מחברים להכיר את הסיוע של לופז Ander ו Miren Telletxea הקלטה ועריכה וידאו. ACR ממומן על-ידי התחברות Ikerbasque של פרויקט מחקר שבסיסה Celiacos דה מדריד (ACM). מחדרהמלון הוא ממומן על ידי פרויקט ISCIII-PI16/00258, והיתה שותפה במימון מאת האיחוד האירופי ERDF/ESF "דרך להפוך את אירופה". הוא ממומן על ידי מענק פרוייקט מחקר 2015111068 של מחלקת הבריאות בסקית. IRG מלכה פרחיה נתמכים על ידי מענקים מלגת predoctoral את UPV/EHU והבסקים משרד החינוך, בהתאמה.

מחקר זה אושרה על-ידי קרוסס אוניברסיטת אתיקה המנהלים, ניתוחים בוצעו לאחר הסכמה מדעת היה המתקבלים בכל המקצועות או הוריהם.
1. ביופסיה אוסף
הערה: דגימות ביופסיה מן התריסריון דיסטלי של המטופלים מתקבלים במהלך אנדוסקופיה אבחון שגרתי ניהול ביופסיות הטווח בין 2 ו- 10 מ"ג במשקל. הרקמה ביופסיה היא רקמה מורכבת המורכב לסוגי תאים שונים לרבות אפיתל, מערכת החיסון ותאי אנדותל. הגסטרואנטרולוגיה קליניים לבצע אנדוסקופיה את הבאים הוקמה הנחיות קליניות.
<ol><li>הנח את הביופסיה על נייר סינון סטרילי רק לאחר אנדוסקופיה.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים כדי להעביר את ביופסיות 1.5 mL צינורות, להשרות אותם עם PBS, ולמקם אותו לתוך cryotube.</li>
	<li>שמור צינורות על הקרח עד שהם מגיעים במעבדה.<ol>
<li>הפעל עיבוד של ביופסיות טריים באופן מיידי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביופסיות קפוא, פלאש להקפיא את הביופסיה המכילים צינורות, לאחסן בחנקן נוזלי עד השימוש. הערה: חשוב לשמור על המדגם קפוא עד המאגר שהושלם קר 1 נוסף.</li>
</ol>2. מאגר הכנה
הערה: לפני שמתחילים, תוספת המאגרים כדלקמן.
<ol><li>להוסיף 1 מ"מ DTT (ריכוז סופי), מאגר פרוטאז, פוספטאז מעכב קוקטייל (1 x ריכוז סופי) למאגר היפוטוניק 1, hypertonic 2 (טבלה 1).<ol>
<li>להכין 1.5 מ של מאגר 1 ו- 150 µL מאגר 2 עבור דגימה. DTT יהיה למנוע החמצון של הדגימות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מאגר שטיפת גרעינים על-ידי הוספת 1% דטרגנט (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) כדי ריכוז סופי של 0.1% אל המאגר כבר שהושלם 1. להכין 1 מ"ל גרעינים מאגר שטיפת לדגימה.</li>
</ol>3. ביופסיה המגון
<ol><li>
ביופסיות טריים
	<ol>
<li>מקום איחדו חד פעמיים את המיקסר ממונע. לוודא איחדו יגיע לתחתית הצינור.</li>
		<li>להוציא את הביופסיה מ cryotube ולמקם אותו צינור 1.5 מ עם טיפ פיפטה.</li>
		<li>להוסיף 200 µL מאגר שהושלם 1 צינור 1.5 מ.</li>
		<li>Homogenize את הביופסיה עם איחדו עד הרקמה מופרת לחלוטין ולשמור אותו בקרח.</li>
		<li>לאחר כל והביופסיות הם הומוגני להמשיך בשלב 4. הערה: יש לשנות בקווקז חד פעמי בין ביופסיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ביופסיות קפוא התראה: להתמודד עם חנקן נוזלי בקפידה; מגע של חנקן נוזלי עם העור או העיניים עלול לגרום פגיעה חמורה מקפיא. להגן על כפות הידיים והעיניים תמיד בעת עבודה עם חנקן נוזלי.<ol>
<li>קח כמה חנקן נוזלי בתוך קופסה לאחסון את cryotubes שאוחזר למיכל חנקן.</li>
		<li>למצוא את הביופסיה במיכל חנקן ולמקם את cryotube בתיבה עם החנקן הנוזלי. חזור על שלב זה עבור כל והביופסיות.</li>
		<li>להעביר את הביופסיה cryotube צינור 1.5 מ. הערה: ביופסיות תצורף הצינור קפוא. לדחוף את הביופסיה עם טיפ פיפטה סטרילי אז זה הם ינותקו מהצינור.</li>
		<li>להוסיף 200 µL מאגר שהושלם 1.</li>
		<li>Homogenize הרקמה באמצעות שהעקב ופצצות מרגמה עד הרקמה מופרת לחלוטין, שמירה על הטמפרטורה ב 4 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך. הערה: אל תתנו ביופסיות להפשיר לפני הוספת המאגר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ציטופלזמה בידוד
<ol><li>דגירה ביופסיה homogenized על קרח למשך 10 דקות.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של 1% סבון (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) כל דגימה כדי ריכוז סופי של 0.05%. הערה: תאים ויוצרים פרץ על ידי פירוק osmotic כמו הנוזל מתון ישבש את קרום התא.</li>
	<li>דגירה על קרח למשך 5 דקות.</li>
	<li>מערבולת בקצרה, צנטריפוגה ב 400 x g ב- 4 הלעפה תרוטרפמט למשך 2 דקות.</li>
	<li>לאחר vortexing, להסיר את תגובת שיקוע, להעביר אותו צינור נקי mL 1.5; זה יהיה השבר cytoplasmic. אל תמחק את גלולה.</li>
</ol>5. גרעיני בידוד
<ol><li>Resuspend בגדר מהשלב הקודם עם 200 µL גרעינים שטיפת המאגר.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור למשך 2 דקות 400 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע, חזור על התהליך הכביסה פעמיים נוספות. הערה: מנקי יסיר cytoplasmic זיהום בהשבר הגרעין.</li>
	<li>לאחר לשטוף את השלישי, resuspend בגדר ב 100 µL מאגר 2.</li>
	<li>לנער את הדגימה נמרצות ב 4 הלעפה תרוטרפמט במשך 30 דקות לחלופין, דגירה המדגם על קרח, מערבולת כל 5 דקות.</li>
	<li>לאחר טלטולים, centrifuge את הדגימה 10 דקות בשיא המהירות (> 12,000 x g) ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר vortexing, להעביר את תגובת שיקוע לתוך 1.5 נקי חדש. mL שפופרת. זה יהיה השבר הגרעין.</li>
</ol>6. חלבון כמת
הערה: לכמת את החלבונים עם bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון assay ערכת. ריכוז חלבונים בהשברים ינוע בין 0.5 ל- 5 µg/µL, להיות נמוך השבר הגרעין (ראו טבלה 2 ריכוז חלבון הנובעת מ- 2 מ ג ביופסיות).
<ol><li>להכין עיקול רגיל עם כמויות (µg) אלבומין שור (BSA) שלהלן12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>הכינו את ריאגנטים הדרושים לשימוש µL 100 של המיקס הסופי BCA לדגימה.</li>
	<li>פיפטה 2 µL של כל שבר חלבון במנת טוב 96, להוסיף את תערובת BCA, בצע את הוראות היצרן עבור הקריאה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).</li><li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases:+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies.">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li><li>Ericsson, C., Franz&#233;n, B., Nist&#233;r, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling,+cryopreservation,+extraction,+and+use+for+proteomic+analysis.">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן משמש את fractionation גרעינית, cytoplasmic של ביופסיות מעיים. החלבונים מטוהרת הם לא שפגע בסימני והוא יכול לשמש לא רק בניתוח תספיג כמוצג באיור 2 ו- 3 אלא גם מבחני הדורשים מקופלת מקורי חלבונים כגון immunoprecipitation, electrophoretic ניידות shift assay (EMSA) או יליד לזיהוי בג'ל (עמו...

חלבונים להשתתף כמעט את כל הפונקציות הביולוגי בתוך תא, כל וריאציה במבנה שלהם, כמות או מיקום יכול להוביל תרחיש פתוגניים. רקמות מדגם fractionation שיטות הן בגישה שימושי כדי להפחית את המורכבות של מחלות הקשורות חלבון ניתוחים. מספר מחקרים להשתמש במידע לוקליזציה חלבון או להעשיר את חלבון מתא סלולרית ספציפית, אז עבור fractionation לשחזור של חלבונים שלמים פרוטוקול זה שימושי לענות על שאלות ביולוגיות מסוימות. לקביעת ההתאמה subcellular של חלבונים וניטור הפצה compartmental או אינטראקציות על הבסיס שלהם תנאים המחלה תסייע לזהות מחלה הקשורה הבדלים תפקודיים1,2. לכן, בשיטה זו שואפת reproducibly fractionate רקמת המעי ביופסיות, טריים וקפואים, לתוך תאים subcellular cytoplasmic וגרעיני.
דגימות הביופסיה מעיים מתקבלים באופן שגרתי במהלך אנדוסקופיה הליכים3 (איור 1), יכול לשמש ביעילות עבור כימות חלבון או לימודים immunoprecipitation. מאז דגימות רקמה מן המעי אפיתל יכיל חלבונים אשר עשויים להיות מעורבים ישירות בפתוגנזה המחלה4, דגימות ביופסיה מעיים הם מקור חשוב מאוד לצורך זיהוי מוצלח מעיים מחלות ספציפיות חלבונים. דגימות רקמה, החולה קפוא מאוחסנים יחד עם המידע הקליני הם משאבים שימושיים עבור חלבונים, הכנה מדגם לשחזור ופשוט הוא סוגיה מרכזית לספק מידע compartmental תא באמצעות הגבלת כמויות קפוא רקמות5.
ישנם מספר ערכות זמינים מסחרית לצורך הקמת מכשול ההפרדה של שברים הסלולר, אבל אלה יקרים יותר, בדרך כלל זמן רב יותר מאשר בפרוטוקול המוצג כאן. פרוטוקולים בהתבסס על צנטריפוגה הדרגתיים מרובים-צעד, מעברי צבע רציף גם בעבר שימשו את fractionation של מגוון התאית בתאים ברקמות שונות6,7. עם זאת, שמירה על מרקם של מעברי צבע רציף לעתים קרובות משימה קשה. פרוטוקולים דומה המבוסס על פירוק רציפים של ממברנות תוארו קודם לכן אבל הם בדרך כלל צריך יותר משני מאגרי, הידיים בזמן הוא עוד8 .
כאשר fractionating דגימות רקמה, לזכור את הרקמה הזאת דגימות נוכח תא התא, התא-מטריקס אינטראקציות כי הן לא נוכח בתאים בתרבית חשוב בעת הליך שאיבת חלבון. פירוט נאותה בין תאים מטריצה חוץ-תאית מבלי להשפיע על איכות החלבון יהיה גורם קריטי ב בידוד חלבון9רקמת המעי. ב פרוטוקול זה, אנשי קשר תא התא, התא-מטריקס הם קודם שבור, משחררים את התאים ומאפשר את המאגר להגיע אל התאים הבודדים. כדי למנוע ערבוב לפני fractionation חלבון-תא, פירוט של אנשי הקשר להתרחש מבלי לשנות את התקינות של התאים או את הקרומים גרעיני.
בשל העשרת של פרוטאזות שונים רירית המעי10, חשוב לשלוט השפלה חלבון במהלך החילוץ. כדי למזער את ההשפלה חלבון פוטנציאליים, מעכבי פרוטאז מרובים חייבים להיכלל במאגרי מיצוי חלבונים. בנוסף, אם תמציות עומדים לשמש עבור מבחני פונקציונלי, זה חיוני כדי למנוע את דנטורציה של חלבונים או proteolysis כמו זה יגרום לאובדן חלבון פעילות11. למטרה זו, הפרוטוקול מבוצע ב 4 ° C, phenylmethylsulfonyl טריים פלואוריד (PMSF) מתווסף המאגרים-ריכוז סופי של 0.1 מ מ רק לפני השימוש כדי לעכב עוד יותר proteolysis.
הצעד הראשון תא fractionation הוא שיבוש רקמות פירוק התא. כאמור, המטרה היא disaggregate את התאים ואת לשבור שאותם לפתוח במינימום נזקים. דגימות רקמה מעיים חייבת להיות הומוגני, התאים lysed כדי להשיג שבירה המרבי של קרום התא. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים במערבל שהעקב ממונע לשבור רקמת המעי אשר הוא הומוגני תוך שניות על-ידי פעולה vortexing במהירות גבוהה. לאחר המגון, תאי הרקמות מודגרת בתוך מאגר היפוטוניק יפרץ קרום התא, אך ימנע הגרעינים שלמים, ואחריו תוספת של חומר ניקוי denaturing (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) מערבולת קצר להפרדת הגרעינים מתוך השבר cytoplasmic. לאחר הסרת הציטופלסמה, קרום גרעין התא הוא פרץ לתוך מאגר hypertonic ברעידות.
השיטה המוצגת כאן היא שיטה המתאימה עבור fractionation subcellular של ביופסיות מעיים טריים וקפואים זה הושגו במהלך הליכי אנדוסקופי, נע בין 2 ו- 10 מ"ג במשקל. את הפרוטוקול היא קלה, לשחזור ואת יכולה להתבצע באמצעות מכשור מעבדתי בסיסי, ריאגנטים בתוך פחות משעה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">HEPES</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-1kg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">KCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5588886-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">DTT</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">PMSF</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Proteinase and phosphatase inhibitors</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A32959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NP-40&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CA-630</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">BCA assay</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23227</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Disposable plastic pestles</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359947-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Dounce homogeneizer</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:128px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Shacker</td>
			<td style="width:128px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">MS3 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

המטרה של פרוטוקול זה היא fractionate רקמה אנושית מעיים מתקבל על ידי אנדוסקופיה לתוך תאים גרעינית, cytoplasmic לניתוח לוקליזציה של חלבונים ספציפיים או חלבון מתחמי במדינות רקמות שונות (קרי, בריא נגד המחלה). שיטה זו שימושית עבור fractionation של שתי דגימות רקמה מעיים טריים וקפואים; זה נגיש עבור כל המעבדות לא זמן רב.

איור 1 מראה של צביעת אאוזין hematoxylin של מקטע המעי ביופסיה עם שלם villi ומבנים הקריפטה.
התוצאות נציג של fractionation גרעינית, cytoplasmic באמצעות פרוטוקול זה מוצגים נתוני 2 ו- 3. בניסוי שמוצג באיור 2, רעננה (F...

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens at JoVE.com

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע של fractionation סלולרית פשוטה לצורך הקמת מכשול ההפרדה subcellular של חלבונים cytoplasmic וגרעיני ב אנושי ביופסיות מעיים טריים וקפואים.

Fractionation subcellular של דגימות מדרכי העיכול טריים וקפואים

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

An Overview of the Gastrointestinal System: Anatomy, Physiology, and Assessment

SCIENTISTS IN ACTION

9.6K Views.  University of the Basque Country (UPV-EHU), Biocruces Health Research Institute. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע של fractionation סלולרית פשוטה לצורך הקמת מכשול ההפרדה subcellular של חלבונים cytoplasmic וגרעיני ב אנושי ביופסיות מעיים טריים וקפואים.

Video: Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. There are currently no known methods for growing M. leprae in vitro, presenting a major obstacle in the study of this pathogen in the laboratory. Therefore, the maintenance and growth of M. leprae strains are preferably performed in athymic nude mice (NU-Foxn1nu). The laboratory conditions for using mice are readily available, easy to perform, and allow standardization and development of protocols for achieving reproducible results. In the present report, we describe a simple protocol for purification of bacilli from nude mouse footpads using trypsin, which yields a suspension with minimum cell debris and with high bacterial viability index, as determined by fluorescent microscopy. A modification to the standard method for bacillary counting by Ziehl-Neelsen staining and light microscopy is also demonstrated. Additionally, we describe a protocol for freezing and thawing bacillary stocks as an alternative protocol for maintenance and storage of M. leprae strains.

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Mycobacterium leprae, the causative agent of leprosy, does not grow in vitro. We describe an easy to follow protocol to prepare a bacillary suspension to ensure the maintenance of large quantities of M. leprae for a variety of applications. Protocols for propagation by mouse footpad inoculation, evaluation of viability, freezing and thawing bacillary stock are described in detail.

פרוטוקולים אופטימליים עבור<em&gt; Leprae Mycobacterium</em&gt; ניהול הזנים: קפוא במלאי שימור ותחזוקה בעכברים בעירום athymic

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

בידוד של מקרופאג קבוצות מערכות ותאים סטרומה מתוך שריר הלב של האדם והעכבר דגימות

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...