المؤلف تقر مساعدة لوبيز أندير وميرين تيليتكسيا لتسجيل الفيديو وتحريرها. وتمول ACR زمالة إيكيرباسك ومشروع بحثي من رابطة سيلياكوس دي مدريد (ACM). جرب الممولة من مشروع إيسسيي-PI16/00258 والممول من "الاتحاد الأوروبي" سيطلب/كلية العلوم التربوية "طريقة لجعل أوروبا". من هو ممول بمنحه مشروع بحوث 2015111068 من "وزارة الصحة إقليم الباسك". سيبحث و AJM معتمدة بمنح زمالة بريدوكتورال من UPV/اهو وإدارة التعليم في إقليم الباسك، على التوالي.

وأقر "مجلس أخلاقيات مستشفى جامعة كروسيس" هذه الدراسة وأجريت التحاليل بعد أن تم الحصول على الموافقة المستنيرة من جميع المواضيع أو أولياء أمورهم.
1-خزعة جمع
ملاحظة: خزعة عينات من العفج القاصي من المرضى يتم الحصول عليها أثناء التنظير التشخيص الروتينية إدارة الخزعات التي تتراوح بين 2 و 10 ميكروغرام في الوزن. فحص الأنسجة نسيج معقد يتألف من أنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك الخلايا الظهارية، ومحصنة وبطانية. أخصائي أمراض الباطنة السريرية إجراء التنظير يلي المبادئ التوجيهية السريرية.
<ol><li>ضع الخزعة في ورقة تصفية عقيمة فقط بعد التنظير.</li>
	<li>استخدام الملقط لنقل الخزعات في أنابيب 1.5 مل ونقع عليها مع برنامج تلفزيوني، ووضعه في كريوتوبي.</li>
	<li>تبقى أنابيب على الجليد حتى وصولها المختبر.<ol>
<li>بدء تجهيز خزعات جديدة فورا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الخزعات المجمدة، فلاش تجميد خزعة تحتوي على أنابيب وتخزينها في النتروجين السائل حتى الاستخدام. ملاحظة: من المهم أن تبقى العينة المجمدة حتى تتم إضافة المخزن المؤقت تستكمل الباردة 1.</li>
</ol>2. إعداد المخزن المؤقت
ملاحظة: قبل البدء، الملحق المخازن المؤقتة على النحو التالي.
<ol><li>أضف 1 مم DTT (تركيز النهائية) ومبطلات والفوسفاتيز المانع كوكتيل (1 × التركيز النهائي) إلى المخزن المؤقت ناقص التوتر 1 ومكثف المخزن المؤقت 2 (الجدول 1).<ol>
<li>إعداد 1.5 مل من المخزن المؤقت 1 و 150 ميليلتر من المخزن المؤقت 2 كل عينة. سيتم منع DTT أكسدة العينات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد الأنوية يغسل المخزن المؤقت عن طريق إضافة المنظفات 1% (نونيل فينوكسيبوليثوكسيليثانول) بتركيز 0.1% إلى المخزن المؤقت تستكمل الفعل 1 نهائي. إعداد 1 مل من المخزن المؤقت ليغسل النوى كل عينة.</li>
</ol>3-خزعة التجانس
<ol><li>
خزعات جديدة
	<ol>
<li>ضع مدقة المتاح في خلاط يجهز. ضمان وصول المدقة إلى الجزء السفلي من الأنبوب.</li>
		<li>إخراج الخزعة من كريوتوبي ووضعه في أنبوب 1.5 مل مع تلميح ماصة.</li>
		<li>إضافة 200 ميليلتر لتستكمل المخزن المؤقت 1 إلى أنبوب 1.5 مل.</li>
		<li>مجانسة الخزعة مع المدقة حتى الأنسجة معطلة تماما وإبقائه على الجليد.</li>
		<li>حالما يتم تجانس جميع خزعات المضي قدما في الخطوة 4. ملاحظة: يجب تغيير المدقات المتاح بين الخزعات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
الخزعات المجمدة تنبيه: تعامل مع النتروجين السائل بعناية؛ اتصال النتروجين السائل مع الجلد أو العينين قد تسبب إصابة تجميد خطيرة. حماية اليدين والعينين دائماً عند العمل مع النتروجين السائل.<ol>
<li>تأخذ بعض النتروجين السائل في مربع لتخزين كريوتوبيس استردادها من خزان النتروجين.</li>
		<li>البحث عن الخزعة في خزان النتروجين ووضع في كريوتوبي في المربع مع النتروجين السائل. كرر هذه الخطوة لكل خزعات.</li>
		<li>نقل الخزعة من كريوتوبي إلى أنبوب 1.5 مل. ملاحظة: سوف يتم إرفاق خزعات لأنبوب المجمدة. دفع الخزعة مع تلميح ماصة معقمة حيث أنه سيتم فصل من الأنبوب.</li>
		<li>إضافة 200 ميليلتر لتستكمل المخزن المؤقت 1.</li>
		<li>مجانسة الأنسجة باستخدام مدقة وهاون حتى الأنسجة معطلة تماما، والحفاظ على درجة حرارة 4 درجة مئوية طوال جميع الإجراء. ملاحظة: لا تدع خزعات ذوبان الجليد قبل إضافة المخزن المؤقت.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-السيتوبلازم العزلة
<ol><li>احتضان خزعة المتجانس على الجليد لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>إضافة 10 ميليلتر من المنظفات 1% (نونيل فينوكسيبوليثوكسيليثانول) لكل عينة إلى نهائي تركز 0.05%. ملاحظة: سوف تضخم الخلايا وانفجر قبل تحلل ناضح كما سيتم تعطيل خفيف المنظفات غشاء الخلية.</li>
	<li>تبني على الجليد لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>الدوامة بإيجاز وأجهزة الطرد المركزي في ز 400 x في 4 ˚C ل 2 دقيقة.</li>
	<li>وبعد فورتيكسينج، إزالة المادة طافية ونقلها إلى أنبوب مل 1.5 نظيفة جديدة؛ وسوف يكون هذا الكسر هيولى. عدم تجاهل بيليه.</li>
</ol>5-المجال النووي العزلة
<ol><li>ريسوسبيند بيليه من الخطوة السابقة مع 200 ميليلتر نوى غسل المخزن المؤقت.</li>
	<li>الطرد المركزي في أنبوب لمدة 2 دقيقة على 400 x ز و 4 درجات مئوية.</li>
	<li>تجاهل المادة طافية وكرر الإجراء الغسيل مرتين أخريين. ملاحظة: يغسل إلى إزالة التلوث هيولى في الكسر النووية.</li>
	<li>بعد الغسيل الثالث، ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت 2.</li>
	<li>هزة العينة بقوة في ˚C 4 عن 30 دقيقة بدلاً من ذلك، احتضان العينة على الجليد ودوامه كل 5 دقائق.</li>
	<li>بعد الهز، الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقائق في سرعة قصوى (> 12,000 س ز) و 4 درجة مئوية.</li>
	<li>وبعد فورتيكسينج، بتحويل المادة طافية إلى 1.5 نظيفة جديدة. أنبوب مل. وسيكون هذا الكسر النووية.</li>
</ol>6-البروتين الكمي
ملاحظة: تحديد كمية البروتينات مع عدة مقايسة بروتين (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك. تركيز البروتينات في الكسور وسوف تتراوح بين 0.5 و 5 ميكروغرام/ميليلتر، عن انخفاض في الكسر النووي (انظر الجدول 2 لتركيزات البروتين الناتجة من خزعات 2 مغ).
<ol><li>إعداد منحنى قياسي مع ألبومين المصل البقري (BSA) التالي المبالغ (ميكروغرام)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>إعداد الكواشف اللازمة لاستخدام 100 ميليلتر من المزيج اتفاق التعاون الأساسي النهائي كل عينة.</li>
	<li>"الماصة؛" 2 ميليلتر من كل جزء من البروتين في طبق جيدا 96 وإضافة مزيج اتفاق التعاون الأساسي واتبع إرشادات الشركة المصنعة للقراءة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).</li><li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases:+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies.">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li><li>Ericsson, C., Franz&#233;n, B., Nist&#233;r, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling,+cryopreservation,+extraction,+and+use+for+proteomic+analysis.">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يستخدم بروتوكول الموصوفة هنا لتجزئة النووية وحشوية من الخزعات المعوية. البروتينات المنقاة هي عدم التشويه والتحريف ويمكن استخدامه ليس فقط في تحليل لطخة غربية كما هو مبين في الشكل 2 و 3 ولكن أيضا في الاختبارات التي تتطلب البروتينات مطوية أصلي مثل إيمونوبريسيبيتيشن...

البروتينات المشاركة في ما يقرب من جميع الوظائف البيولوجية داخل خلية وأي اختلاف في هيكل أو الكمية أو مكان يمكن أن يؤدي إلى سيناريو المسببة للأمراض. أساليب وجود عينة الأنسجة نهجاً مفيداً الحد من تعقيد المرض ذات الصلة بتحليل البروتين. بعض الدراسات استخدام البروتين التعريب المعلومات أو إثراء بروتين من حجرة الهاتف خلوي محددة، ذلك بروتوكول لتجزئة استنساخه من البروتينات سليمة مفيدة للرد على بعض الأسئلة البيولوجية. تحديد الترجمة سوبسيلولار للبروتينات والرصد على إعادة توزيع مقسم أو التفاعلات في القاعدية وظروف المرض سيساعد على تحديد الأمراض المتعلقة بالاختلافات الوظيفية1،2. وبالتالي، يهدف هذا الأسلوب إلى تكاثر يجزئ خزعات الأنسجة المعوية، الطازجة والمجمدة، في مقصورات سوبسيلولار هيولى والنووية على حد سواء.
عينات خزعة الأمعاء بشكل روتيني يتم الحصول عليها من خلال إجراءات التنظير3 (الشكل 1)، ويمكن استخدامه بفعالية لتحديد مقدار البروتين أو الدراسات إيمونوبريسيبيتيشن. سوف تحتوي على عينات الأنسجة من الأمعاء الظهارية البروتينات التي قد تكون ضالعة مباشرة في إمراضية المرض4، عينات خزعة الأمعاء مصدرا قيماً للغاية لتحديد هوية الناجحة الخاصة بالأمراض المعوية البروتينات. عينات الأنسجة المجمدة، والمريض المخزنة جنبا إلى جنب مع المعلومات السريرية موارد مفيدة لتحليل البروتين، وإعداد نموذج بسيط واستنساخه مسألة أساسية لتوفير معلومات الخلية يغلب استخدام المبالغ المقيدة لتجميد 5من الأنسجة.
هناك عدة مجموعات المتاحة تجارياً للفصل بين كسور الخلوية، ولكن هذه أكثر تكلفة وعموما أكثر استهلاكاً للوقت من البروتوكول المعروضة هنا. استناداً إلى بروتوكولات متعددة الخطوات المتدرجة الطرد المركزي وكما استخدمت التدرجات المستمر سابقا لتجزئة المقصورات الخلوية المتنوعة في أنسجة مختلفة6،7. ومع ذلك، الحفاظ على الاتساق بين التدرجات المستمر غالباً ما مهمة صعبة. بروتوكولات مماثلة تستند إلى تحلل متسلسل للأغشية وقد وصفت سابقا ولكن يحتاجون عادة اثنين أو أكثر من المخازن المؤقتة والأيدي في الوقت المحدد هو أطول8 .
عند تجزئة عينات الأنسجة، إلا يغيب عن البال أن النسيج عينات التفاعلات خلية خلية وخلية المصفوفة الحالية التي غير موجودة في الخلايا المستزرعة وهامة عند الشروع في استخراج البروتين. انهيار السليم بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية دون التأثير على نوعية البروتين سيكون عاملاً حاسما في عزل بروتين الأنسجة المعوية9. في هذا البروتوكول، جهات الاتصال خلية خلية وخلية المصفوفة أولاً مكسورة، الإفراج عن الخلايا ويسمح المخزن المؤقت للوصول إلى الخلايا الفردية. لتجنب البروتين-حجرة خلط قبل تجزئة، يجب أن يحدث انهيار الاتصالات دون تغيير سلامة الخلايا أو الأغشية النووية.
سبب إثراء البروتياز المختلفة في مخاطية الأمعاء10، من المهم مراقبة تدهور البروتين أثناء الاستخراج. للحد من تدهور البروتين المحتملة، يجب تضمين مثبط البروتياز متعددة في مخازن استخراج البروتين. بالإضافة إلى ذلك، إذا مقتطفات ذاهبون لاستخدامها لفحوصات الوظيفية، من الضروري لتجنب تمسخ البروتينات أو بروتيوليسيس لأن هذا سوف يسبب خسارة في نشاط البروتين11. ولهذا الغرض، يتم تنفيذ البروتوكول في 4 درجات مئوية وفلوريد فينيلميثيلسولفونيل الطازج (بمسف) يتم إضافة إلى المخازن المؤقتة بتركيز 0.1 مم فقط قبل استخدامها لتمنع كذلك proteolysis نهائية.
هو الخطوة الأولى في وجود خلية اختلال الأنسجة وتحلل الخلية. وكما ذكر سابقا، يتمثل الهدف في تصنيف الخلايا وكسر لهم فتح مع الحد الأدنى من الضرر. يجب أن يكون تجانس عينات الأنسجة المعوية، وتفكيك الخلايا لتحقيق الحد الأقصى من الكسر من غشاء الخلية. في هذا البروتوكول، نستخدم خلاط مدقة يجهز لكسر الأنسجة المعوية الذي هو تجانس في غضون ثوان عن طريق عمل فورتيكسينج عالية السرعة. بعد التجانس، هي المحتضنة خلايا الأنسجة في المخزن مؤقت ناقص التوتر الذي سوف تنفجر غشاء الخلية ولكن سوف تبقى النواة سليمة، تليها إضافة منظفات غير يشوه (نونيل فينوكسيبوليثوكسيليثانول) ودوامه قصيرة لفصل النوى من الكسر هيولى. بعد إزالة السيتوبلازم، غشاء نواة الخلية هو اقتحام حاجز مكثف مع الهز.
طريقة المقدمة هنا هي طريقة مناسبة لتجزئة سوبسيلولار من الخزعات المعوية الطازجة والمجمدة التي تم الحصول عليها خلال المنظار وتتراوح بين 2 و 10 ميكروغرام في الوزن. البروتوكول سهل واستنساخه، ويمكن أن يؤديها باستخدام المعدات المختبرية الأساسية والمواد الكاشفة في أقل من ساعة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">HEPES</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-1kg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">KCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5588886-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">DTT</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">PMSF</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Proteinase and phosphatase inhibitors</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A32959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NP-40&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CA-630</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">BCA assay</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23227</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Disposable plastic pestles</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359947-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Dounce homogeneizer</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:128px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Shacker</td>
			<td style="width:128px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">MS3 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

والغرض من هذا البروتوكول يجزئ الأنسجة المعوية البشرية التي حصل عليها التنظير في المقصورات النووية وهيولي لتحليل التعريب من بروتينات محددة أو مجمعات البروتين في الأنسجة مختلف الدول (أي، صحية مقابل المرض). يعد هذا الأسلوب مفيداً لتجزئة كلا عينات الأنسجة المعوية الطازجة والمجمدة؛ ومن الوصول إليها بسهولة لجميع المختبرات ولا تستغرق وقتاً طويلاً.

ويبين الشكل 1 ثم توضع تلطيخ قسم خزعة الأمعاء مع الزوائد سليمة وهياكل سرداب.
وتظهر نتائج الممثل وجود النووي وهيولي استخدام هذا البروتوكول في الأرقام 2 و 3. في هذه التجربة هو مبين في الشكل 2، ...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

نقدم هنا، بروتوكول القيام تجزئة خلوية بسيطة لفصل سوبسيلولار من البروتينات هيولى والنووية في الخزعات المعوية البشرية الطازجة والمجمدة.

تجزئة سوبسيلولار من العينات المعدية المعوية الطازجة والمجمدة

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

An Overview of the Gastrointestinal System: Anatomy, Physiology, and Assessment

SCIENTISTS IN ACTION

9.6K Views.  University of the Basque Country (UPV-EHU), Biocruces Health Research Institute. نقدم هنا، بروتوكول القيام تجزئة خلوية بسيطة لفصل سوبسيلولار من البروتينات هيولى والنووية في الخزعات المعوية البشرية الطازجة والمجمدة.

Video: Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

الزاجل فحوصات تنافسية لدراسة غوت - مدار هجرة الخلايا التائية

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. There are currently no known methods for growing M. leprae in vitro, presenting a major obstacle in the study of this pathogen in the laboratory. Therefore, the maintenance and growth of M. leprae strains are preferably performed in athymic nude mice (NU-Foxn1nu). The laboratory conditions for using mice are readily available, easy to perform, and allow standardization and development of protocols for achieving reproducible results. In the present report, we describe a simple protocol for purification of bacilli from nude mouse footpads using trypsin, which yields a suspension with minimum cell debris and with high bacterial viability index, as determined by fluorescent microscopy. A modification to the standard method for bacillary counting by Ziehl-Neelsen staining and light microscopy is also demonstrated. Additionally, we describe a protocol for freezing and thawing bacillary stocks as an alternative protocol for maintenance and storage of M. leprae strains.

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Mycobacterium leprae, the causative agent of leprosy, does not grow in vitro. We describe an easy to follow protocol to prepare a bacillary suspension to ensure the maintenance of large quantities of M. leprae for a variety of applications. Protocols for propagation by mouse footpad inoculation, evaluation of viability, freezing and thawing bacillary stock are described in detail.

البروتوكولات الأمثل ل<em&gt; المتفطرة الجذامية</em&gt; إدارة الإجهاد: الأسهم المجمدة حفظ وصيانة في الفئران عارية Athymic

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

تحريض الفئران المعوية التهاب عن طريق نقل بالتبني من المستجيب CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; عالية</sup&gt; خلايا T في الفئران العوز المناعي

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

التحول من الخميرة بروبيوتيك وشفائهم من الجهاز الهضمي المناعي الأنسجة بعد بالتزقيم عن طريق الفم في الفئران

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

المجهرية الخلوية التفاعلية للتحقيق في توطين البروتين تحت الخلوي والتغيرات في الخلايا المورفولوجية في البكتيريا

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

عزل مجموعات الضامة والخلايا اللحمية من الإنسان والماوس عينات عضله القلب

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...