Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na biologia do parasita da malária humana, P.Falciparum, ajudando a descobrir a função proteica através de knockdown condicional. A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma geração relativamente fácil de mutantes condicionales em comparação com os métodos anteriores. Para começar, vá para Chop Chop e selecione Fasta Target'Under Target, cole os 200 pares de base a partir da extremidade inicial do quadro de leitura aberto de um gene e 200 pares de base desde o início dos três principais UTR do gene.
Em 'Select P.Falciparum'and select CRISPR/Cas9'under Using'Next, clique em Encontrar sites de destino'Selecionar uma sequência de gRNA das opções apresentadas, dando preferência ao gRNA mais eficiente que está mais próximo do site de modificação e que tem o menor número de sites fora do alvo. Compre a sequência de gRNA e seu complemento reverso como eletroforese de gel de poliacrilamida purificada oligos. A sequência de gRNA usada para atingir o PfH-sp70x pode ser encontrada no protocolo de texto.
Adicione 40 microgramas cada um de pMK-U6, pUF1-Cas9 e DNA pHA-glmS em um tubo de centrífugo estéril de 1,5 milímetros. Adicione um décimo do volume de DNA de três acetato de sódio molar na água ao tubo e misture-o bem usando um vórtice. Em seguida, adicione 2,5 vezes o volume de 100% de etanol ao tubo e misture-o bem usando um vórtice por pelo menos 30 segundos.
Coloque o tubo no gelo ou a menos 20 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, centrifugar o tubo a 18,300 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenante do tubo sem perturbar a pelota.
Adicione três vezes o volume de 70% de etanol ao tubo e misture-o brevemente usando um vórtice. Centrifugar o tubo a 18,300 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Novamente, remova cuidadosamente o supernatante do tubo sem perturbar a pelota.
Deixe o tubo aberto e deixe a pelota secar por 15 minutos. Armazene o DNA precipitado a menos 20 graus Celsius até que seja necessário para transfecção. Para transfectar RBCs, prepare o buffer de 1X cytomix, bem como o RPMI incompleto e completo, conforme descrito no protocolo de texto.
O filtro esteriliza o buffer usando um filtro de 0,22 míces. Adicione 380 microliters do 1X citomix ao DNA e vórtice para dissolver. Deixe o DNA dissolver-se no citomix 1X por 10 minutos, vórtice a cada três minutos por 10 segundos.
Em um tubo cônico estéril de 15 mililitros, combine 300 microliters de RBCs humanos isolados no RPMI incompleto com quatro mililitros de 1X citomix. Centrifugar os RBCs a 870 vezes G por três minutos. Em seguida, remova o supernatante da pelota RBC.
Suspenda a pelota RBC com a mistura DNA-citomix e transfira-a para um cuvette de eletroporação de 0,2 centímetros. Porate os RBCs usando as condições listadas no protocolo de texto. Após a eletroporação, transfira o conteúdo da cuvette para um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de RPMI completo.
Centrifugar o tubo a 870 vezes G por três minutos a 20 graus Celsius. Então, decantar o supernatante. Agora, suspenda a pelota em quatro mililitros de RPMI completo e transfira para um poço em uma placa de cultura de tecido de seis poços.
Adicione 400 microliters de uma cultura esquizofrênica alta às RBCs transferidas. Mantenha todas as culturas a 37 graus Celsius sob 3% de oxigênio, 3% de CO2 e 94% de nitrogênio. No dia seguinte, lave a cultura com quatro mililitros de RPMI completo.
Centrifugar a cultura a 870 vezes G por três minutos. Aspire o supernatante. Suspenda a cultura em quatro mililitros de RPMI completo.
48 horas depois, lave a cultura com quatro mililitros de RPMI completo. Em seguida, suspenda novamente a cultura em RPMI completo contendo um DSM1 micromolar para selecionar para o plasmídeo Cas9. Após este ponto, substitua o meio de cultura por RPMI completo fresco mais um DSM1 micromolar a cada 48 horas.
Continue lavando as culturas todos os dias com RPMI completo até que os parasitas não sejam mais visíveis pela mancha de sangue. Para fazer uma mancha de sangue, pipeta 150 microliters de cultura em um tubo centrífuga de 0,6 mililitro. Depois de pelotizar as células por centrifugação a 1.700 vezes G por 30 segundos, aspire fora do supernante.
Use uma pipeta para transferir as células pelotas para um escorregador de vidro. Usando um segundo deslizamento de vidro mantido em um ângulo de 45 graus até o primeiro slide, borrue a gota de sangue. Manche o slide usando um kit de coloração comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.
Veja os parasitas usando o objetivo de imersão 100 vezes no óleo. Começando cinco dias após a transfecção, remova dois mililitros da cultura com RBCs restamsuados no meio da cultura. Adicione dois mililitros de meio fresco e sangue a 2% de hematócrito.
Adicione sangue fresco desta maneira uma vez por semana até que o parasita reapareça, como determinado pela mancha de sangue fina. Realizar diluições seriais da cultura parasita para alcançar uma concentração final de 0,5 parasitas por 200 microliters. Adicione 200 microliters da cultura diluída aos poços de uma placa de cultura tecidual de 96 poços.
Mantenha a placa de clonagem até que os parasitas sejam detectáveis nos poços. A cada 48 horas, substitua o meio na placa de 96 poços por meio fresco. Uma vez por semana, começando cinco dias após o início da placa de clonagem, remova 100 microliters de cada poço e adicione de volta 100 microliters de meio fresco mais sangue.
Para identificar quaisquer poços que contenham parasitas, coloque a placa de 96 poços em um ângulo de 45 graus por aproximadamente 20 minutos, permitindo que o sangue se acomode em um ângulo dentro da placa. Em seguida, coloque a placa de 96 poços em uma caixa de luz. Observe que os poços contendo parasitas contêm mídia de cor amarela, em comparação com a mídia rosa de poços livres de parasitas, devido à acidificação do meio pelos parasitas.
Usando uma pipeta sorológica, mova o conteúdo dos poços contendo parasitas para uma placa de cultura tecidual de 24 poços para permitir a expansão da parasitamia. Usando a análise pcr, verifique estas linhas de parasitas clonais para uma integração correta. Os resultados de um ensaio de imunofluorescência são mostrados aqui, demonstrando a marcação HA com sucesso de PfH-sp70x.
Os parasitas pfH-sp70x glmS foram fixados e manchados com DAPI como marcador de núcleo, bem como anticorpos para HA. Proteína rica em histidina associada à membrana, um marcador de exportação de proteínas para o hospedeiro RBC. Uma análise de Western Blot do nível de proteína PfH-sp70x após o tratamento com glucosamina é mostrada aqui. Como esperado, o nível de proteína diminui durante a duração do tratamento.
Essa técnica abre caminho para pesquisadores do campo da parasitologia investigarem questões fundamentais na biologia do parasita da malária. É importante lembrar que P.Falciparum é um patógeno transmitido pelo sangue e equipamentos de proteção individual apropriados devem ser usados durante a realização deste procedimento.
