Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биологии человека малярийного паразита, P.Falciparum, помогая раскрыть функцию белка через условный нокдаун. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет относительно легкое поколение условных мутантов по сравнению с предыдущими методами. Для начала перейдите на Chop Chop и выберите Fasta Target'Under Target, вставьте 200 базовых пар из трех основных конце открытого считываемого кадра гена и 200 базовых пар с самого начала трех основных UTR гена.
В соответствии с In'select P.Falciparum'and выберите CRISPR/Cas9'under Using'Next, нажмите Найти целевые сайты'Выберите последовательность gRNA из представленных вариантов, отдавая предпочтение наиболее эффективной гРНК, которая находится ближе всего к месту модификации и которая имеет несколько внецелеховых сайтов. Приобретете последовательность гРНК и ее обратное дополнение в качестве полиакриламинида гель электрофореза очищенных олиго. Последовательность gRNA, используемая для таргетинга pfH-sp70x, содержится в текстовом протоколе.
Добавьте 40 микрограммов каждый из pMK-U6, pUF1-Cas9 и pHA-glmS DNA в стерильную 1,5-миллиметровую центрифугу. Добавьте одну десятую объема ДНК трех ацетатов молярного натрия в воду в трубку и хорошо перемешайте с помощью вихря. Затем добавьте в трубку в 2,5 раза объем 100-процентного этанола и хорошо перемешайте его с помощью вихря в течение по крайней мере 30 секунд.
Поместите трубку на лед или при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Затем центрифуга трубки на 18, 300 раз G в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию. После центрифугации, тщательно удалить супернатант из трубки, не нарушая гранулы.
Добавьте в трубку в три раза больше 70-процентного этанола и смешайте его с помощью вихря. Центрифуга трубки при 18, 300 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Опять же, осторожно удалить супернатант из трубки, не нарушая гранулы.
Оставьте трубку открытой и дайте грануле высохнуть в течение 15 минут. Храните осажденную ДНК при температуре минус 20 градусов по Цельсию, пока она не необходима для трансфекции. Чтобы заразить РБК, подготовь 1X цитомикс буфер, а также неполный и полный RPMI, как описано в текстовом протоколе.
Фильтр стерилизовать буфер с помощью фильтра 0,22 микрона. Добавьте 380 микролитров цитомикса 1X в ДНК и вихрь, чтобы раствориться. Разрешить ДНК растворяться в 1X cytomix в течение 10 минут, вихри каждые три минуты в течение 10 секунд.
В стерильной, 15 миллилитровой конической трубке, объединить 300 микролитров изолированных человеческих RBCs в неполной RPMI с четырьмя миллилитров 1X cytomix. Центрифуга РБК в 870 раз G в течение трех минут. Затем удалите супернатант из гранулы РБК.
Повторно приостанавливайте гранулы РБК смесью ДНК-цитомикс и перенесите ее на 0,2-сантиметровый кювет электропорации. Порист РБК, используя условия, перечисленные в текстовом протоколе. После электропорации перенесите содержимое из кювета в 15 миллилитровую коническую трубку, содержащую пять миллилитров полного RPMI.
Центрифуга трубки при 870 раз G в течение трех минут при 20 градусах по Цельсию. Затем, decant супернатант. Теперь, повторно приостановить гранулы в четыре миллилитров полного RPMI и передачи в один колодец в шесть хорошо ткани культуры пластины.
Добавить 400 микролитров высокой культуры шизонта в переданных RBCs. Поддержание всех культур на 37 градусов по Цельсию под три процента кислорода, три процента CO2, и 94 процентов азота. На следующий день, мыть культуру с четырьмя миллилитров полного RPMI.
Центрифуга культуры на 870 раз G в течение трех минут. Аспирировать супернатанта. Повторно приостановить культуру в четыре миллилитров полного RPMI.
48 часов спустя, мыть культуру с четырьмя миллилитров полного RPMI. Затем повторно приостанавливать культуру в полном RPMI, содержащий один микромолейный DSM1, чтобы выбрать для плазмиды Cas9. После этого момента, заменить культуру среды со свежим полным RPMI плюс один микромоляной DSM1 каждые 48 часов.
Продолжайте мыть культур каждый день с полным RPMI до тех пор, пока паразиты больше не видны мазок крови. Чтобы сделать мазок крови, пипетка 150 микролитров культуры в 0,6 миллилитров центрифуги трубки. После гранулирования клеток центрифугой в 1700 раз G в течение 30 секунд, аспирировать от супернатанта.
Используйте пипетку для переноса гранулированную клетку на стеклянную горку. Используя второй стеклянный слайд, удерживаемый под углом 45 градусов к первому слайду, мазок капли крови. Пятно слайд с помощью коммерчески доступных окрашивания комплект в соответствии с протоколом производителя.
Просмотр паразитов с помощью 100 раз нефти погружения цели. Начиная с пяти дней после трансфекции, удалите два миллилитров культуры с РБК повторно приостановлено в среде культуры. Добавить обратно два миллилитров свежей среды и крови на два процента гематокрита.
Добавляйте свежую кровь таким образом один раз в неделю, пока паразит не появится снова, как это определено тонким мазком крови. Выполните серийные разбавления культуры паразитов для достижения окончательной концентрации 0,5 паразитов на 200 микролитров. Добавьте 200 микролитров разбавленной культуры в колодцы пластины культуры тканей 96 скважин.
Поддерживайте клонирование пластины до тех пор, пока паразиты не будут обнаружены в колодцах. Каждые 48 часов, заменить средний в 96-хорошо пластины со свежей среде. Раз в неделю, начиная с пяти дней после начала клонирования пластины, удалить 100 микролитров из каждой хорошо и добавить обратно 100 микролитров свежей среды плюс кровь.
Чтобы определить любые скважины, содержащие паразитов, поместите 96-хорошо пластины под углом 45 градусов в течение примерно 20 минут, что позволяет крови поселиться под углом внутри пластины. Затем поместите 96-хорошо пластины на световой ящик. Обратите внимание, что скважины, содержащие паразитов содержат средства массовой информации, которые желтого цвета, по сравнению с розовыми средствами без паразитов скважин, из-за подкисления среды паразитами.
Используя серологическую пипету, переместите содержимое тунеядческих колодцев в 24-хорошо ткани культуры пластины, чтобы расширение паразитов. Используя анализ ПЦР, проверьте эти линии клональных паразитов для правильной интеграции. Результаты анализа иммунофлуоресценции показаны здесь, демонстрируя успешно HA пометки PfH-sp70x.
PfH-sp70x glmS паразиты были зафиксированы и окрашены DAPI в качестве маркера ядра, а также антитела к HA. Мембран-связанный histidine богатый протеин одно, маркер экспорта протеина к хозяину РБК. Западный анализ пятно PfH-sp70x уровень белка после лечения глюкозамином показано здесь. Как и ожидалось, уровень белка снижается в течение всего срока лечения.
Этот метод прокладывает путь для исследователей в области паразитологии для изучения фундаментальных вопросов в биологии малярийного паразита. Важно помнить, что P.Falciparum является патогеном, передающихся через кровь, и соответствующее средства индивидуальной защиты следует носить во время выполнения этой процедуры.
