שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של טפיל המלריה האנושי, P.Falciparum, על ידי עוזר לחשוף את תפקוד החלבון באמצעות הפלה מותנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ייצור קל יחסית של מוטנטים מותנים בהשוואה לשיטות קודמות. כדי להתחיל, עבור אל צ'ופ צ'ופ ובחר Fasta Target'Under Target, הדבק את 200 זוגות הבסיס משלושת החלקים הראשונים של מסגרת הקריאה הפתוחה של גן ו-200 זוגות בסיס מתחילת שלושת ה- UTR העיקריים של הגן.
תחת In'select P.Falciparum' ובחר CRISPR/Cas9'under באמצעות'הבא', לחץ על חפש אתרי יעד'בחר רצף gRNA מהאפשרויות המוצגות, תוך מתן עדיפות ל- gRNA היעיל ביותר הקרוב ביותר לאתר השינוי ויש לו את האתרים הכי מעט מחוץ ליעד. לרכוש את רצף gRNA ואת המשלים ההפוך שלה כמו אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד מטוהר אוליגוס. רצף gRNA המשמש למטרה PfH-sp70x ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט.
הוסיפו 40 מיקרוגרם כל אחד מדנ"א pMK-U6, pUF1-Cas9 ו-pHA-glmS לצינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מילימטר. מוסיפים עשירית מנפח הדנ"א של שלושה נתרן אצטט טוחן במים לצינור ומערבבים אותו היטב באמצעות מערבולת. לאחר מכן, להוסיף 2.5 פעמים את הנפח של 100 אחוז אתנול לצינור ומערבבים אותו היטב באמצעות מערבולת לפחות 30 שניות.
מניחים את הצינור על קרח או במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור ב 18, 300 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant מהצינור מבלי להפריע גלולה.
מוסיפים פי שלושה מהנפח של 70 אחוז אתנול לצינור ומערבבים אותו בקצרה באמצעות מערבולת. צנטריפוגה הצינור ב 18, 300 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שוב, בזהירות להסיר את supernatant מהצינור מבלי להפריע גלולה.
השאירו את הצינור פתוח ואפשרו לכדור להתייבש במשך 15 דקות. לאחסן את ה-DNA זירז במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהוא נחוץ עבור transfection. כדי לבצע חילוף של RBCs, הכן מאגר ציטומיקס 1X וכן RPMI לא שלם ומלא כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
המסנן מעקר את המאגר באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. הוסף 380 מיקרוליטרים של ציטומיקס 1X ל- DNA ומערבולת להתמוסס. אפשר לדנ"א להתמוסס בציטומיקס 1X במשך 10 דקות, מערבולת כל שלוש דקות במשך 10 שניות.
בצינור חרוט סטרילי, 15 מיליליטר, לשלב 300 microliters של RBCs אנושי מבודד RPMI שלם עם ארבעה מיליליטר של ציטומיקס 1X. צנטריפוגה RBCs ב 870 פעמים G במשך שלוש דקות. לאחר מכן הסר את העל-טבעי מהכדור של RBC.
להשעות מחדש את גלולת RBC עם תערובת DNA-cytomix ולהעביר אותו 0.2 ס"מ אלקטרופולציה cuvette. חטט ב- RBCs באמצעות התנאים המפורטים בפרוטוקול הטקסט. לאחר אלקטרופורציה, להעביר את התוכן מן cuvette לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של RPMI מלא.
צנטריפוגה הצינור ב 870 פעמים G במשך שלוש דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תכרית את העל-טבעי. עכשיו, להשעות מחדש את גלולה בארבעה מיליליטר של RPMI להשלים ולהעביר ל באר אחת בצלחת תרבות רקמות שש בארות.
הוסף 400 microliters של תרבות schizont גבוהה RBCs שהועברו. לשמור על כל התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס תחת שלושה אחוז חמצן, שלושה אחוז CO2, ו 94 אחוז חנקן. למחרת, לשטוף את התרבות עם ארבעה מיליליטר של RPMI מלא.
צנטריפוגה התרבות ב 870 פעמים G במשך שלוש דקות. שאף את העל-טבעי. להשעות מחדש את התרבות בארבעה מיליליטר של RPMI מלא.
48 שעות מאוחר יותר, לשטוף את התרבות עם ארבעה מיליליטר של RPMI מלא. לאחר מכן, השהה מחדש את התרבות ב- RPMI מלא המכיל DSM1 מיקרומולארי אחד כדי לבחור עבור פלסמיד Cas9. לאחר נקודה זו, החלף את מדיום התרבות עם RPMI שלם טרי בתוספת DSM1 micromolar אחד כל 48 שעות.
המשך לשטוף את התרבויות כל יום עם RPMI מלא עד טפילים אינם נראים עוד על ידי מריחת דם. כדי להפוך את כתם דם, פיפטה 150 microliters של תרבות לתוך צינור צנטריפוגה 0.6 מיליליטר. לאחר pelleting את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1, 700 פעמים G במשך 30 שניות, שאף את העל טבעי.
השתמש פיפטה כדי להעביר את התאים גלולה לשקופית זכוכית. באמצעות מגלשת זכוכית שנייה המוחזקת בזווית של 45 מעלות למגלשה הראשונה, מורחים את טיפת הדם. הכתם את השקופית באמצעות ערכת כתמים מסחרית זמינה בהתאם לפרוטוקול היצרן.
הצג את הטפילים באמצעות 100 פעמים מטרת טבילת שמן. החל מחמישה ימים לאחר transfection, להסיר שני מיליליטר של התרבות עם RBCs מושעה מחדש במדיום התרבות. מוסיפים בחזרה שני מיליליטר של מדיום טרי ודם בשני אחוז המטוקריט.
מוסיפים דם טרי באופן זה פעם בשבוע עד שהטפיל מופיע שוב, כפי שנקבע על ידי מריחת דם דקה. בצע דילול סדרתי של תרבות הטפילים כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 טפילים לכל 200 מיקרוליטרים. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של התרבות המדולללת ל בארות של צלחת תרבות רקמות בת 96 בארות.
שומרים על צלחת השיבוט עד שניתן לזהות טפילים בארות. כל 48 שעות, החלף את המדיום בצלחת 96 היטב עם בינוני טרי. פעם בשבוע, החל מחמישה ימים לאחר תחילת צלחת השיבוט, להסיר 100 microliters מכל באר ולהוסיף בחזרה 100 microliters של מדיום טרי בתוספת דם.
כדי לזהות בארות המכילות טפילים, מניחים את צלחת 96 באר בזווית של 45 מעלות במשך כ 20 דקות, המאפשר לדם להתיישב בזווית בתוך הצלחת. לאחר מכן, מניחים את צלחת 96 באר על תיבת אור. שים לב כי בארות המכילות טפילים מכילים מדיה כי הוא צהוב בצבע, לעומת התקשורת הוורודה של בארות ללא טפילים, בשל חומציות של המדיום על ידי הטפילים.
באמצעות פיפטה סרולוגית, להעביר את התוכן של בארות המכילות טפילים לצלחת תרבות רקמות 24 באר כדי לאפשר הרחבה של הטפיל. באמצעות ניתוח PCR, לבדוק אלה קווי טפיל שיבוט לשילוב נכון. התוצאות של בדיקה immunofluorescence מוצגים כאן, המדגים את התיוג HA בהצלחה של PfH-sp70x.
טפילי PfH-sp70x glmS תוקנו והוכתמו ב-DAPI כסמן גרעין, כמו גם נוגדנים ל-HA. חלבון עשיר בהיסטידין הקשור לממברנה אחד, סמן של ייצוא חלבונים ל- RBC המארח. ניתוח כתם מערבי של רמת החלבון PfH-sp70x לאחר הטיפול עם גלוקוזאמין מוצג כאן. כצפוי, רמת החלבון יורדת במהלך הטיפול.
טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הטפיל לחקור שאלות בסיסיות בביולוגיה של טפיל המלריה. חשוב לזכור כי P.Falciparum הוא פתוגן המועבר בדם וציוד מגן אישי מתאים צריך להיות משוחק בעת ביצוע הליך זה.
