يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا طفيلي الملاريا البشري ، P.Falciparum ، من خلال المساعدة في الكشف عن وظيفة البروتين من خلال الضربة القاضية الشرطية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لتوليد سهل نسبيا من المسوخ المشروطة بالمقارنة مع الأساليب السابقة. للبدء ، انتقل إلى Chop واختر Fasta Target'Under Target ' Under Target ، ولصق أزواج القاعدة 200 من النهاية الرئيسية الثلاثة لإطار القراءة المفتوحة للجين و200 زوج أساسي من بداية UTR الرئيسي الثلاثة للجين.
ضمن In'select P.Falciparum'وحدد CRISPR/Cas9'under Using'Next، انقر فوق البحث عن المواقع المستهدفة'حدد تسلسل GRNA من الخيارات المعروضة، مع إعطاء الأفضلية لـ GRNA الأكثر كفاءة الأقرب إلى موقع التعديل الذي يحتوي على أقل عدد من المواقع خارج الهدف. شراء تسلسل الجيش الملكي النيبالي وتكملة عكسية كما polyacrylamide هلام electrophoresis تنقية oligos. يمكن العثور على تسلسل GRNA المستخدم لاستهداف PfH-sp70x في بروتوكول النص.
أضف 40 ميكروغرام لكل من pMK-U6 و pUF1-Cas9 و PHA-GLMS DNA في أنبوب طرد مركزي معقمة 1.5 ملليمتر. إضافة عُشر حجم الحمض النووي من ثلاثة أسيتات الصوديوم الضرس في الماء إلى الأنبوب ومزجها جيدا باستخدام دوامة. ثم، إضافة 2.5 مرات من حجم الإيثانول 100 في المئة إلى الأنبوب ومزجها بشكل جيد باستخدام دوامة لمدة 30 ثانية على الأقل.
ضع الأنبوب على الجليد أو عند درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم، الطرد المركزي الأنبوب في 18، 300 مرة G لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، وإزالة بعناية عظمى من الأنبوب دون إزعاج بيليه.
إضافة ثلاثة أضعاف حجم 70 في المئة من الايثانول إلى الأنبوب ومزجها لفترة وجيزة باستخدام دوامة. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 18، 300 مرة G لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. مرة أخرى، بعناية إزالة ناظر من الأنبوب دون إزعاج بيليه.
ترك أنبوب مفتوحة والسماح بيليه للهواء الجاف لمدة 15 دقيقة. تخزين الحمض النووي المترسب في ناقص 20 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إلى transfection. إلى transfect RBCs، وإعداد 1X cytomix العازلة وكذلك غير مكتملة وكاملة RPMI كما هو موضح في بروتوكول النص.
تصفية تعقيم المخزن المؤقت باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. إضافة 380 ميكرولترات من 1X cytomix إلى الحمض النووي ودوامة إلى حل. السماح للحمض النووي أن تذوب في 1X cytomix لمدة 10 دقائق، دوامة كل ثلاث دقائق لمدة 10 ثوان.
في أنبوب مخروطي معقم يبلغ 15 ملليلتر، ادمج 300 ميكرولترات من كرات الدم الحمراء البشرية المعزولة في RPMI غير المكتمل مع أربعة ملليلترات من 1X cytomix. الطرد المركزي RBCs في 870 مرات G لمدة ثلاث دقائق. ثم إزالة المنافق من بيليه RBC.
إعادة تعليق بيليه RBC مع خليط الحمض النووي-cytomix ونقله إلى cuvette 0.2 سنتيمتر كهربائي. ابوري RBCs باستخدام الشروط المذكورة في بروتوكول النص. بعد الكهربة، نقل محتويات من cuvette إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من RPMI كاملة.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 870 مرات G لمدة ثلاث دقائق في 20 درجة مئوية. ثم، decant الماظر. الآن، إعادة تعليق بيليه في أربعة ملليلتر من دورة RPMI كاملة ونقلها إلى بئر واحد في ستة بئر لوحة الأنسجة.
إضافة 400 ميكرولترات من ثقافة schizont عالية إلى RBCs المنقولة. في اليوم التالي، وغسل الثقافة مع أربعة ملليلتر من دورة في الدقيقة كاملة.
جهاز طرد مركزي في الثقافة في 870 مرات G لمدة ثلاث دقائق. استلهموا المُنطّع. إعادة تعليق الثقافة في أربعة ملليلتر من دورة في الدقيقة كاملة.
48 ساعات في وقت لاحق، وغسل الثقافة مع أربعة ملليلتر من دورة في الدقيقة كاملة. ثم، إعادة تعليق الثقافة في دورة عمل اقة كاملة تحتوي على DSM1 ميكرومولار واحد لتحديد لSsmid Cas9. بعد هذه النقطة، استبدل الوسيطة الثقافية بمؤشر 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
استمر في غسل الثقافات كل يوم مع دورة في الدقيقة كاملة حتى لا تصبح الطفيليات مرئية عن طريق مسحة الدم. لجعل مسحة الدم، ماصة 150 ميكرولترات من الثقافة في أنبوب الطرد المركزي 0.6 ملليلتر. بعد تحشير الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1، 700 مرات G لمدة 30 ثانية، التعرق قبالة supernatant.
استخدام ماصة لنقل الخلايا بيليه إلى شريحة زجاجية. باستخدام شريحة زجاجية ثانية عقدت في زاوية 45 درجة إلى الشريحة الأولى، تشويه قطرات الدم. وصمة عار الشريحة باستخدام مجموعة من الملونات المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
عرض الطفيليات باستخدام 100 مرة هدف الغمر النفط. بداية خمسة أيام بعد transfection، إزالة ملليلترين من الثقافة مع RBCs re-suspended في الوسط الثقافة. إضافة مرة أخرى ملليلتر اثنين من المتوسطة الطازجة والدم في 2 في المئة الدم.
إضافة دم جديد في هذا الأسلوب مرة واحدة في الأسبوع حتى ظهور الطفيلي مرة أخرى، كما يحددها مسحة الدم رقيقة. تنفيذ عمليات تخفيف متسلسلة لثقافة الطفيليات لتحقيق تركيز نهائي من 0.5 طفيليات لكل 200 ميكرولتر. أضف 200 ميكرولترات من الثقافة المخففة إلى آبار لوحة زراعة الأنسجة 96 بئرًا.
الحفاظ على لوحة الاستنساخ حتى الطفيليات يمكن الكشف عنها في الآبار. كل 48 ساعة، استبدل الوسط في لوحة 96-well مع المتوسطة الطازجة. مرة واحدة في الأسبوع، بدءا من خمسة أيام بعد بدء لوحة الاستنساخ، وإزالة 100 ميكرولترات من كل بئر وإضافة 100 ميكرولترات من المتوسط الطازج بالإضافة إلى الدم.
لتحديد أي آبار تحتوي على طفيليات ، ضع لوحة 96 بئرًا بزاوية 45 درجة لمدة 20 دقيقة تقريبًا ، مما يسمح للدم بالاستقرار عند زاوية داخل اللوحة. ثم، ضع لوحة 96-جيدا على مربع الضوء. لاحظ أن الآبار التي تحتوي على الطفيليات تحتوي على وسائط صفراء اللون ، مقارنة بالوسائط الوردية للآبار الخالية من الطفيليات ، بسبب تحمض الوسيط من قبل الطفيليات.
باستخدام ماصة المصلية ، نقل محتويات الآبار المحتوية على الطفيليات إلى لوحة زراعة الأنسجة ذات 24 بئرًا للسماح بتوسيع دم الطفيلي. باستخدام تحليل PCR، تحقق من هذه الخطوط الطفيلية النيورية للتكامل الصحيح. تظهر نتائج فحص الفلورة المناعية هنا، مما يدل على علامات HA بنجاح من PfH-sp70x.
تم إصلاح بطفيليات PFH-sp70x glmS وملطخة بـ DAPI كعلامة نواة ، وكذلك الأجسام المضادة لـ HA. الغشاء المرتبطة الهستيدين الغنية البروتين واحد، علامة على تصدير البروتين إلى RBC المضيف. يظهر هنا تحليل لطخة غربية لمستوى البروتين PFH-sp70x بعد العلاج بالغلوزامين. كما هو متوقع، ينخفض مستوى البروتين خلال مدة العلاج.
هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين في مجال الطفيليات للتحقيق في المسائل الأساسية في بيولوجيا طفيليات الملاريا. من المهم أن نتذكر أن P.Falciparum هو مسبب الأمراض المنقولة بالدم وينبغي ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
