Auteurs reconnaissent l’aide de Ander Lopez et Miren Telletxea pour l’enregistrement et le montage vidéo. ACR est financé par une bourse de Ikerbasque et un projet de recherche de Asociación de Celiacos Madrid (ACM). JRB est financé par le projet ISCIII-PI16/00258 et cofinancé par l’Union européenne FEDER/FSE « Un moyen de faire de l’Europe ». EST financé par une subvention de projet de recherche 2015111068 du département Basque de la santé. GRI et AJM sont pris en charge par des subventions de bourse prédoctorale de l’UPV/EHU et le ministère de l’éducation de Basque, respectivement.

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de Cruces University Hospital et analyses ont été effectuées après que le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets ou leurs parents.
1. biopsie Collection
Remarque : Les spécimens de biopsie du duodénum distal des patients sont obtenues au cours de l’endoscopie diagnostic systématique gérer les biopsies qui vont entre 2 et 10 mg de poids. Tissu biopsié est un tissu complex composé de différents types de cellules dont les cellules épithéliales, immunitaires et endothéliales. Gastroentérologie clinique effectuer l’endoscopie qui suit établit des lignes directrices cliniques.
<ol><li>Placer la biopsie sur un papier filtre stérile juste après l’endoscopie.</li>
	<li>Forceps permet de transférer les biopsies dans des tubes de 1,5 mL, tremper avec du PBS et placez-le dans un cryotube.</li>
	<li>Garder les tubes sur la glace jusqu'à ce qu’ils arrivent au laboratoire.<ol>
<li>Commencer le traitement des biopsies frais immédiatement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour les biopsies congelés, flash geler la biopsie contenant des tubes et conserver dans l’azote liquide jusqu'à l’utilisation. Remarque : Il est important de conserver l’échantillon congelé jusqu'à ce que le tampon complété froid 1 est ajouté.</li>
</ol>2. préparation du tampon
Remarque : Avant de commencer, compléter les tampons comme suit.
<ol><li>Ajouter 1 millimètre DTT (concentration finale) et la protéase et phosphatase inhibiteur de cocktail (1 x concentration finale) au tampon hypotonique 1 et hypertonique tampon 2 (tableau 1).<ol>
<li>Préparer le 1,5 mL de tampon 1 et 150 µL de tampon 2 par exemple. TNT n’empêchera l’oxydation des échantillons.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer des noyaux de tampon de lavage en ajoutant 1 % de détergent (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) à une concentration finale de 0,1 % au tampon déjà complétée 1. Préparer 1 mL de tampon de lavage des noyaux par exemple.</li>
</ol>3. biopsie homogénéisation
<ol><li>
Biopsies fraîches
	<ol>
<li>Placez le pilon jetable dans le mélangeur motorisé. Veiller à ce que le pilon atteint le fond du tube.</li>
		<li>Prendre la biopsie le cryotube et le placer dans un tube de 1,5 mL avec un embout de la pipette.</li>
		<li>Ajouter 200 µL de tampon complété 1 dans le tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Homogénéiser la biopsie avec le pilon jusqu'à ce que le tissu est complètement perturbé et le maintenir sur la glace.</li>
		<li>Une fois que toutes les biopsies sont homogénéisés, passez à l’étape 4. Remarque : Pilons jetables doivent être changés entre les biopsies.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biopsies congelés ATTENTION : Manipuler l’azote liquide avec soin ; contact de l’azote liquide avec la peau ou les yeux peut causer des blessures graves de congélation. Protéger les mains et les yeux toujours lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide.<ol>
<li>Prenez quelques azote liquide dans une boîte pour stocker les cryotubes provient du réservoir d’azote.</li>
		<li>Trouver la biopsie dans le réservoir d’azote et placer le cryotube dans la boîte avec l’azote liquide. Répétez cette étape pour toutes les biopsies.</li>
		<li>Transférer la biopsie de la cryotube dans un tube de 1,5 mL. Remarque : Les Biopsies seront attachés au tube congelé. Poussez la biopsie avec une pointe de pipette stérile si elle se détache du tube.</li>
		<li>Ajouter 200 µL de tampon complété 1.</li>
		<li>Homogénéiser le tissu avec le pilon et le mortier jusqu'à ce que le tissu est complètement perturbé, maintenir la température à 4 ° C tout au long de toute la procédure. Remarque : Ne pas laisser les biopsies à décongeler avant d’ajouter de la mémoire tampon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cytoplasme isolement
<ol><li>Incuber la biopsie homogénéisée sur glace pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de 1 % de détergent (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) pour chaque échantillon à une concentration finale de 0,05 %. NOTE : Les cellules seront gonflent et éclatent par lyse osmotique car la lessive va perturber la membrane cellulaire.</li>
	<li>Incuber 5 minutes sur la glace.</li>
	<li>Vortex brièvement et centrifuger à 400 x g à 4 ° c pendant 2 min.</li>
	<li>Après avoir mélangé au Vortex, éliminer le surnageant et le transférer dans un nouveau tube propre 1,5 mL ; Il s’agit de la fraction cytoplasmique. Ne jetez pas le culot.</li>
</ol>5. nucléaire isolement
<ol><li>Resuspendre le culot de l’étape précédente avec 200 µL de tampon de lavage des noyaux.</li>
	<li>Centrifuger le tube pendant 2 min à 400 x g et 4 ° C.</li>
	<li>Jeter le surnageant et répétez la procédure de nettoyage deux fois plus. Remarque : Les lavages supprimera la contamination cytoplasmique dans la fraction nucléaire.</li>
	<li>Après le troisième lavage, resuspendre le culot dans 100 µL de tampon 2.</li>
	<li>Vigoureusement l’échantillon à 4 ° c pendant 30 min. par ailleurs, incuber l’échantillon sur la glace et vortex toutes les 5 min.</li>
	<li>Après agitation, centrifuger l’échantillon pendant 10 min à la vitesse supérieure (> 12 000 x g) et 4 ° C.</li>
	<li>Après agitation, transvaser le surnageant dans un nouveau 1.5 propre. tube de mL. Il s’agit de la fraction nucléaire.</li>
</ol>6. Quantification des protéines
Remarque : Quantifier les protéines avec un kit de dosage bicinchoninic acid (BCA) protéine. La concentration des protéines dans les fractions se situe entre 0,5 et 5 µg/µL, étant plus bas dans la fraction nucléaire (voir le tableau 2 pour les concentrations de protéines résultantes de biopsies de 2 mg).
<ol><li>Préparer la courbe d’étalonnage avec le suivant de montants (µg) d’albumine sérique bovine (BSA)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>Préparer les réactifs nécessaires à l’utilisation de 100 µL de mixage final de BCA par échantillon.</li>
	<li>Pipeter 2 µL de chaque fraction de protéine dans une plaque 96 puits, ajouter le mélange de la BCA et suivez les instructions du fabricant pour la lecture.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li><li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization.">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Preedy, V. R., Watson, R. 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Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li><li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues.">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li><li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling.">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells.">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li><li>B&#246;rner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues.">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li><li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+disease:+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology.">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li><li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein purification protocols. , (2004).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bicinchoninic+Acid+(BCA)+Assay+for+Protein+Quantitation.">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li><li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations.">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li><li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease.">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ici est utilisé pour le fractionnement nucléaire et cytoplasmique des biopsies de l’intestin. Les protéines purifiées sont non dénaturés et peut être utilisés non seulement dans l’analyse par western blot comme montré dans la Figure 2 et 3 , mais aussi dans les essais nécessitant des protéines pliées natif comme immunoprécipitation, analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) ou électrophorèse en natif sur gel de polya...

Les protéines participent à presque toutes les fonctions biologiques dans une cellule et toute variation dans leur structure, la quantité ou la localisation peut conduire à un scénario de pathogène. Méthodes de fractionnement des échantillons tissulaires sont une approche utile pour réduire la complexité des maladies liées à des analyses de protéines. Certaines études utilisent des informations de localisation de protéine ou enrichissent une protéine d’un compartiment cellulaire spécifique, un protocole pour le fractionnement des protéines intactes reproductible est donc utile de répondre à certaines questions biologiques. Déterminer la localisation sous-cellulaire des protéines et la surveillance de leurs interactions à basale ou redistribution compartimentale et pathologiques permettra d’identifier les maladies liées à des différences fonctionnelles1,2. Ainsi, cette méthode vise de façon reproductible fractionner des biopsies de tissu intestinal, frais et surgelés, en compartiments subcellulaires cytoplasmiques et nucléaires.
Des échantillons de biopsie intestinale sont régulièrement obtenus au cours de l’endoscopie procédures3 (Figure 1) et peuvent être utilisés efficacement pour la quantification des protéines ou des études de l’immunoprécipitation. Étant donné que les échantillons de tissus d’intestinales épithéliales contiendra des protéines qui peuvent être directement impliqués dans la pathogenèse de la maladie4, biopsies intestinales sont une source très précieuse pour l’identification réussie des propres à la maladie intestinale protéines. Des échantillons de tissus de surgelés, patient stockée ainsi que les renseignements cliniques sont des ressources utiles pour l’analyse des protéines, et une préparation simple et reproductible est un enjeu important de fournir des informations parcellaires cellule à l’aide de montants limitatifs de surgelés tissu5.
Il existe plusieurs kits disponibles dans le commerce pour la séparation des fractions cellulaires, mais ceux-ci sont plus chers et généralement plus long que le protocole présenté ici. Protocoles basés sur la centrifugation en gradient de plusieurs étapes et des gradients continus ont également servis antérieurement pour le fractionnement des divers compartiments cellulaires dans différents tissus6,7. Cependant, maintenir l’uniformité des gradients continus est souvent une tâche difficile. Protocoles similaires basées sur la lyse séquentielle des membranes ont été décrits précédemment mais dont ils ont besoin en général de plus de deux tampons et les mains à l’heure n’est plus8 .
Lorsque des échantillons de tissus de fractionnement, garder à l’esprit que le tissu des échantillons présents cellule-cellule et cellule-matrice des interactions qui ne sont pas présentes dans les cellules cultivées et important lors de l’extraction de protéines. La ventilation correcte entre cellules et matrice extracellulaire sans affecter la qualité de la protéine sera un facteur essentiel dans le tissu intestinal protéine isolement9. Dans ce protocole, cellule-cellule et cellule-matrice de contacts sont d’abord cassés, libérant les cellules et qui permet la mémoire tampon atteindre les cellules individuelles. Pour éviter les protéines-compartiment mélangés avant le fractionnement, la rupture des contacts doit se faire sans altérer l’intégrité des cellules ou les membranes nucléaires.
En raison de l’enrichissement de diverses protéases dans la muqueuse intestinale10, il est important de contrôler la dégradation des protéines durant l’extraction. Pour minimiser la dégradation potentielle de la protéine, inhibiteur de la protéase multiples doit être inclus dans les tampons d’extraction de protéine. En outre, si des extraits vont être utilisés pour les tests fonctionnels, il est essentiel pour éviter la dénaturation des protéines ou de protéolyse, car cela provoquerait une perte de protéines activité11. À cet effet, le protocole est réalisé à 4 ° C et fluorure phénylméthylsulfonyle fraîches (PMSF) est ajouté pour les tampons à une concentration finale de 0,1 mM juste avant de les utiliser davantage inhibe la protéolyse.
La première étape de fractionnement cellulaire est désorganisation tissulaire et la lyse cellulaire. Tel que mentionné précédemment, l’objectif est de séparer les cellules et la pause que les ouvrir avec le minimum de dommages. Échantillons de tissu intestinal doivent être homogénéisés, et les cellules lysées pour atteindre maximale rupture de la membrane cellulaire. Dans ce protocole, nous utilisons un mélangeur motorisé pilon pour briser le tissu intestinal qui est homogénéisé dans secondes au moyen d’action Vortex à haute vitesse. Après homogénéisation, les cellules des tissus sont incubés dans une mémoire tampon hypotonique qui fera éclater la membrane cellulaire, mais gardera les noyaux intacts, suivie par l’ajout d’un détergent non dénaturants (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) et un court vortex pour séparer les noyaux de la fraction cytoplasmique. Après l’enlèvement du cytoplasme, la membrane du noyau cellulaire est fait irruption dans un tampon hypertonique avec agitation.
La méthode présentée ici est une méthode appropriée pour le fractionnement subcellulaire des frais et congelés des biopsies intestinales qui ont été obtenus au cours de procédures endoscopiques et comprise entre 2 et 10 mg en poids. Le protocole est simple et reproductible et pourrait être effectué à l’aide de matériel de laboratoire de base et des réactifs en moins d’une heure.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:657px;" width="658">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">HEPES</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4034-1kg</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">KCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">EDTA</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E9884-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5588886-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">DTT</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">PMSF</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Proteinase and phosphatase inhibitors</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A32959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">NP-40&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CA-630</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">BCA assay</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23227</td>
			<td>Protein quantification kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Disposable plastic pestles</td>
			<td style="width:128px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z359947-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Dounce homogeneizer</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:128px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:244px;">Shacker</td>
			<td style="width:128px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">MS3 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular fractionation from fresh and frozen gastrointestinal specimens

Le but du présent protocole est de fractionner le tissu intestinal humain obtenu par endoscopie en compartiments nucléaires et cytoplasmiques pour l’analyse de la localisation des protéines spécifiques ou complexes de protéines dans les États de différents tissus (c'est-à-dire, en bonne santé contre la maladie). Cette méthode est utile pour le fractionnement des deux échantillons de tissu intestinal frais et surgelés ; Il est facilement accessible pour tous les laboratoires et pas beaucoup de temps.

La figure 1 montre une coloration de l’hématoxyline éosine d’une section de biopsie intestinale avec villosités intactes et les structures de la crypte.
Les résultats représentatifs du fractionnement nucléaire et cytoplasmique utilisant ce protocole sont indiquées dans les Figures 2 et 3. Dans l’expérience illustré à la Figure 2<...

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Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Nous présentons ici un protocole pour effectuer un simple fractionnement cellulaire pour la séparation subcellulaire des protéines cytoplasmiques et nucléaires dans des biopsies intestinales humaines fraîches ou congelées.

Fractionnement subcellulaire de spécimens gastro-intestinal fraîches ou congelées

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

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Unit 1

An Overview of the Gastrointestinal System: Anatomy, Physiology, and Assessment

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9.6K vues.  University of the Basque Country (UPV-EHU), Biocruces Health Research Institute. Nous présentons ici un protocole pour effectuer un simple fractionnement cellulaire pour la séparation subcellulaire des protéines cytoplasmiques et nucléaires dans des biopsies intestinales humaines fraîches ou congelées.

Vidéo: Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Recherche

Immunologie et infection

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

Les analyses concurrentielles Homing d&#39;étude Gut tropisme migration des lymphocytes T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolement des ARN Pseudomonas aeruginosa La colonisation du tractus gastro-intestinal murin

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. There are currently no known methods for growing M. leprae in vitro, presenting a major obstacle in the study of this pathogen in the laboratory. Therefore, the maintenance and growth of M. leprae strains are preferably performed in athymic nude mice (NU-Foxn1nu). The laboratory conditions for using mice are readily available, easy to perform, and allow standardization and development of protocols for achieving reproducible results. In the present report, we describe a simple protocol for purification of bacilli from nude mouse footpads using trypsin, which yields a suspension with minimum cell debris and with high bacterial viability index, as determined by fluorescent microscopy. A modification to the standard method for bacillary counting by Ziehl-Neelsen staining and light microscopy is also demonstrated. Additionally, we describe a protocol for freezing and thawing bacillary stocks as an alternative protocol for maintenance and storage of M. leprae strains.

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Mycobacterium leprae, the causative agent of leprosy, does not grow in vitro. We describe an easy to follow protocol to prepare a bacillary suspension to ensure the maintenance of large quantities of M. leprae for a variety of applications. Protocols for propagation by mouse footpad inoculation, evaluation of viability, freezing and thawing bacillary stock are described in detail.

Protocoles optimisés pour<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Gestion de traction: Frozen Stock préservation et l&#39;entretien dans des souris nude athymiques

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l&#39;analyse des lymphocytes infiltrant

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Haute</sup&gt; T cellules dans des souris immunodéficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

Isolement des sous-ensembles macrophages et des cellules stromales des spécimens myocardiques humains et de souris

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...