Autori riconoscono l'assistenza di Ander Lopez e Miren Telletxea per la registrazione e l'editing dei video. ACR è finanziato da una borsa di studio Ikerbasque e un progetto di ricerca dal Asociación de Celiacos di Madrid (ACM). JRB è finanziato dal progetto ISCIII-PI16/00258 e co-finanziato dal FESR/FSE Unione europea "Un modo per fare dell'Europa". È è finanziata da una sovvenzione di progetto di ricerca 2015111068 del basco dipartimento della salute. IRG e AJM sono supportate da sussidi per la fellowship predoctoral da UPV/EHU e il basco Department of Education, rispettivamente.

Questo studio è stato approvato dal comitato di etica di Cruces University Hospital e analisi sono state eseguite dopo consenso informato è stato ottenuto da tutti gli oggetti o i loro genitori.
1. biopsia collezione
Nota: Gli esemplari di biopsia dal duodeno distale dei pazienti sono ottenuti durante l'endoscopia di diagnosi sistematica gestione biopsie comprese tra 2 e 10 mg di peso. Tessuto biopsiato è un tessuto complesso composto da diversi tipi cellulari tra cui cellule epiteliali, immuni ed endoteliali. I gastroenterologi clinici eseguire l'endoscopia segue stabilito linee guida cliniche.
<ol><li>Posto la biopsia su una carta da filtro sterile subito dopo l'endoscopia.</li>
	<li>Utilizzare pinze per trasferire le biopsie in provette da 1,5 mL, metterli a bagno con PBS e posizionarlo in un stoccaggio provette criogenia.</li>
	<li>Mantenere i tubi sul ghiaccio fino ad arrivare al laboratorio.<ol>
<li>Avviare l'elaborazione delle biopsie fresche immediatamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per le biopsie congelate, flash congelare la biopsia contenente tubi e conservare in azoto liquido fino all'utilizzo. Nota: È importante mantenere il campione congelato finché non viene aggiunto il buffer completato freddo 1.</li>
</ol>2. preparazione buffer
Nota: Prima di iniziare, completare i buffer come segue.
<ol><li>Aggiungere 1 millimetro DTT (concentrazione finale) e proteasi e fosfatasi inibitore cocktail (1x concentrazione finale) al buffer ipotonico ipertonico e 1 tampone 2 (tabella 1).<ol>
<li>Preparare 1,5 mL di tampone 1 e 150 µ l di tampone 2 per campione. DTT impedirà l'ossidazione dei campioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il tampone di lavaggio nuclei aggiungendo 1% detergente (nonil phenoxypolyethoxylethanol) a una concentrazione finale di 0,1% al buffer già completati 1. Preparare 1 mL di tampone di lavaggio di nuclei per campione.</li>
</ol>3. biopsia omogeneizzazione
<ol><li>
Biopsie fresche
	<ol>
<li>Posto il pestello monouso nel mixer motorizzato. Assicurarsi che il pestello raggiunge il fondo del tubo.</li>
		<li>Estrarre la biopsia dallo stoccaggio provette criogenia e metterlo in una provetta da 1,5 mL con un puntale.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di tampone completati 1 la provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Omogeneizzare la biopsia con il pestello fino a quando il tessuto è completamente sconvolta e tenerlo sul ghiaccio.</li>
		<li>Una volta che tutte le biopsie sono omogeneizzate procedere con il passaggio 4. Nota: Pestelli monouso devono essere modificati tra le biopsie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biopsie congelate Attenzione: Maneggiare azoto liquido; dell'azoto liquido con la pelle o gli occhi può provocare gravi lesioni di congelamento. Proteggere le mani e gli occhi sempre quando si lavora con l'azoto liquido.<ol>
<li>Prendere alcuni azoto liquido in una scatola per conservare le provette per criogenia Estratto dal serbatoio di azoto.</li>
		<li>Trovare la biopsia nel serbatoio di azoto e posizionare lo stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA nella finestra con l'azoto liquido. Ripetere questo passaggio per tutte le biopsie.</li>
		<li>Trasferire la biopsia dallo stoccaggio provette criogenia per un tubo da 1,5 mL. Nota: Le biopsie saranno allegate al tubo congelato. Spingere la biopsia con una pipetta sterile così staccherà dal tubo.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di tampone completati 1.</li>
		<li>Omogeneizzare il tessuto usando il mortaio e il pestello fino a quando il tessuto è completamente sconvolta, mantenendo la temperatura a 4 ° C durante tutta la procedura. Nota: Non lasciare che le biopsie scongelare prima di aggiungere il buffer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. citoplasma isolamento
<ol><li>Incubare la biopsia omogeneizzata in ghiaccio per 10 min.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di 1% detergente (nonil phenoxypolyethoxylethanol) per ogni campione a una concentrazione finale di 0.05%. Nota: Le cellule saranno gonfiarsi e scoppiare da lisi osmotica come il detergente delicato altererà la membrana cellulare.</li>
	<li>Incubare in ghiaccio per 5 minuti.</li>
	<li>Vortex brevemente e centrifuga a 400 x g a 4 ° c per 2 min.</li>
	<li>Dopo Vortex, rimuovere il supernatante e trasferirlo in un nuovo tubo pulito 1,5 mL; Questa sarà la frazione citoplasmatica. Non gettare il pellet.</li>
</ol>5. isolamento nucleare
<ol><li>Risospendere il pellet dal passaggio precedente con 200 µ l di tampone di lavaggio di nuclei.</li>
	<li>Centrifugare la provetta per 2 min a 400 x g e a 4 ° C.</li>
	<li>Scartare il surnatante e ripetere il lavaggio due volte. Nota: I lavaggi rimuoverà citoplasmico contaminazione nella frazione nucleare.</li>
	<li>Dopo il terzo lavaggio, risospendere il pellet in 100 µ l di tampone di 2.</li>
	<li>Agitare il campione a 4 ˚ c per 30 min. in alternativa, incubare il campione sul ghiaccio e agitare ogni 5 min.</li>
	<li>Dopo l'agitazione, centrifugare il campione per 10 min alla massima velocità (> 12.000 x g) e 4 ° C.</li>
	<li>Dopo Vortex, trasferire il surnatante in un nuovo 1.5 pulito. tubo da mL. Si tratta della frazione nucleare.</li>
</ol>6. proteina quantificazione
Nota: Quantificare le proteine con un kit di test bicinconinico proteina acida (BCA). La concentrazione delle proteine nelle frazioni sarà compreso tra 0,5 e 5 µ g / µ l, essendo più basso nella frazione nucleare (Vedi tabella 2 per le concentrazioni di proteina risultante dalle biopsie 2mg).
<ol><li>Preparare una curva standard con i seguenti importi (µ g) di albumina di siero bovino (BSA)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>Preparare i reagenti necessari per utilizzare 100 µ l di mix finale BCA per campione.</li>
	<li>Pipettare 2 µ l di ciascuna frazione della proteina in un piatto ben 96, aggiungere il mix BCA e seguire le istruzioni del produttore per la lettura.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).</li><li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases:+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies.">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li><li>Ericsson, C., Franz&#233;n, B., Nist&#233;r, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling,+cryopreservation,+extraction,+and+use+for+proteomic+analysis.">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto qui è usato per il frazionamento nucleare e citoplasmatico di biopsie intestinali. Le proteine purificate non sono denaturate e può essere utilizzate non solo nell'analisi di western blot come mostrato in Figura 2 e 3 , ma anche nelle analisi che richiedono nativo-piegato proteine quali immunoprecipitazione, analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA) o elettroforesi nativa del gel di poliacrilammide (PAGE).
<p class="jove_cont...

Proteine partecipano a quasi tutte le funzioni biologiche all'interno di una cella e qualsiasi variazione nella loro struttura, la quantità o la posizione può portare a uno scenario di patogeno. Metodi di frazionamento dei campioni del tessuto sono un utile approccio per ridurre la complessità della malattia relative analisi di proteine. Alcuni studi utilizzano informazioni di localizzazione della proteina o arricchiscono una proteina da un compartimento cellulare specifico, quindi un protocollo per il frazionamento riproducibile di proteine intatte è utile per rispondere a taluni quesiti biologici. Determinare la localizzazione subcellulare delle proteine e monitoraggio loro ridistribuzione compartimentali o interazioni al basale e condizioni di malattia verranno aiuterà a identificare la malattia relative differenze funzionali1,2. Questo metodo intende quindi, riproducibile frazionare le biopsie del tessuto intestinale sia fresche che congelate, in compartimenti subcellulari citoplasmatici e nucleari.
I campioni di biopsia intestinale sono ordinariamente ottenuti durante l'endoscopia procedure3 (Figura 1) e possono essere efficacemente utilizzati per la quantificazione della proteina o studi di immunoprecipitazione. Dal momento che i campioni di tessuto da intestinale epiteliali conterrà le proteine che possono essere direttamente coinvolti in patogenesi malattia4, campioni di biopsia intestinale sono una fonte molto preziosa per l'identificazione di successo di specifica di malattia intestinale proteine. Campioni di tessuto congelato, paziente memorizzati insieme con le informazioni cliniche sono risorse utili per l'analisi della proteina, e una preparazione del campione semplice e riproducibile è una questione chiave per fornire informazioni compartimentali cella utilizzando quantità limitante di congelati tessuto5.
Ci sono diversi kit disponibile in commercio per la separazione di frazioni cellulari, ma questi sono più costosi e in genere richiede più tempo rispetto al protocollo presentato qui. Protocolli basati su centrifugazione in gradiente di più-passaggio e pendenze continue inoltre sono state usate in precedenza per il frazionamento dei diversi compartimenti cellulari in diversi tessuti6,7. Tuttavia, mantenendo la coerenza delle pendenze continue è spesso un compito difficile. Simili protocolli basati sulla sequenza lisi delle membrane precedentemente sono stati descritti, ma hanno bisogno generalmente più di due buffer e le mani sul tempo è più lungo di8 .
Quando i campioni di tessuto di frazionamento, tenete a mente che il tessuto campioni presenti cellula-cellula e cellula-matrice interazioni che sono presenti nelle cellule in coltura non sia importante quando si procede all'estrazione della proteina. La corretta ripartizione tra cellule e matrice extracellulare senza compromettere la qualità di proteina sarà un fattore critico nel tessuto intestinale della proteina isolamento9. In questo protocollo, contatti cellula-cellula e cellula-matrice in primo luogo sono rotti, liberando le cellule e permettendo che il buffer raggiungere le singole celle. Per evitare la proteina-vano di miscelazione prima del frazionamento, la ripartizione dei contatti deve avvenire senza alterare l'integrità delle membrane nucleari o le celle.
Dovuto l'arricchimento di varie proteasi nella mucosa intestinale10, è importante controllare la degradazione della proteina durante l'estrazione. Per ridurre al minimo il potenziale degradazione della proteina, più l'inibitore della proteasi deve essere incluso nei buffer di estrazione di proteine. Inoltre, se estratti stanno per essere utilizzati per analisi funzionali, è essenziale per evitare la denaturazione delle proteine o proteolisi ciò causerebbe una perdita di proteina attività11. Per questo scopo, il protocollo viene eseguito a 4 ° C e fluoruro di phenylmethylsulfonyl fresco (PMSF) viene aggiunto al buffer ad una concentrazione finale di 0,1 mM appena prima dell'uso per inibire ulteriore proteolisi.
Il primo passo nel frazionamento delle cellule è la rottura del tessuto e lisi cellulare. Come accennato in precedenza, l'obiettivo è quello di disaggregare le cellule e la rottura che li aperto con danni minimi. Campioni di tessuto intestinale devono essere omogeneizzati, e le cellule lisate per ottenere massima rottura della membrana cellulare. In questo protocollo, usiamo un mixer motorizzato pestello per rompere il tessuto intestinale che è omogeneizzato in pochi secondi mediante azione Vortex ad alta velocità. Dopo omogeneizzazione, cellule del tessuto vengono incubate in un buffer ipotonico che scoppierà la membrana delle cellule, ma manterrà i nuclei intatti, seguita dalla aggiunta di un detergente non-denaturante (nonil phenoxypolyethoxylethanol) e un breve vortice per separare i nuclei dalla frazione citoplasmatica. Dopo la rimozione del citoplasma, la membrana di nuclei delle cellule è scoppiò in un buffer ipertonico con agitazione.
Il metodo presentato qui è un metodo appropriato per il frazionamento subcellulare di biopsie intestinali freschi e congelati che sono stati ottenuti durante le procedure endoscopiche e intervallo tra 2 e 10 mg di peso. Il protocollo è semplice e riproducibile e può essere eseguito utilizzando apparecchiature di laboratorio di base e i reagenti in meno di un'ora.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase and phosphatase inhibitors</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Protein quantification kit</td></tr><tr><td>Disposable plastic pestles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogeneizer</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 basic</td><td></td></tr></tbody></table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

Lo scopo del presente protocollo è quello di frazionare il tessuto intestinale umano ottenuto dall'endoscopia in compartimenti nucleari e citoplasmatici per l'analisi di localizzazione di specifiche proteine o complessi proteici in stati differenti del tessuto (cioè, sano vs malattia). Questo metodo è utile per il frazionamento di entrambi i campioni freschi e congelati di tessuto intestinale; è facilmente accessibile per tutti i laboratori e non richiede molto tempo.

La figura 1 Mostra un ematossilina eosina di una sezione di biopsia intestinale con villi intatti e strutture della cripta.
Risultati rappresentativi del frazionamento nucleare e citoplasmatica usando questo protocollo sono mostrati nelle figure 2 e 3. Nell'esperimento mostrato in Figura 2, un fresco (Fh) e un congelato (Fz) biopsia son...

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Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un frazionamento cellulare semplice per la separazione subcellulare delle proteine citoplasmatiche e nucleari in biopsie intestinali umane fresche e congelate.

Frazionamento subcellulare dagli esemplari gastrointestinali freschi e surgelati

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

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Unit 1

An Overview of the Gastrointestinal System: Anatomy, Physiology, and Assessment

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Views.  University of the Basque Country (UPV-EHU), Biocruces Health Research Institute. Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un frazionamento cellulare semplice per la separazione subcellulare delle proteine citoplasmatiche e nucleari in biopsie intestinali umane fresche e congelate.

Video: Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Isolamento di CD 90+ fibroblasti / miofibroblasti da umani congelati gastrointestinali campioni


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

Il frazionamento delle cellule delle cellule U937 in assenza di centrifugazione ad alta velocità

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Biochimica

Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused on bulk approaches that led to the molecular classification of brain tumors. Over the last five years, single cell sequencing approaches have highlighted several important features of gliomas. The majority of these studies have utilized fresh brain tumor specimens to isolate single cells using flow cytometry or antibody-based separation methods. Moving forward, the use of fresh-frozen tissue samples from biobanks will provide greater flexibility to single cell applications. Furthermore, as the single-cell field advances, the next challenge will be to generate multi-omics data from either a single cell or the same sample preparation to better unravel tumor complexity. Therefore, simple and flexible protocols that allow data generation for various methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and single nucleus Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) will be important for the field.
Recent advances in the single cell field coupled with accessible microfluidic instruments such as the 10x genomics platform have facilitated single cell applications in research laboratories. To study brain tumor heterogeneity, we developed an enhanced protocol for the isolation of single nuclei from fresh frozen gliomas. This protocol merges existing single cell protocols and combines a homogenization step followed by filtration and buffer mediated gradient centrifugation. The resulting samples are pure single nuclei suspensions that can be used to generate single nucleus gene expression and chromatin accessibility data from the same nuclei preparation.

Intra-tumoral heterogeneity is an inherent feature of tumors, including gliomas. We developed a simple and efficient protocol that utilizes a combination of buffers and gradient centrifugation to isolate single nuclei from fresh frozen glioma tissues for single nucleus RNA and ATAC sequencing studies.

Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq

Adult diffuse gliomas exhibit inter- and intra-tumor heterogeneity. Until recently, the majority of large-scale molecular profiling efforts have focused ...

Ricerca sul cancro

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale Ex Vivo e 3D In Vitro intestinale Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and isopycnic density gradient centrifugation. The major advantage of this procedure is that it does not rely on the sole use of solubilizing detergents to obtain subcellular fractions. This makes it possible to separate the plasma membrane from other membrane-bound organelles of the cell. This procedure will facilitate the determination of protein localization in cells with a reproducible, scalable, and selective method. This method has been successfully used to isolate cytosolic, nuclear, mitochondrial, and plasma membrane proteins from the human monocyte cell line, U937. Although optimized for this cell line, this procedure may serve as a suitable starting point for the subcellular fractionation of other cell lines. Potential pitfalls of the procedure and how to avoid them are discussed as are alterations that may need to be considered for other cell lines.

This fractionation protocol will allow researchers to isolate cytoplasmic, nuclear, mitochondrial, and membrane proteins from mammalian cells. The latter two subcellular fractions are further purified via isopycnic density gradient.

Frazionamento cellulare di cellule U937 mediante purificazione del gradiente di densità isopicnica

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...

Isolamento di nuclei per il sequenziamento multioma in campioni di tumore solido

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) data, represents a breakthrough in our ability to discern tumor cell heterogeneity-a primary focus of translational cancer research at this time. However, the quality of sequencing data acquired using this advanced modality is highly dependent on the quality of the input material. 
Digestion conditions need to be optimized to maximize cell yield without sacrificing quality. This is particularly challenging in the context of solid tumors with dense desmoplastic matrices that must be gently broken down for cell release. Freshly isolated cells from solid tumor tissue are more fragile than those isolated from cell lines. Additionally, as the cell types isolated are heterogeneous, conditions should be selected to support the total cell population. 
Finally, nuclear isolation conditions must be optimized based on these qualities in terms of lysis times and reagent types/ratios. In this article, we describe our experience with nuclear isolation for the 10x Genomics multiome sequencing platform from solid tumor specimens. We provide recommendations for tissue digestion, storage of single-cell suspensions (if desired), and nuclear isolation and assessment.

Autore in primo piano: Miglioramento dell'isolamento dei nuclei per il sequenziamento multioma in microambienti tumorali difficili

The protocol provides a reliable and optimized approach to the isolation of nuclei from solid tumor specimens for multiome sequencing using the 10x Genomics platform, including recommendations for tissue dissociation conditions, cryopreservation of single-cell suspensions, and assessment of isolated nuclei.

Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Biologia

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Frazionamento subcellulare dagli esemplari gastrointestinali freschi e surgelati

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Isolamento di CD 90+ fibroblasti / miofibroblasti da umani congelati gastrointestinali campioni

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Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq

Immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale Ex Vivo e 3D In Vitro intestinale Organoids

Frazionamento cellulare di cellule U937 mediante purificazione del gradiente di densità isopicnica

Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi

Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi

Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi

In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

Ottimizzazione di Laser Capture Microdissection per l'isolamento dei gangli enterici dal tessuto umano fresco congelato