في تجزئة هذه جاءت من فرد مع شرط التهابات معوية؛ وهذا ليس صحيحاً لخزعة الطازجة. كما هو متوقع، phosphoSTAT1 الموجود في السيتوبلازم الخزعة المجمدة، تأكيد الحفاظ على التعديلات البروتين بعد تجزئة.
ويرد في الشكل 3إمكانية تكرار نتائج أسلوب استخدام الخزعات المجمدة. أنجز وصمة عار غربية بعد تجزئة المستقلة الثلاثة المجمدة الخزعات، والكسور نظيفة مع البروتين حجرة أدنى خلط (الشكل 3A): HSP90 الموجودة في جزء هيولى و HDCA1 في الكسر النووية. بالإضافة إلى ذلك، كما تم مسح البروتين XPO1 الموجودة في كلا الكسور النووية وهيولي14 . ويمكن ملاحظة أن مستويات XPO1 الكمية التي إيماجيج مستقرة في كل جزء (الشكل 3B)، مما يؤكد إمكانية تكرار نتائج النتائج باستخدام الخزعات مختلفة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57740/57740fig1.jpg"> الشكل 1 : صورة مجهرية الخفيفة قسم الظهارية المعوية، ملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين، من خزعة المكتسبة بالمنظار الداخلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57740/57740fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57740/57740fig2.jpg"> الشكل 2 : وصمة عار الغربية الممثل وجود سوبسيلولار أداؤها في خزعة (Fz) مجمدة وطازجة (Fh). واستخدمت HSP90 وتوبولين كعناصر تحكم هيولى و HDAC1 و H3 الضوابط النووية. كما تم تقييم وجود CASP3 و phosphoSTAT3. 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57740/57740fig3v2.jpg"> الشكل 3 : وجود نتائج المستقلة الثلاثة المجمدة الخزعات. (أ) وصمة عار الغربية الممثل وجود سوبسيلولار أجريت في ثلاث خزعات المجمدة (1 و 2 و 3). كعنصر تحكم هيولى و HDAC1 كعنصر تحكم نووية HSP90. كما تم تقييم تعريب XPO1. (ب) التحديد الكمي النسبي من XPO1 في كل من الكسر القيام به باستخدام البرمجيات إيماجيج. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57740/57740fig3v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>المخزن المؤقت</td>
			<td>المكونات</td>
			<td>وتلاحظ</td>
		</tr>
<tr>
<td>ناقص التوتر المخزن المؤقت 1</td>
			<td>10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.9</td>
			<td>المخزن المؤقت 1.5 مل/عينة</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>10 ملم بوكل</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>يدتا نم 0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>المخزن المؤقت مكثف 2</td>
			<td>20 مم حبيس الأس الهيدروجيني 7.9</td>
			<td>150 ميليلتر المخزن المؤقت/عينة</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>400 مم كلوريد الصوديوم</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>مم 0.1 يدتا</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* ملاحظة: يمكن تخزين المخازن المؤقتة في 4ºC لمدة شهر.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* * ملاحظة: المخازن المؤقتة يجب أن تستكمل بمثبطات البروتيناز والفوسفاتيز و DTT قبل الاستخدام</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: تكوين المخزن المؤقت.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>جديدة</td>
			<td>المجمدة</td>
		</tr>
<tr>
<td>السيتوبلازم</td>
			<td>2.975</td>
			<td>4.612</td>
		</tr>
<tr>
<td>نواة</td>
			<td>1.516</td>
			<td>1.385</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: البروتين تركيز كل من الكسور في خزعة الطازجة والمجمدة 2 مغ المستخدمة في الشكل 2؛ ويتضمن تركيز ميكروغرام/ميكروليتر.

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

نقدم هنا، بروتوكول القيام تجزئة خلوية بسيطة لفصل سوبسيلولار من البروتينات هيولى والنووية في الخزعات المعوية البشرية الطازجة والمجمدة.

تجزئة سوبسيلولار من العينات المعدية المعوية الطازجة والمجمدة

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

An Overview of the Gastrointestinal System: Anatomy, Physiology, and Assessment

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Views.  University of the Basque Country (UPV-EHU), Biocruces Health Research Institute. نقدم هنا، بروتوكول القيام تجزئة خلوية بسيطة لفصل سوبسيلولار من البروتينات هيولى والنووية في الخزعات المعوية البشرية الطازجة والمجمدة.

Video: Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

عزل CD 90+ الخلايا الليفية / Myofibroblasts من المجمدة الإنسان الجهاز الهضمي العينات


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Developmental Biology

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

وجود خلية من خلايا U937 في غياب الطرد المركزي عالية السرعة

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Biochemistry

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused on bulk approaches that led to the molecular classification of brain tumors. Over the last five years, single cell sequencing approaches have highlighted several important features of gliomas. The majority of these studies have utilized fresh brain tumor specimens to isolate single cells using flow cytometry or antibody-based separation methods. Moving forward, the use of fresh-frozen tissue samples from biobanks will provide greater flexibility to single cell applications. Furthermore, as the single-cell field advances, the next challenge will be to generate multi-omics data from either a single cell or the same sample preparation to better unravel tumor complexity. Therefore, simple and flexible protocols that allow data generation for various methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and single nucleus Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) will be important for the field.
Recent advances in the single cell field coupled with accessible microfluidic instruments such as the 10x genomics platform have facilitated single cell applications in research laboratories. To study brain tumor heterogeneity, we developed an enhanced protocol for the isolation of single nuclei from fresh frozen gliomas. This protocol merges existing single cell protocols and combines a homogenization step followed by filtration and buffer mediated gradient centrifugation. The resulting samples are pure single nuclei suspensions that can be used to generate single nucleus gene expression and chromatin accessibility data from the same nuclei preparation.

Intra-tumoral heterogeneity is an inherent feature of tumors, including gliomas. We developed a simple and efficient protocol that utilizes a combination of buffers and gradient centrifugation to isolate single nuclei from fresh frozen glioma tissues for single nucleus RNA and ATAC sequencing studies.

عزل النواة من أورام الدماغ المجمدة الطازجة لنواة واحدة RNA-seq و ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

Cancer Research

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and isopycnic density gradient centrifugation. The major advantage of this procedure is that it does not rely on the sole use of solubilizing detergents to obtain subcellular fractions. This makes it possible to separate the plasma membrane from other membrane-bound organelles of the cell. This procedure will facilitate the determination of protein localization in cells with a reproducible, scalable, and selective method. This method has been successfully used to isolate cytosolic, nuclear, mitochondrial, and plasma membrane proteins from the human monocyte cell line, U937. Although optimized for this cell line, this procedure may serve as a suitable starting point for the subcellular fractionation of other cell lines. Potential pitfalls of the procedure and how to avoid them are discussed as are alterations that may need to be considered for other cell lines.

This fractionation protocol will allow researchers to isolate cytoplasmic, nuclear, mitochondrial, and membrane proteins from mammalian cells. The latter two subcellular fractions are further purified via isopycnic density gradient.

تجزئة الخلايا لخلايا U937 عن طريق تنقية التدرج بكثافة isopycnic

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

عزل النوى لتسلسل multiome في عينة الورم الصلب

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) data, represents a breakthrough in our ability to discern tumor cell heterogeneity-a primary focus of translational cancer research at this time. However, the quality of sequencing data acquired using this advanced modality is highly dependent on the quality of the input material. 
Digestion conditions need to be optimized to maximize cell yield without sacrificing quality. This is particularly challenging in the context of solid tumors with dense desmoplastic matrices that must be gently broken down for cell release. Freshly isolated cells from solid tumor tissue are more fragile than those isolated from cell lines. Additionally, as the cell types isolated are heterogeneous, conditions should be selected to support the total cell population. 
Finally, nuclear isolation conditions must be optimized based on these qualities in terms of lysis times and reagent types/ratios. In this article, we describe our experience with nuclear isolation for the 10x Genomics multiome sequencing platform from solid tumor specimens. We provide recommendations for tissue digestion, storage of single-cell suspensions (if desired), and nuclear isolation and assessment.

تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز عزل النوى لتسلسل الميكروومات المتعددة في البيئات الدقيقة للورم الصعبة

The protocol provides a reliable and optimized approach to the isolation of nuclei from solid tumor specimens for multiome sequencing using the 10x Genomics platform, including recommendations for tissue dissociation conditions, cryopreservation of single-cell suspensions, and assessment of isolated nuclei.

عزل النوى الأمثل من عينات الورم الصلبة الطازجة والمجمدة لتسلسل متعدد النوى

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

في تقطير التحت خلوية الموقع من خلايا الثدييات وغير ملتصقة منتسب -

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Biology

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Neuroscience

<meta charset="utf8"></head><body>نموذج الفئران لدراسة العلوص بعد الجراحة من خلال التلاعب المعوي

Postoperative Ileus Murine Model

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI is a consequence of mechanical damage during surgery, resulting in disruption of motility in the gastrointestinal tract. The mechanisms of POI are related to aberrant neuronal sensitivity, impaired epithelial barrier function, and increased local inflammation. However, the details remain enigmatic. Therefore, experimental murine models are crucial for elucidating the pathophysiology and mechanism of POI injury and for the development of novel therapies.
Here, we introduce a murine model of POI generated via intestinal manipulation (IM) that is similar to clinical surgery; this is achieved by mechanical damage to the small intestine by massaging the abdomen 1-3 times with a cotton swab. IM delayed gastrointestinal transit 24 h after surgery, as assessed by FITC-dextran gavage and fluorescence detection of the segmental digestive tract. Moreover, tissue swelling of the submucosa and immune cell infiltration were investigated by hematoxylin and eosin staining and flow cytometry. Proper pressure of the IM and a hyperemic effect on the intestine are critical for the procedure. This murine model of POI can be utilized to study the mechanisms of intestinal damage and recovery after abdominal surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>نموذج العنقوص بعد الجراحة

We describe a murine model of postoperative ileus generated via intestinal manipulation. Gastrointestinal transit function, pathologic changes, and immune cell activation were assessed 24 h after surgery.

نموذج العنقوص بعد الجراحة

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI ...

تجزئة سوبسيلولار من العينات المعدية المعوية الطازجة والمجمدة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

عزل CD 90+ الخلايا الليفية / Myofibroblasts من المجمدة الإنسان الجهاز الهضمي العينات

وجود خلية من خلايا U937 في غياب الطرد المركزي عالية السرعة

عزل النواة من أورام الدماغ المجمدة الطازجة لنواة واحدة RNA-seq و ATAC-seq

تجزئة الخلايا لخلايا U937 عن طريق تنقية التدرج بكثافة isopycnic

عزل النوى الأمثل من عينات الورم الصلبة الطازجة والمجمدة لتسلسل متعدد النوى

عزل النوى الأمثل من عينات الورم الصلبة الطازجة والمجمدة لتسلسل متعدد النوى

عزل النوى الأمثل من عينات الورم الصلبة الطازجة والمجمدة لتسلسل متعدد النوى

في تقطير التحت خلوية الموقع من خلايا الثدييات وغير ملتصقة منتسب -

الأمثل لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن لعزل Ganglia المعوي من الأنسجة البشرية الطازجة المجمدة

نموذج العنقوص بعد الجراحة