Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del parásito de la malaria humana, P.Falciparum, ayudando a descubrir la función proteica a través de la eliminación condicional. La principal ventaja de esta técnica es que permite una generación relativamente fácil de mutantes condicionales en comparación con los métodos anteriores. Para comenzar, ve a Chop Chop y selecciona Fasta Target'Under Target, pega los 200 pares base del extremo principal del marco de lectura abierto de un gen y 200 pares base desde el inicio de los tres UTR primos del gen.
En In'select P.Falciparum'and seleccione CRISPR/Cas9'en Using'Next, haga clic en Buscar sitios de destino'Seleccione una secuencia de GRNA de las opciones presentadas, dando preferencia al ARNN más eficiente que está más cerca del sitio de modificación y que tiene el menor número de sitios fuera de destino. Compra la secuencia de GRNA y su complemento inverso como oligos purificados de electroforesis de gel de poliacrilamida. La secuencia de GRNA utilizada para apuntar a PfH-sp70x se puede encontrar en el protocolo de texto.
Agregue 40 microgramos cada uno de ADN pMK-U6, pUF1-Cas9 y pHA-glmS en un tubo estéril de centrífuga de 1,5 milímetros. Añadir una décima parte del volumen de ADN de tres acetatos molar de sodio en agua al tubo y mezclarlo bien usando un vórtice. Luego, agregue 2,5 veces el volumen de etanol al 100 por ciento al tubo y mezcle bien usando un vórtice durante al menos 30 segundos.
Coloque el tubo sobre hielo o a menos 20 grados Centígrados durante 30 minutos. Luego, centrifuga el tubo a 18,300 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante del tubo sin alterar el pellet.
Añadir tres veces el volumen de etanol al 70 por ciento al tubo y mezclarlo brevemente usando un vórtice. Centrifugar el tubo a 18, 300 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez más, retire cuidadosamente el sobrenadante del tubo sin alterar el pellet.
Deje el tubo abierto y deje que el pellet se seque al aire durante 15 minutos. Almacene el ADN precipitado a menos 20 grados centígrados hasta que sea necesario para la transfección. Para transfecctar RBCs, prepare el búfer de citomix 1X, así como la RPMI incompleta y completa como se describe en el protocolo de texto.
El filtro esteriliza el búfer con un filtro de 0,22 micras. Añadir 380 microlitros de la citomix 1X al ADN y vórtice para disolver. Deje que el ADN se disuelva en la citomix 1X durante 10 minutos, vórtice cada tres minutos durante 10 segundos.
En un tubo cónico estéril de 15 mililitros, combine 300 microlitros de glóbulos rojos humanos aislados en la RPMI incompleta con cuatro mililitros de 1X citomix. Centrifugar los RBC a 870 veces G durante tres minutos. A continuación, retire el sobrenadante del pellet RBC.
Vuelva a suspender el pellet RBC con la mezcla DNA-cytomix y transfiéralo a una cubeta de electroporación de 0,2 centímetros. Porte los RBC utilizando las condiciones enumeradas en el protocolo de texto. Después de la electroporación, transfiera el contenido de la cubeta a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de RPMI completa.
Centrifugar el tubo a 870 veces G durante tres minutos a 20 grados centígrados. Entonces, decantar al sobrenadante. Ahora, vuelva a suspender el pellet en cuatro mililitros de RPMI completo y transfiera a un pozo en una placa de cultivo de tejido de seis pozos.
Añadir 400 microlitros de un alto cultivo esquizonte a los glóbulos rojos transferidos. Al día siguiente, lave el cultivo con cuatro mililitros de RPMI completa.
Centrifugar la cultura a 870 veces G durante tres minutos. Aspirar al sobrenadante. Re-suspenda el cultivo en cuatro mililitros de RPMI completa.
48 horas más tarde, lavar el cultivo con cuatro mililitros de RPMI completa. A continuación, vuelva a suspender el cultivo en RPMI completa que contiene un DSM1 micromolar para seleccionar para el plásmido Cas9. Después de este punto, sustituya el medio de cultivo por RPMI completa fresca más un DSM1 micromolar cada 48 horas.
Continúe lavando los cultivos cada día con RPMI completa hasta que los parásitos ya no sean visibles por un frotis de sangre. Para hacer un frotis de sangre, pipetee 150 microlitros de cultivo en un tubo centrífugo de 0,6 mililitros. Después de peletizar las células por centrifugación a 1.700 veces G durante 30 segundos, aspirar del sobrenadante.
Utilice una pipeta para transferir las células peletadas a un portaobjetos de vidrio. Usando una segunda diapositiva de vidrio sostenida en un ángulo de 45 grados con respecto a la primera diapositiva, frote la gota de sangre. Manche la diapositiva utilizando un kit de tinción disponible comercialmente de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Vea los parásitos utilizando 100 veces el objetivo de inmersión en aceite. A partir de cinco días después de la transfección, retire dos mililitros de la cultura con RBC re-suspendido en el medio de cultivo. Agregue dos mililitros de medio fresco y sangre al dos por ciento de hematocrito.
Agregue sangre fresca de esta manera una vez a la semana hasta que reaparezca el parásito, según lo determinado por un frotis de sangre delgada. Realizar diluciones en serie del cultivo de parásitos para lograr una concentración final de 0,5 parásitos por cada 200 microlitros. Añadir 200 microlitros del cultivo diluido a los pozos de una placa de cultivo de tejido de 96 pozos.
Mantenga la placa de clonación hasta que los parásitos sean detectables en los pozos. Cada 48 horas, sustituya el medio de la placa de 96 pozos por un medio fresco. Una vez a la semana, a partir de cinco días después de comenzar la placa de clonación, retire 100 microlitros de cada pozo y agregue de nuevo 100 microlitros de medio fresco más sangre.
Para identificar los pozos que contengan parásitos, coloque la placa de 96 pozos en un ángulo de 45 grados durante aproximadamente 20 minutos, permitiendo que la sangre se asiente en un ángulo dentro de la placa. A continuación, coloque la placa de 96 pozos en una caja de luz. Observe que los pozos que contienen parásitos contienen medios de color amarillo, en comparación con los medios rosados de los pozos libres de parásitos, debido a la acidificación del medio por los parásitos.
Usando una pipeta serológica, mueva el contenido de los pozos que contienen parásitos a una placa de cultivo de tejido de 24 pozos para permitir la expansión de la parasitemia. Usando el análisis de PCR, compruebe estas líneas de parásitos clonales para la integración correcta. Los resultados de un ensayo de inmunofluorescencia se muestran aquí, demostrando el etiquetado HA con éxito de PfH-sp70x.
Los parásitos pfH-sp70x glmS fueron fijos y manchados con DAPI como marcador del núcleo, así como anticuerpos contra la HA. Proteína rica en histidina asociada a la membrana, un marcador de exportación de proteínas al huésped RBC. Aquí se muestra un análisis de Western Blot del nivel de proteína PfH-sp70x después del tratamiento con glucosamina. Como era de esperar, el nivel de proteína disminuye durante la duración del tratamiento.
Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la parasitología investiguen cuestiones fundamentales en la biología del parásito de la malaria. Es importante recordar que P.Falciparum es un patógeno transmitido por la sangre y se debe usar un equipo de protección personal adecuado durante la realización de este procedimiento.
