이 방법은 조건부 녹다운을 통해 단백질 기능을 발견하는 것을 도움으로써 인간 말라리아 기생충, P.Falciparum의 생물학에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이전 방법에 비해 조건부 돌연변이의 비교적 쉬운 생성을 허용한다는 것입니다. 시작하려면, 잘라 잘라 내고 Fasta Target'Under Target'Under Target을 선택하고 유전자의 열린 판독 프레임의 3개의 프라임 엔드에서 200개의 기본 쌍을 붙여넣으며 유전자의 3가지 주요 UTR의 시작부터 200개의 기본 쌍을 붙여넣습니다.
In'select P.Falciparum'에서 '다음 사용'에서 CRISPR/Cas9'를 선택하면 대상 사이트 찾기를 클릭'표시옵션에서 gRNA 시퀀스를 선택하여 수정 사이트에 가장 가깝고 대상 사이트가 가장 적은 gRNA를 선호합니다. gRNA 서열과 폴리아크릴아미드 젤 전기포고정제로 그 역보체를 구입한다. PfH-sp70x를 대상으로 하는 데 사용되는 gRNA 서열은 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있다.
pMK-U6, pUF1-Cas9 및 pHA-glmS DNA 각각 40마이크로그램을 멸균 1.5mm 원심분리기 튜브에 추가합니다. 3개의 어금니 나트륨 아세테이트의 DNA 부피의 1/10을 물에 넣고 소용돌이를 사용하여 잘 섞습니다. 그런 다음 튜브에 100% 에탄올의 2.5배의 부피를 추가하고 적어도 30초 동안 소용돌이를 사용하여 잘 섞는다.
튜브를 얼음 위에 놓거나 영하 20도에서 30분 동안 보관하십시오. 그런 다음, 4섭씨에서 30분 동안 18, 300회 G에서 튜브를 원심분리합니다. 원심 분리에 따라 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
튜브에 70%의 에탄올 의 3배를 넣고 소용돌이를 사용하여 짧게 섞습니다. 18, 300회 G에서 튜브를 섭씨 4도에서 30분간 원심분리합니다. 다시 말하지만, 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
튜브를 열어 놓고 펠릿이 15분 동안 건조하게 됩니다. 침전된 DNA를 섭씨 영하 20도에서 섭씨 로 저장하여 감염에 필요할 때까지 보관하십시오. RPC를 변환하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 1X 사이토믹스 버퍼뿐만 아니라 불완전하고 완전한 RPMI를 준비합니다.
필터는 0.22 미크론 필터를 사용하여 버퍼를 살균합니다. 1X 사이토믹스의 마이크로리터 380을 DNA와 소용돌이에 추가하여 용해합니다. DNA가 1X 사이토믹스에 10분 동안 용해되도록 하고, 10초 동안 3분마다 소용돌이를 피합니다.
멸균, 15 밀리리터 원칼 튜브, 결합 300 불완전한 RPMI에 고립 된 인간 RPC의 마이크로 리터 와 1X 사이토 믹스의 4 밀리리터. 3분 동안 870배 G로 RBC원심분리. 그런 다음 RBC 펠릿에서 상체를 제거합니다.
DNA-사이토믹스 혼합물로 RBC 펠릿을 다시 중단하고 0.2센티미터 의 전기 기공 큐벳으로 옮춥니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 조건을 사용하여 RBC를 porate합니다. 전기화 후, 쿠벳에서 완전한 RPMI의 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원추형 튜브로 내용을 전송합니다.
20°C에서 3분간 870회 G로 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음, 상체를 decant. 지금, 완전한 RPMI의 4 밀리리터에 있는 펠릿을 다시 중단하고 6 웰 조직 배양 판에 있는 1개로 잘 전송합니다.
전송된 RCC에 높은 치존 배양의 400 마이크로리터를 추가합니다. 다음 날, 완전한 RPMI의 네 밀리리터로 문화를 씻어.
3 분 동안 870 배 G에서 문화를 원심 분리합니다. 상체를 흡인합니다. 완전한 RPMI의 4 밀리리터에서 문화를 다시 중단합니다.
48시간 후, 완전한 RPMI의 4밀리리터로 문화를 씻어내라. 그런 다음, Cas9 플라스미드에 대해 선택하기 위해 하나의 마이크로몰러 DSM1을 포함하는 완전한 RPMI에서 배양을 다시 중단한다. 이 시점 이후에는 배양 매체를 48시간마다 신선한 완전 RPMI와 1개의 마이크로몰러 DSM1로 교체하십시오.
기생충이 더 이상 혈액 얼룩에 의해 보이지 않는 때까지 완전한 RPMI로 매일 문화를 세척하십시오. 혈액 얼룩을 만들기 위해, 파이펫 150 마이크로 리터 의 배양에 0.6 밀리 리터 원심 분리튜브. 30초 동안 1, 700회 G에서 원심분리로 세포를 펠릿화한 후, 상류체를 흡인시한다.
파이펫을 사용하여 펠릿 셀을 유리 슬라이드로 옮기십시오. 첫 번째 슬라이드에 45도 각도로 유지되는 두 번째 유리 슬라이드를 사용하여 혈액 방울을 얼룩지게합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 염색 키트를 사용하여 슬라이드를 염색합니다.
100배의 오일 침수 목표를 사용하여 기생충을 볼 수 있습니다. 5일 간의 전환 후, 배양 배지에서 다시 중단된 RBC를 통해 문화의 2밀리리터를 제거합니다. 2%의 헤마토크릿에 신선한 배지와 혈액의 2밀리리터를 다시 넣습니다.
기생충이 다시 나타날 때까지 일주일에 한 번이 방식으로 신선한 혈액을 추가, 얇은 혈액 얼룩에 의해 결정. 기생충 문화의 연쇄 희석을 수행하여 200 마이크로리터 당 0.5 기생충의 최종 농도를 달성하십시오. 희석 된 배양의 마이크로 리터 200을 96 웰 조직 배양 판의 우물에 추가하십시오.
기생충이 우물에서 검출될 때까지 복제 플레이트를 유지하십시오. 매 48 시간, 신선한 매체와 96 잘 접시에 매체를 교체합니다. 복제 플레이트를 시작한 후 5일 후에 일주일에 한 번 각 우물에서 100마이크로리터를 제거하고 신선한 배지와 혈액 100마이크로리터를 다시 추가합니다.
기생충을 포함하는 모든 우물을 확인하기 위해, 혈액이 플레이트 내의 각도로 정착 할 수 있도록 약 20 분 동안 45도 각도로 96 웰 플레이트를 배치합니다. 그런 다음 96웰 플레이트를 라이트 박스에 놓습니다. 기생충을 함유한 우물에는 기생충에 의한 배지의 산성화로 인해 기생충이 없는 우물의 분홍색 매체에 비해 색으로 황색인 배지가 포함되어 있습니다.
혈청 경피를 사용하여 기생충 함유 우물의 내용을 기생충의 팽창을 허용하기 위해 24웰 조직 배양 판으로 이동합니다. PCR 분석을 사용하여 이러한 클로날 기생충 라인을 확인하여 올바른 통합을 확인하십시오. 면역 형광 분석의 결과는 PfH-sp70x의 성공적인 HA 태깅을 보여주는 여기에서 표시됩니다.
PfH-sp70x glmS 기생충은 HA에 대한 항체뿐만 아니라 핵 마커로서 DAPI로 고정및 염색되었다. 멤브레인-관련 히스티딘 풍부한 단백질 하나, 숙주 RBC에 단백질 수출의 마커. 글루코사민으로 치료한 후 PfH-sp70x 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석이 여기에 나와 있다. 예상대로, 단백질 수준은 치료 기간 동안 감소합니다.
이 기술은 말라리아 기생충의 생물학에 있는 근본적인 질문을 조사하기 위하여 기생충학의 필드에 있는 연구원을 위한 쪽을 포장합니다. P.Falciparum은 혈액 매개 병원체이며 이 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용해야한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
