Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la biologie du parasite humain du paludisme, P.Falciparum, en aidant à découvrir la fonction protéique par knockdown conditionnel. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une génération relativement facile de mutants conditionnels par rapport aux méthodes précédentes. Pour commencer, allez à Chop Chop et sélectionnez Fasta Target’Under Target, coller les 200 paires de base à partir des trois extrémités principales de l’image de lecture ouverte d’un gène et 200 paires de base dès le début des trois UTR principaux du gène.
Sous In’select P.Falciparum’and select CRISPR/Cas9'under Using’Next, cliquez sur Trouver les sites cibles Sélectionnez une séquence d’ARN gRNA à partir des options présentées, en donnant la préférence à l’ARN gRNA le plus efficace qui est le plus proche du site de modification et qui a le moins de sites hors cible. Achetez la séquence de gRNA et son complément inverse comme électrophoresis purifiés de gel de polyacrylamide. La séquence gRNA utilisée pour cibler PfH-sp70x se trouve dans le protocole texte.
Ajouter 40 microgrammes chacun d’ADN pMK-U6, pUF1-Cas9 et pHA-glmS dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,5 millimètre. Ajouter un dixième du volume d’ADN de trois acétate de sodium molaire dans l’eau au tube et bien mélanger à l’aide d’un vortex. Ensuite, ajoutez 2,5 fois le volume d’éthanol à 100 pour cent au tube et mélangez-le bien à l’aide d’un vortex pendant au moins 30 secondes.
Placez le tube sur la glace ou à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Puis, centrifugez le tube à 18 300 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, retirer soigneusement le supernatant du tube sans déranger la pastille.
Ajouter trois fois le volume de 70 pour cent d’éthanol au tube et mélanger brièvement à l’aide d’un vortex. Centrifuger le tube à 18 300 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Encore une fois, retirez soigneusement le surnatant du tube sans déranger la pastille.
Laissez le tube ouvert et laissez la pastille sécher à l’air libre pendant 15 minutes. Conservez l’ADN précipité à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour la transfection. Pour transfect RBCs, préparer 1X tampon cytomix ainsi que incomplète et complète RPMI tel que décrit dans le protocole de texte.
Filtre stériliser le tampon à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Ajouter 380 microlitres du cytomix 1X à l’ADN et au vortex pour dissoudre. Laisser l’ADN se dissoudre dans le cytomix 1X pendant 10 minutes, vortexing toutes les trois minutes pendant 10 secondes.
Dans un tube conique stérile de 15 millilitres, combinez 300 microlitres de RBCs humains isolés dans le RPMI incomplet avec quatre millilitres de cytomix de 1X. Centrifuger les RBCs à 870 fois G pendant trois minutes. Retirez ensuite le surnatant de la pastille RBC.
Suspendre à nouveau la pastille RBC avec le mélange ADN-cytomix et la transférer dans une cuvette d’électroporation de 0,2 centimètre. Porate les RBCs en utilisant les conditions énumérées dans le protocole de texte. Après électroporation, transférer le contenu de la cuvette à un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de RPMI complet.
Centrifuger le tube à 870 fois G pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Puis, décanter le surnatant. Maintenant, suspendez la pastille en quatre millilitres de RPMI complet et transférez-la à un puits dans une plaque de culture tissulaire de six puits.
Ajouter 400 microlitres d’une culture schizont élevée aux RBCs transférés. Maintenir toutes les cultures à 37 degrés Celsius sous 3 % d’oxygène, 3 % de CO2 et 94 % d’azote. Le lendemain, lavez la culture avec quatre millilitres de RPMI complet.
Centrifuger la culture à 870 fois G pendant trois minutes. Aspirez le surnatant. Suspendre à nouveau la culture en quatre millilitres de RPMI complet.
48 heures plus tard, laver la culture avec quatre millilitres de RPMI complet. Ensuite, re-suspendre la culture en RPMI complet contenant un micromolaire DSM1 à sélectionner pour le plasmide Cas9. Après ce point, remplacez le milieu de culture par rpmi complet frais plus un micromolaire DSM1 toutes les 48 heures.
Continuez à laver les cultures chaque jour avec un RPMI complet jusqu’à ce que les parasites ne soient plus visibles par le frottis sanguin. Pour faire un frottis sanguin, pipette 150 microlitres de culture dans un tube centrifugeuse de 0,6 millilitre. Après avoir granulé les cellules par centrifugation à 1700 fois G pendant 30 secondes, aspirer le supernatant.
Utilisez une pipette pour transférer les cellules granulées sur une glissière en verre. À l’aide d’une deuxième glissière en verre maintenue à un angle de 45 degrés par rapport à la première diapositive, enduitez la gouttelette de sang. Tacher la lame à l’aide d’un kit de coloration disponible dans le commerce selon le protocole du fabricant.
Voir les parasites en utilisant 100 fois l’objectif d’immersion d’huile. À partir de cinq jours après la transfection, enlever deux millilitres de la culture avec rbcs re-suspendu dans le milieu culturel. Ajouter deux millilitres de milieu frais et le sang à deux pour cent d’hématocrit.
Ajouter le sang frais de cette façon une fois par semaine jusqu’à ce que le parasite réapparaisse, tel que déterminé par un frottis sanguin mince. Effectuer des dilutions périodiques de la culture parasitaire pour atteindre une concentration finale de 0,5 parasite par 200 microlitres. Ajouter 200 microlitres de la culture diluée aux puits d’une plaque de culture tissulaire de 96 puits.
Maintenir la plaque de clonage jusqu’à ce que les parasites soient détectables dans les puits. Toutes les 48 heures, remplacer le milieu dans l’assiette de 96 puits par un milieu frais. Une fois par semaine, à partir de cinq jours après le début de la plaque de clonage, retirer 100 microlitres de chaque puits et ajouter 100 microlitres de milieu frais plus le sang.
Pour identifier les puits contenant des parasites, placez la plaque de 96 puits à un angle de 45 degrés pendant environ 20 minutes, ce qui permet au sang de s’installer à un angle à l’intérieur de la plaque. Ensuite, placez la plaque de 96 puits sur une boîte lumineuse. Notez que les puits contenant des parasites contiennent des supports de couleur jaune, par rapport au milieu rose des puits exempts de parasites, en raison de l’acidification du milieu par les parasites.
À l’aide d’une pipette sérologique, déplacez le contenu des puits contenant des parasites vers une plaque de culture tissulaire de 24 puits pour permettre l’expansion de la parasitemie. À l’aide de l’analyse PCR, vérifiez ces lignées de parasites clonals pour une intégration correcte. Les résultats d’un essai d’immunofluorescence sont montrés ici, démontrant le marquage réussi de HA de PfH-sp70x.
Les parasites de PfH-sp70x glmS ont été fixés et tachés avec DAPI comme marqueur de noyau, aussi bien que des anticorps à HA. Protéine riche en histidine associée à la membrane, un marqueur de l’exportation de protéines vers l’hôte RBC. Une analyse occidentale de tache du niveau de protéine de PfH-sp70x après traitement avec la glucosamine est montrée ici. Comme prévu, le niveau de protéines diminue pendant la durée du traitement.
Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la parasitologie pour étudier les questions fondamentales dans la biologie du parasite du paludisme. Il est important de se rappeler que P.Falciparum est un agent pathogène transmis par le sang et que l’équipement de protection individuelle approprié doit être porté pendant l’exécution de cette procédure.
