Name: subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Os autores reconhecem a assistência de Ander Lopez e Miren Telletxea para gravação e edição de vídeo. ACR é financiado por uma bolsa de Ikerbasque e um projeto de pesquisa do Asociación de Celiacos de Madrid (ACM). Orc é financiado pelo projeto ISCIII-PI16/00258 e co-financiado pela União Europeia FEDER/FSE "Uma maneira de tornar a Europa". É é financiado por uma concessão do projeto de pesquisa 2015111068 do departamento de saúde Basco. IRG e AJM são suportados pelo companheirismo predoctoral subvenções provenientes da UPV/EHU e o departamento de educação de Basco, respectivamente.

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de ética Cruces University Hospital e as análises foram realizadas após consentimento informado foi obtido de todas as disciplinas ou seus pais.
1. biópsia coleção
Nota: Amostras de biópsia do duodeno distal de pacientes são obtidas durante endoscopia de rotina de diagnóstico, gerenciamento de biópsias que variam entre 2 e 10 mg de peso. Uma biópsia tecido é um tecido complexo composto por diferentes tipos de células incluindo células epiteliais, imunes e endoteliais. Gastroenterologistas clínicas realizar a endoscopia elaboradas diretrizes clínicas.
<ol><li>Coloque a biópsia em um papel de filtro estéril só depois da endoscopia.</li>
	<li>Use fórceps para transferir as biópsias em tubos de 1,5 mL, embeba-os com PBS e colocá-lo em um criotubo.</li>
	<li>Manter os tubos em gelo até a chegada no laboratório.<ol>
<li>Inicie o processamento de biópsias frescas imediatamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para biópsias congeladas, flash congelar a biópsia contendo tubos e armazenar em nitrogênio líquido até o uso. Nota: É importante manter a amostra congelada até que o buffer complementado frio 1 é adicionado.</li>
</ol>2. tampão preparação
Nota: Antes de começar, complementar os buffers como segue.
<ol><li>Adicionar 1 mM DTT (concentração final) e protease e fosfatase inibidor cocktail (1 x concentração final) para o buffer hipotônica hipertônico e 1 tampão 2 (tabela 1).<ol>
<li>Prepare-se 1,5 mL de tampão 1 e 150 µ l de tampão de 2 por amostra. DTT impede a oxidação das amostras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare núcleos de tampão de lavagem, acrescentando 1% de detergente (nonilo phenoxypolyethoxylethanol) a uma concentração final de 0,1% para a reserva já completada 1. Prepare-se 1 mL de tampão de lavagem núcleos por amostra.</li>
</ol>3. biópsia homogeneização
<ol><li>
Biópsias de frescas
	<ol>
<li>Coloque o pilão descartável no misturador motorizado. Certifique-se de que o pilão atinge o fundo do tubo.</li>
		<li>Tirar a biópsia do criotubo e colocá-lo em um tubo de 1,5 mL com uma ponta da pipeta.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de tampão completado 1 para o tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Homogeneizar a biópsia com o pilão, até que o tecido é completamente interrompido e mantê-lo no gelo.</li>
		<li>Uma vez que todas as biópsias são homogeneizadas proceda com o passo 4. Nota: Macacos descartáveis devem ser alterados entre biópsias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biópsias congeladas Atenção: Cuidado com nitrogênio líquido; contato de nitrogênio líquido com a pele ou olhos pode causar lesões graves de congelação. Protege as mãos e os olhos sempre quando se trabalha com nitrogênio líquido.<ol>
<li>Leve o nitrogênio líquido em uma caixa para armazenar o cryotubes obtido o tanque de nitrogênio.</li>
		<li>Encontrar a biópsia no tanque de nitrogênio e coloque o criotubo na caixa com o nitrogênio líquido. Repita este passo para todas as biópsias.</li>
		<li>Transfira a biópsia do criotubo para um tubo de 1,5 mL. Nota: Biópsias serão anexadas ao tubo congelado. Empurre a biópsia com uma ponta de pipeta estéril para que ele irá desanexar do tubo.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de tampão completado 1.</li>
		<li>Homogeneizar o tecido usando o pilão e almofariz, até que o tecido é completamente interrompido, manter a temperatura a 4 ° C ao longo de todo o procedimento. Nota: Não deixe biópsias descongelar antes de adicionar o buffer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. o citoplasma isolamento
<ol><li>Incube a biópsia homogeneizada no gelo por 10 min.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de 1% de detergente (nonilo phenoxypolyethoxylethanol) para cada amostra a uma concentração final de 0,05%. Nota: Células vão inchar e explodir por lise osmótica como o detergente vai interromper a membrana celular.</li>
	<li>Incube no gelo por 5 minutos.</li>
	<li>Vórtice brevemente e centrifugar 400 x g a 4 ˚ c por 2 min.</li>
	<li>Após a utilização do vortex, remover o sobrenadante e transferir para um novo tubo limpo 1,5 mL; Esta será a fração citoplasmática. Não jogue fora a pelota.</li>
</ol>5. nuclear isolamento
<ol><li>Resuspenda o pellet da etapa anterior com 200 µ l de tampão de lavagem de núcleos.</li>
	<li>Centrifugar o tubo por 2 min em 400 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e repita o procedimento de lavagem mais duas vezes. Nota: As lavagens irão remover a contaminação citoplasmática na fração nuclear.</li>
	<li>Após a terceira lavagem, resuspenda o pellet em 100 µ l de tampão de 2.</li>
	<li>Agitar vigorosamente a amostra no 4 ˚ c por 30 min. como alternativa, incubar a amostra em gelo e vórtice cada 5 min.</li>
	<li>Após agitação, centrifugar a amostra durante 10 minutos na velocidade máxima (> 12.000 x g) e 4 ° C.</li>
	<li>Após a utilização do vortex, transferi o sobrenadante para um novo 1.5 limpo. tubo mL. Esta será a fração nuclear.</li>
</ol>6. quantificação da proteína
Nota: Quantificar as proteínas com um kit de ensaio de proteína do ácido (BCA) do bicinchoninic. A concentração de proteínas em frações irá variar entre 0,5 e 5 µ g / µ l, sendo menor na fração nuclear (ver tabela 2 para as concentrações de proteína resultantes de biópsias de 2mg).
<ol><li>Preparar uma curva padrão com o seguinte de montantes (µ g) de albumina de soro bovino (BSA)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>Prepare os reagentes necessários para a utilização de 100 µ l de mistura final do BCA por amostra.</li>
	<li>Pipetar 2 µ l de cada fração de proteína em uma placa de 96 bem, adicione a mistura do BCA e siga as instruções do fabricante para a leitura.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).</li><li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases:+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies.">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li><li>Ericsson, C., Franz&#233;n, B., Nist&#233;r, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling,+cryopreservation,+extraction,+and+use+for+proteomic+analysis.">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo descrito aqui é usado para o fraccionamento nuclear e citoplasmático de biópsias intestinais. As proteínas purificadas não são desnaturadas e pode ser usadas não apenas na análise ocidental do borrão como mostrado na Figura 2 e 3 , mas também em ensaios que exigem nativo-dobrado proteínas tais como imunoprecipitação, ensaio de turno de mobilidade electrophoretic (EMSA) ou eletroforese em gel de poliacrilamida nativo (página).
<p class="jove_cont...

As proteínas participam de quase todas as funções biológicas, dentro de uma célula e qualquer variação em sua estrutura, quantidade ou localização pode levar a um cenário de patogenicidade. Métodos de fracionamento de amostras de tecido são uma abordagem útil para reduzir a complexidade da doença relacionadas com análises de proteína. Alguns estudos usam informações de localização de proteínas ou enriquecem uma proteína de um compartimento celular específico, por um protocolo para reprodutível fraccionamento das proteínas intactas, é útil para responder a certas perguntas biológicas. Determinar a Localização subcellular das proteínas e monitorando sua redistribuição compartimental ou interações no basal e condições de doença ajudará a identificar a doença relacionadas com diferenças funcionais1,2. Assim, este método visa reproducibly fractionate biópsias do tecido intestinal, frescas e congeladas, em compartimentos subcellular citoplasmáticos e nucleares.
Amostras de biópsia intestinal são rotineiramente obtidas durante os procedimentos de endoscopia3 (Figura 1) e podem ser efetivamente usadas para quantificação de proteína ou estudos de imunoprecipitação. Desde que as amostras de tecido da intestinal epiteliais conterá proteínas que podem estar diretamente envolvidas na patogênese doença4, amostras de biópsia intestinal são uma fonte muito valiosa para a identificação de sucesso de específica da doença intestinal proteínas. Amostras de tecido congelado, paciente armazenado juntamente com as informações clínicas são recursos úteis para análise de proteínas, e uma preparação de amostras simples e reprodutível é uma questão-chave para fornecer informações compartimental célula usando quantidades limitantes de congelados tecido de5.
Existem vários kits disponíveis comercialmente para a separação de frações celulares, mas estes são mais caros e geralmente mais demorado do que o protocolo aqui apresentado. Protocolos com base em várias etapas centrifugação gradiente e gradientes contínuas também têm sido usados anteriormente para o fraccionamento de diversos compartimentos celulares em diferentes tecidos6,7. No entanto, manter a consistência dos gradientes contínuos é muitas vezes uma tarefa difícil. Protocolos semelhantes baseados o lysis sequencial das membranas têm sido descritos anteriormente mas geralmente precisam de mais de dois buffers e nas mãos na hora é mais8 .
Quando as amostras de tecido de fraccionamento, tenha em mente que o tecido amostras presentes célula-célula e célula-matriz interações que são não presentes em culturas de células e importante quando proceder à extração de proteínas. A repartição adequada entre células e matriz extracelular, sem afetar a qualidade da proteína será um fator crítico do tecido intestinal da proteína isolamento9. Neste protocolo, célula-célula e célula-matriz de contatos primeiro são quebrados, liberando as células e permitindo que o buffer alcançar as células individuais. Para evitar a proteína-compartimento de mistura antes de fracionamento, a repartição dos contatos deve ocorrer sem alterar a integridade das células ou as membranas nucleares.
Devido o enriquecimento de várias proteases na mucosa intestinal10, é importante controlar a degradação proteica durante a extração. Para minimizar a potencial degradação proteica, inibidor de protease múltipla deve ser incluído nos buffers de extração de proteínas. Além disso, se extratos vão ser utilizados para os ensaios funcionais, é essencial para evitar a desnaturação das proteínas ou proteólise, pois isto causará uma perda de proteína atividade11. Para este efeito, o protocolo é realizado a 4 ° C e fluoreto de phenylmethylsulfonyl fresco (PMSF) é adicionado aos buffers em uma concentração final de 0,1 mM apenas antes da utilização para inibir ainda mais a proteólise.
O primeiro passo no fracionamento celular é rompimento de tecido e lise celular. Como mencionado anteriormente, o objetivo é desagregar as células e quebra-los abrir com o mínimo de dano. Amostras de tecido intestinal devem ser homogeneizadas, e as células lysed para alcançar a máxima quebra da membrana celular. Neste protocolo, utilizamos um misturador motorizado pilão para quebrar o tecido intestinal que é homogeneizado em poucos segundos por meio de ação de alta velocidade num Vortex. Após a homogeneização, células do tecido são incubadas em um buffer hipotônica que vai estourar a membrana da célula, mas irá manter os núcleos intactos, seguido pela adição de um detergente não-desnaturação (nonilo phenoxypolyethoxylethanol) e um vórtice curto para separar os núcleos da fração citoplasmática. Após a remoção do citoplasma, a membrana do núcleo celular é de ruptura em um buffer hipertônico com agitação.
O método apresentado aqui é um método adequado para o fraccionamento subcelular de frescos e congelados de biópsias intestinais que foram obtidos durante os procedimentos endoscópicos e intervalo entre 2 e 10 mg de peso. O protocolo é fácil e pode ser reproduzido e pode ser realizado utilizando equipamentos básicos de laboratório e reagentes em menos de uma hora.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase and phosphatase inhibitors</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Protein quantification kit</td></tr><tr><td>Disposable plastic pestles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogeneizer</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 basic</td><td></td></tr></tbody></table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

O propósito do presente protocolo é para fracionar o tecido intestinal humano obtido por endoscopia em compartimentos nucleares e citoplasmáticos para a análise de localização de proteínas específicas ou complexos de proteínas em Estados diferentes de tecido (ou seja, saudável versus doença). Este método é útil para o fraccionamento de ambas as amostras de tecido intestinal frescos e congelados; é facilmente acessível para todos os laboratórios e não demorado.

A Figura 1 mostra uma coloração de eosina hematoxilina de uma seção de biópsia intestinal com vilosidades intactas e estruturas de cripta.
Resultados representativos de fracionamento nuclear e citoplasmático, usando este protocolo são mostrados nas figuras 2 e 3. No experimento mostrado na Figura 2, um fresco (Fh) e um congelado ...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Aqui, apresentamos um protocolo para executar um fracionamento celular simples para a separação subcelular de proteínas citoplasmáticas e nucleares em humanas frescas e congeladas de biópsias intestinais.

Fraccionamento subcelular de espécimes Gastrointestinal frescos e congelados

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

An Overview of the Gastrointestinal System: Anatomy, Physiology, and Assessment

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K visualizações.  University of the Basque Country (UPV-EHU), Biocruces Health Research Institute. Aqui, apresentamos um protocolo para executar um fracionamento celular simples para a separação subcelular de proteínas citoplasmáticas e nucleares em humanas frescas e congeladas de biópsias intestinais.

Vídeo: Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Biologia do Desenvolvimento

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Bioquímica

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused on bulk approaches that led to the molecular classification of brain tumors. Over the last five years, single cell sequencing approaches have highlighted several important features of gliomas. The majority of these studies have utilized fresh brain tumor specimens to isolate single cells using flow cytometry or antibody-based separation methods. Moving forward, the use of fresh-frozen tissue samples from biobanks will provide greater flexibility to single cell applications. Furthermore, as the single-cell field advances, the next challenge will be to generate multi-omics data from either a single cell or the same sample preparation to better unravel tumor complexity. Therefore, simple and flexible protocols that allow data generation for various methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and single nucleus Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) will be important for the field.
Recent advances in the single cell field coupled with accessible microfluidic instruments such as the 10x genomics platform have facilitated single cell applications in research laboratories. To study brain tumor heterogeneity, we developed an enhanced protocol for the isolation of single nuclei from fresh frozen gliomas. This protocol merges existing single cell protocols and combines a homogenization step followed by filtration and buffer mediated gradient centrifugation. The resulting samples are pure single nuclei suspensions that can be used to generate single nucleus gene expression and chromatin accessibility data from the same nuclei preparation.

Intra-tumoral heterogeneity is an inherent feature of tumors, including gliomas. We developed a simple and efficient protocol that utilizes a combination of buffers and gradient centrifugation to isolate single nuclei from fresh frozen glioma tissues for single nucleus RNA and ATAC sequencing studies.

Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

Pesquisa do câncer

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and isopycnic density gradient centrifugation. The major advantage of this procedure is that it does not rely on the sole use of solubilizing detergents to obtain subcellular fractions. This makes it possible to separate the plasma membrane from other membrane-bound organelles of the cell. This procedure will facilitate the determination of protein localization in cells with a reproducible, scalable, and selective method. This method has been successfully used to isolate cytosolic, nuclear, mitochondrial, and plasma membrane proteins from the human monocyte cell line, U937. Although optimized for this cell line, this procedure may serve as a suitable starting point for the subcellular fractionation of other cell lines. Potential pitfalls of the procedure and how to avoid them are discussed as are alterations that may need to be considered for other cell lines.

This fractionation protocol will allow researchers to isolate cytoplasmic, nuclear, mitochondrial, and membrane proteins from mammalian cells. The latter two subcellular fractions are further purified via isopycnic density gradient.

Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Isolamento de Núcleos para Sequenciamento de Multioma em Espécime de Tumor Sólido

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) data, represents a breakthrough in our ability to discern tumor cell heterogeneity-a primary focus of translational cancer research at this time. However, the quality of sequencing data acquired using this advanced modality is highly dependent on the quality of the input material. 
Digestion conditions need to be optimized to maximize cell yield without sacrificing quality. This is particularly challenging in the context of solid tumors with dense desmoplastic matrices that must be gently broken down for cell release. Freshly isolated cells from solid tumor tissue are more fragile than those isolated from cell lines. Additionally, as the cell types isolated are heterogeneous, conditions should be selected to support the total cell population. 
Finally, nuclear isolation conditions must be optimized based on these qualities in terms of lysis times and reagent types/ratios. In this article, we describe our experience with nuclear isolation for the 10x Genomics multiome sequencing platform from solid tumor specimens. We provide recommendations for tissue digestion, storage of single-cell suspensions (if desired), and nuclear isolation and assessment.

Autor em destaque: Aprimorando o isolamento de núcleos para sequenciamento de múltiplos omas em microambientes tumorais desafiadores

The protocol provides a reliable and optimized approach to the isolation of nuclei from solid tumor specimens for multiome sequencing using the 10x Genomics platform, including recommendations for tissue dissociation conditions, cryopreservation of single-cell suspensions, and assessment of isolated nuclei.

Isolamento Otimizado de Núcleos de Espécimes Sólidos Documentais e Congelados para Sequenciamento Multioma

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Biologia

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Neurociência

<meta charset="utf8"></head><body>Modelo Murino para Estudo do Íleo Secundário Pós-Operatório por Manipulação Intestinal

Postoperative Ileus Murine Model

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI is a consequence of mechanical damage during surgery, resulting in disruption of motility in the gastrointestinal tract. The mechanisms of POI are related to aberrant neuronal sensitivity, impaired epithelial barrier function, and increased local inflammation. However, the details remain enigmatic. Therefore, experimental murine models are crucial for elucidating the pathophysiology and mechanism of POI injury and for the development of novel therapies.
Here, we introduce a murine model of POI generated via intestinal manipulation (IM) that is similar to clinical surgery; this is achieved by mechanical damage to the small intestine by massaging the abdomen 1-3 times with a cotton swab. IM delayed gastrointestinal transit 24 h after surgery, as assessed by FITC-dextran gavage and fluorescence detection of the segmental digestive tract. Moreover, tissue swelling of the submucosa and immune cell infiltration were investigated by hematoxylin and eosin staining and flow cytometry. Proper pressure of the IM and a hyperemic effect on the intestine are critical for the procedure. This murine model of POI can be utilized to study the mechanisms of intestinal damage and recovery after abdominal surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Modelo Murino de Íleo Pós-Operatório

We describe a murine model of postoperative ileus generated via intestinal manipulation. Gastrointestinal transit function, pathologic changes, and immune cell activation were assessed 24 h after surgery.

Modelo Murino de Íleo Pós-Operatório

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI ...

Fraccionamento subcelular de espécimes Gastrointestinal frescos e congelados

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica

Isolamento Otimizado de Núcleos de Espécimes Sólidos Documentais e Congelados para Sequenciamento Multioma

Isolamento Otimizado de Núcleos de Espécimes Sólidos Documentais e Congelados para Sequenciamento Multioma

Isolamento Otimizado de Núcleos de Espécimes Sólidos Documentais e Congelados para Sequenciamento Multioma

Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos

Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

Modelo Murino de Íleo Pós-Operatório